與熒光成像技術(shù)相比較,，生物發(fā)光成像技術(shù)主要的優(yōu)勢有：

1．特異性強(qiáng),，無自發(fā)熒光

以熒光素酶作為體內(nèi)報(bào)告源的生物發(fā)光方法，是以酶和底物的特異作用而發(fā)光，特異性極強(qiáng),。動物本身沒有任何自發(fā)光,，使得生物發(fā)光具有極低的背景，極高的信噪比,。但用熒光方法時(shí),，在受到激發(fā)光激發(fā)時(shí)，生物體中皮膚,、毛發(fā)和各種組織及食物等都會產(chǎn)生熒光,，特別是被標(biāo)記的靶點(diǎn)深臧于組織內(nèi)部，需要較高能量的激發(fā)光時(shí),，也就會產(chǎn)生很強(qiáng)的背景噪音,。雖然熒光信號強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過生物發(fā)光，但極低的自發(fā)光水平使得生物發(fā)光的信噪比遠(yuǎn)高于熒光,。

2．高靈敏度

生物體內(nèi)很多物質(zhì)在受到激發(fā)光激發(fā)后,，也會發(fā)出熒光，產(chǎn)生的非特異性熒光會影響到檢測靈敏度,。特別是當(dāng)發(fā)光細(xì)胞深藏于組織內(nèi)部,，則需要較高能量的激發(fā)光源，也就會產(chǎn)生很強(qiáng)的背景噪音,。熒光成像的靈敏度最高也只能在動物體內(nèi)檢測到約10⁵細(xì)胞,，相對于生物發(fā)光在動物體內(nèi)監(jiān)測到10²數(shù)量級細(xì)胞的靈敏度要相差很多。

3. 檢測的深度

由于生物發(fā)光的靈敏度高于熒光成像,，對于需要深部成像的研究（檢測的深度在3~4cm）,，如干細(xì)胞、原位腫瘤與轉(zhuǎn)移,，自發(fā)腫瘤等,，應(yīng)用生物發(fā)光成像是最佳的選擇。

4. 精確定量

生物發(fā)光信號可以用于精確定量,，因?yàn)闊晒馑孛富蚴遣迦爰?xì)胞染色體中穩(wěn)定表達(dá)的,，單位細(xì)胞的發(fā)光數(shù)量很穩(wěn)定。即便標(biāo)記細(xì)胞在動物體內(nèi)有復(fù)雜的定位,，亦可從動物體表的信號水平直接得出發(fā)光細(xì)胞的相對數(shù)量,。而對于熒光，激發(fā)光需要穿過組織到達(dá)靶點(diǎn),，發(fā)射光需要從體內(nèi)出來,，路徑較長。信號水平取決于激發(fā)光的強(qiáng)度,、發(fā)光細(xì)胞的數(shù)量,、靶點(diǎn)的深度,、光線穿過的組織對其的吸收及散射等因素，使得熒光強(qiáng)度較難定量,。熒光成像定量需要儀器的激發(fā)光能夠保證持續(xù)長時(shí)間穩(wěn)定,，并均勻照射到動物體表。NightOWL ⅡLB 983成像系統(tǒng)通過熒光光路的特殊設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了對激發(fā)光的能量控制和調(diào)節(jié),，根據(jù)光源的大小與深淺針對性選擇合適的激發(fā)裝置,，并且采用窄波帶濾光片，提高了活體熒光成像的穩(wěn)定性和靈敏度,，并且該系統(tǒng)操作簡單、費(fèi)用低廉,、不涉及放射性,。

在活體動物可見光成像技術(shù)中，相對于生物發(fā)光成像技術(shù),，熒光成像技術(shù)的優(yōu)勢主要表現(xiàn)在：

1. 熒光染料,、蛋白標(biāo)記能力強(qiáng)

熒光標(biāo)記物種類繁多，包括熒光蛋白,、熒光分子,、量子點(diǎn)等，可以與基因,、多肽,、抗體等生物分子標(biāo)記，作為分子探針使用范圍廣,。同時(shí),，不同的熒光蛋白或染料還可對樣本進(jìn)行多重標(biāo)記，同時(shí)成像,。檢測的波長范圍從300~1100nm,，某些儀器公司還提供全光譜的濾光片實(shí)現(xiàn)幾乎所有熒光標(biāo)記的體內(nèi)成像。

