與熒光成像技術(shù)相比較,，生物發(fā)光成像技術(shù)主要的優(yōu)勢有：

1．特異性強(qiáng),，無自發(fā)熒光

以熒光素酶作為體內(nèi)報(bào)告源的生物發(fā)光方法,，是以酶和底物的特異作用而發(fā)光,，特異性極強(qiáng),。動(dòng)物本身沒有任何自發(fā)光,，使得生物發(fā)光具有極低的背景,，極高的信噪比。但用熒光方法時(shí),，在受到激發(fā)光激發(fā)時(shí),，生物體中皮膚、毛發(fā)和各種組織及食物等都會(huì)產(chǎn)生熒光,，特別是被標(biāo)記的靶點(diǎn)深臧于組織內(nèi)部,，需要較高能量的激發(fā)光時(shí),，也就會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的背景噪音。雖然熒光信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過生物發(fā)光,，但極低的自發(fā)光水平使得生物發(fā)光的信噪比遠(yuǎn)高于熒光,。

2．高靈敏度

生物體內(nèi)很多物質(zhì)在受到激發(fā)光激發(fā)后，也會(huì)發(fā)出熒光,，產(chǎn)生的非特異性熒光會(huì)影響到檢測靈敏度,。特別是當(dāng)發(fā)光細(xì)胞深藏于組織內(nèi)部，則需要較高能量的激發(fā)光源,，也就會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的背景噪音,。熒光成像的靈敏度最高也只能在動(dòng)物體內(nèi)檢測到約10⁵細(xì)胞，相對(duì)于生物發(fā)光在動(dòng)物體內(nèi)監(jiān)測到10²數(shù)量級(jí)細(xì)胞的靈敏度要相差很多,。

3. 檢測的深度

由于生物發(fā)光的靈敏度高于熒光成像,，對(duì)于需要深部成像的研究（檢測的深度在3~4cm），如干細(xì)胞,、原位腫瘤與轉(zhuǎn)移,，自發(fā)腫瘤等，應(yīng)用生物發(fā)光成像是最佳的選擇,。

4. 精確定量

生物發(fā)光信號(hào)可以用于精確定量,，因?yàn)闊晒馑孛富蚴遣迦爰?xì)胞染色體中穩(wěn)定表達(dá)的，單位細(xì)胞的發(fā)光數(shù)量很穩(wěn)定,。即便標(biāo)記細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)有復(fù)雜的定位,，亦可從動(dòng)物體表的信號(hào)水平直接得出發(fā)光細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。而對(duì)于熒光,，激發(fā)光需要穿過組織到達(dá)靶點(diǎn),，發(fā)射光需要從體內(nèi)出來，路徑較長,。信號(hào)水平取決于激發(fā)光的強(qiáng)度,、發(fā)光細(xì)胞的數(shù)量、靶點(diǎn)的深度,、光線穿過的組織對(duì)其的吸收及散射等因素,，使得熒光強(qiáng)度較難定量。熒光成像定量需要儀器的激發(fā)光能夠保證持續(xù)長時(shí)間穩(wěn)定,，并均勻照射到動(dòng)物體表,。NightOWL ⅡLB 983成像系統(tǒng)通過熒光光路的特殊設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了對(duì)激發(fā)光的能量控制和調(diào)節(jié)，根據(jù)光源的大小與深淺針對(duì)性選擇合適的激發(fā)裝置,，并且采用窄波帶濾光片,，提高了活體熒光成像的穩(wěn)定性和靈敏度，并且該系統(tǒng)操作簡單,、費(fèi)用低廉,、不涉及放射性,。

在活體動(dòng)物可見光成像技術(shù)中，相對(duì)于生物發(fā)光成像技術(shù),，熒光成像技術(shù)的優(yōu)勢主要表現(xiàn)在：

1. 熒光染料、蛋白標(biāo)記能力強(qiáng)

熒光標(biāo)記物種類繁多,，包括熒光蛋白,、熒光分子、量子點(diǎn)等,，可以與基因,、多肽、抗體等生物分子標(biāo)記,，作為分子探針使用范圍廣,。同時(shí)，不同的熒光蛋白或染料還可對(duì)樣本進(jìn)行多重標(biāo)記,，同時(shí)成像,。檢測的波長范圍從300~1100nm，某些儀器公司還提供全光譜的濾光片實(shí)現(xiàn)幾乎所有熒光標(biāo)記的體內(nèi)成像,。

2. 信號(hào)強(qiáng)度大

由于熒光是在外界光源激發(fā)下產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,，其光子強(qiáng)度較其它光學(xué)信號(hào)更強(qiáng)，持續(xù)時(shí)間長,，信號(hào)所反應(yīng)的樣本信息量更豐富,，對(duì)信號(hào)接收儀器的要求相對(duì)較低，儀器不需要必須配備低溫冷CCD（如絕對(duì)溫度＜-80^oC）,，節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本和購置成本,。

3. 實(shí)驗(yàn)成本低

相對(duì)于活體生物發(fā)光成像來說，熒光成像費(fèi)用低廉,，無需注射底物熒光素,。熒光發(fā)光基團(tuán)只要在其合適強(qiáng)度的激發(fā)光激發(fā)下就可以發(fā)出定波長的發(fā)射光信號(hào)，整個(gè)反應(yīng)不需要向動(dòng)物注射任何昂貴的反應(yīng)成分,，只要保證熒光基團(tuán)穩(wěn)定,，就可實(shí)現(xiàn)隨時(shí)激發(fā)隨時(shí)發(fā)光的效果。