2. 信號強(qiáng)度大

由于熒光是在外界光源激發(fā)下產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,，其光子強(qiáng)度較其它光學(xué)信號更強(qiáng),，持續(xù)時(shí)間長，信號所反應(yīng)的樣本信息量更豐富,，對信號接收儀器的要求相對較低,，儀器不需要必須配備低溫冷CCD（如絕對溫度＜-80^oC），節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本和購置成本,。

3. 實(shí)驗(yàn)成本低

相對于活體生物發(fā)光成像來說,，熒光成像費(fèi)用低廉，無需注射底物熒光素,。熒光發(fā)光基團(tuán)只要在其合適強(qiáng)度的激發(fā)光激發(fā)下就可以發(fā)出定波長的發(fā)射光信號,，整個(gè)反應(yīng)不需要向動物注射任何昂貴的反應(yīng)成分,，只要保證熒光基團(tuán)穩(wěn)定，就可實(shí)現(xiàn)隨時(shí)激發(fā)隨時(shí)發(fā)光的效果,。

4. 活體動物,、動物尸體、器官全部可以進(jìn)行成像

由于熒光是基于物理能量轉(zhuǎn)移原理,，對實(shí)驗(yàn)樣本的生理狀態(tài)要求較低,，可以實(shí)現(xiàn)活體、尸體,、尸解組織器官樣本的光學(xué)成像,。而對于生物發(fā)光，只有在活細(xì)胞內(nèi)才會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象,。

總之,，生物發(fā)光和熒光技術(shù)，如何互為補(bǔ)充,，取長補(bǔ)短,，分別滿足不同的研究領(lǐng)域，將來的發(fā)展方向是兩種技術(shù)并重,。對于不同的研究,，可根據(jù)兩者的特點(diǎn)以及實(shí)驗(yàn)要求，選擇合適的方法（表11-1）,。

以NightOWL ⅡLB 983為例,，來說明活體動物可見光成像系統(tǒng)的儀器設(shè)計(jì)原理,。整個(gè)儀器由CCD配合密閉性非常好的暗箱、熒光配件,、麻醉系統(tǒng)和軟件組成。CCD鏡頭位于暗箱的左上方,，熒光光源和光路位于右上方,，動物平臺（可加熱，以保持觀察實(shí)驗(yàn)動物的體溫）位于暗箱的下方,，麻醉系統(tǒng)通過管道與暗箱連接,。

選擇適當(dāng)?shù)腃CD鏡頭,，對于體內(nèi)可見光成像是非常重要的,。選用的CCD鏡頭對于波長450-700nm的光必須具有非常高的靈敏度和量子效率，而且由于需要探測的光源在皮下幾厘米處,，其噪聲信號要盡可能的小,。科研人員經(jīng)過探索發(fā)現(xiàn),，背照射背部薄化冷CCD是唯一合適的選擇,。這種CCD芯片溫度可達(dá)<-80⁰C，在該溫度下,，芯片的暗電流和閱讀噪音降到幾乎可以忽略不計(jì)的水平，同時(shí)配合密閉性非常好的暗箱,，使得該系統(tǒng)檢測生物發(fā)光和熒光具有無與倫比的靈敏度,。CCD由軟件控制升降，自動聚焦,，可以獲得從3.5厘米到25厘米的連續(xù)視野,。

成像暗箱屏蔽宇宙射線及一切光源,，可以使暗箱內(nèi)部保持完全黑暗，CCD所檢測的光線完全由被檢動物體內(nèi)發(fā)出,，避免外界環(huán)境的光污染,。

在熒光配件的設(shè)計(jì)方面，光源采用75W的鎢鹵燈,，該系統(tǒng)首先實(shí)現(xiàn)了熒光激發(fā)光源能量從0%-100%可調(diào)節(jié),，并通過光導(dǎo)纖維反饋控制激發(fā)能量在檢測時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，有利于定量的準(zhǔn)確性,。另外,，還通過采用均勻照射的激發(fā)裝置、窄波帶的濾光片等保證熒光成像能較好的去除背景噪音的影響,，獲得清晰的檢測結(jié)果,，較準(zhǔn)確的定量數(shù)據(jù)。

為了對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行可見光成像,，需要將實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行麻醉,，以獲得期望的觀察角度及穩(wěn)定的數(shù)據(jù)。對于生物發(fā)光成像來說,，由于檢測的時(shí)間較長,，一般建議使用氣體麻醉。氣體麻醉系統(tǒng)組成包括：氣體蒸發(fā)器,、誘導(dǎo)麻醉箱,、流量調(diào)節(jié)閥、單獨(dú)控制開關(guān)的五通道小鼠麻醉室,、廢氣吸收裝置等組成,。在成像前，將實(shí)驗(yàn)動物置入誘導(dǎo)麻醉箱并被麻醉, 然后放入成像暗箱進(jìn)行觀察

軟件系統(tǒng)負(fù)責(zé)儀器控制和圖像分析,。軟件控制鏡頭的焦距,、CCD的升降、曝光時(shí)間,、濾光片的更換和照明燈的開啟等,，具有友好的用戶界面，操作簡便,。

1.  細(xì)胞標(biāo)記或動物標(biāo)記等

進(jìn)行生物發(fā)光實(shí)驗(yàn),，首先根據(jù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的不同，用熒光素酶基因標(biāo)記腫瘤細(xì)胞,、干細(xì)胞、病毒、藥物載體或動物,，或者用Lux操縱子標(biāo)記細(xì)菌,。用熒光素酶基因標(biāo)記可通過質(zhì)粒,、慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒等方法進(jìn)行,。

如果進(jìn)行熒光實(shí)驗(yàn)，就用GFP,、EGFP或RFP標(biāo)記腫瘤細(xì)胞,、干細(xì)胞,、病毒或動物等,，后者用熒光染料（包括量子點(diǎn)）標(biāo)記需要檢測的物質(zhì)，如抗體,，藥物載體等,。

2.  體外預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測

需要檢測的細(xì)胞,、病毒,、細(xì)菌等標(biāo)記后，在活體成像前,，可以通過多孔板預(yù)先檢測一下標(biāo)記是否成功,，熒光素酶或熒光蛋白的表達(dá)強(qiáng)度等，并據(jù)此篩選陽性克隆,、繪制標(biāo)記物的發(fā)光梯度曲線等。體外預(yù)實(shí)驗(yàn)是作為小動物活體成像解決方案中不可缺少的一部分,。比如,，利用體外預(yù)實(shí)驗(yàn)初步檢測轉(zhuǎn)染熒光素酶的腫瘤細(xì)胞發(fā)光值，選擇轉(zhuǎn)染率相對高且穩(wěn)定的一批細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn),。對于通常進(jìn)行的細(xì)胞檢測來說,，具體可以通過活體成像儀器檢測活細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度，也可以通過體外化學(xué)發(fā)光和熒光檢測儀檢測細(xì)胞裂解液的發(fā)光強(qiáng)度,。

當(dāng)用體外化學(xué)發(fā)光和熒光檢測儀時(shí),，可以更準(zhǔn)確地捕捉到發(fā)光值、更穩(wěn)定的輸出發(fā)光值,。對于生物發(fā)光方式而言,，實(shí)驗(yàn)所需的儀器是微孔板式化學(xué)發(fā)光檢測儀，如Berthold Centro LB 960,。對于熒光方式而言,，實(shí)驗(yàn)所需的儀器是微孔板式熒光檢測儀，如Berthold Twinkle^TM LB 970,。(圖11-7)

     

圖11-7 左側(cè)為Berthold Centro LB 960,，右側(cè)為Berthold TwinkleTM LB 970

3.  活體成像

首先麻醉實(shí)驗(yàn)動物,，可采用異氟烷（isoflurane）或克他命/甲苯噻嗪（ketamine/xylazine）混合液麻醉實(shí)驗(yàn)動物。如果采用氣體麻醉,，可先注射底物,。氣體麻醉的優(yōu)點(diǎn)是動物可以很快進(jìn)入麻醉狀態(tài)，一旦停止麻醉氣體供應(yīng),，動物會在幾分鐘內(nèi)蘇醒,。

對于生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)來說，接著注射底物熒光素,。最佳的檢測時(shí)間是在注射后15到35分鐘之間。但需要注意的是,，對于不同的動物模型,，發(fā)光動力學(xué)過程并不完全一致，最好先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定何時(shí)發(fā)光信號最強(qiáng),。

成像,，對于生物發(fā)光來說，檢測時(shí)間一般是1分鐘到5分鐘,，如果信號特別弱,，也可以延長到10分鐘，如果信號特別強(qiáng),，也可在1分鐘以內(nèi),。對于熒光來說，檢測時(shí)間是1秒以內(nèi),。為節(jié)約時(shí)間,，檢測生物發(fā)光，最多可同時(shí)檢測5只小鼠,。對于熒光實(shí)驗(yàn),，麻醉好就可以馬上檢測。由于激發(fā)光照射的角度會影響檢測的信號值,，所以熒光實(shí)驗(yàn)建議每次只檢測1只動物,。