4. 活體動(dòng)物,、動(dòng)物尸體,、器官全部可以進(jìn)行成像

由于熒光是基于物理能量轉(zhuǎn)移原理，對(duì)實(shí)驗(yàn)樣本的生理狀態(tài)要求較低,，可以實(shí)現(xiàn)活體,、尸體、尸解組織器官樣本的光學(xué)成像,。而對(duì)于生物發(fā)光,，只有在活細(xì)胞內(nèi)才會(huì)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象,。

總之，生物發(fā)光和熒光技術(shù),，如何互為補(bǔ)充,，取長補(bǔ)短，分別滿足不同的研究領(lǐng)域,，將來的發(fā)展方向是兩種技術(shù)并重,。對(duì)于不同的研究，可根據(jù)兩者的特點(diǎn)以及實(shí)驗(yàn)要求,，選擇合適的方法（表11-1）,。

以NightOWL ⅡLB 983為例,，來說明活體動(dòng)物可見光成像系統(tǒng)的儀器設(shè)計(jì)原理,。整個(gè)儀器由CCD配合密閉性非常好的暗箱、熒光配件,、麻醉系統(tǒng)和軟件組成,。CCD鏡頭位于暗箱的左上方，熒光光源和光路位于右上方,，動(dòng)物平臺(tái)（可加熱,，以保持觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體溫）位于暗箱的下方，麻醉系統(tǒng)通過管道與暗箱連接,。

選擇適當(dāng)?shù)腃CD鏡頭，對(duì)于體內(nèi)可見光成像是非常重要的,。選用的CCD鏡頭對(duì)于波長450-700nm的光必須具有非常高的靈敏度和量子效率,，而且由于需要探測的光源在皮下幾厘米處，其噪聲信號(hào)要盡可能的小,?？蒲腥藛T經(jīng)過探索發(fā)現(xiàn)，背照射背部薄化冷CCD是唯一合適的選擇,。這種CCD芯片溫度可達(dá)<-80⁰C,，在該溫度下，芯片的暗電流和閱讀噪音降到幾乎可以忽略不計(jì)的水平,，同時(shí)配合密閉性非常好的暗箱,，使得該系統(tǒng)檢測生物發(fā)光和熒光具有無與倫比的靈敏度。CCD由軟件控制升降,，自動(dòng)聚焦,，可以獲得從3.5厘米到25厘米的連續(xù)視野。

成像暗箱屏蔽宇宙射線及一切光源,，可以使暗箱內(nèi)部保持完全黑暗,，CCD所檢測的光線完全由被檢動(dòng)物體內(nèi)發(fā)出，避免外界環(huán)境的光污染,。

在熒光配件的設(shè)計(jì)方面,，光源采用75W的鎢鹵燈，該系統(tǒng)首先實(shí)現(xiàn)了熒光激發(fā)光源能量從0%-100%可調(diào)節(jié),，并通過光導(dǎo)纖維反饋控制激發(fā)能量在檢測時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定,，有利于定量的準(zhǔn)確性。另外,，還通過采用均勻照射的激發(fā)裝置,、窄波帶的濾光片等保證熒光成像能較好的去除背景噪音的影響，獲得清晰的檢測結(jié)果,，較準(zhǔn)確的定量數(shù)據(jù),。

為了對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行可見光成像,，需要將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行麻醉，以獲得期望的觀察角度及穩(wěn)定的數(shù)據(jù),。對(duì)于生物發(fā)光成像來說,，由于檢測的時(shí)間較長，一般建議使用氣體麻醉,。氣體麻醉系統(tǒng)組成包括：氣體蒸發(fā)器,、誘導(dǎo)麻醉箱、流量調(diào)節(jié)閥,、單獨(dú)控制開關(guān)的五通道小鼠麻醉室,、廢氣吸收裝置等組成。在成像前,，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置入誘導(dǎo)麻醉箱并被麻醉, 然后放入成像暗箱進(jìn)行觀察

軟件系統(tǒng)負(fù)責(zé)儀器控制和圖像分析,。軟件控制鏡頭的焦距、CCD的升降,、曝光時(shí)間,、濾光片的更換和照明燈的開啟等，具有友好的用戶界面,，操作簡便,。

1.  細(xì)胞標(biāo)記或動(dòng)物標(biāo)記等

進(jìn)行生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)，首先根據(jù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的不同,，用熒光素酶基因標(biāo)記腫瘤細(xì)胞,、干細(xì)胞、病毒,、藥物載體或動(dòng)物,，或者用Lux操縱子標(biāo)記細(xì)菌。用熒光素酶基因標(biāo)記可通過質(zhì)粒,、慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒等方法進(jìn)行,。

如果進(jìn)行熒光實(shí)驗(yàn)，就用GFP,、EGFP或RFP標(biāo)記腫瘤細(xì)胞,、干細(xì)胞、病毒或動(dòng)物等,，后者用熒光染料（包括量子點(diǎn)）標(biāo)記需要檢測的物質(zhì),，如抗體，藥物載體等,。

2.  體外預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測

需要檢測的細(xì)胞,、病毒、細(xì)菌等標(biāo)記后，在活體成像前,，可以通過多孔板預(yù)先檢測一下標(biāo)記是否成功,，熒光素酶或熒光蛋白的表達(dá)強(qiáng)度等，并據(jù)此篩選陽性克隆,、繪制標(biāo)記物的發(fā)光梯度曲線等,。體外預(yù)實(shí)驗(yàn)是作為小動(dòng)物活體成像解決方案中不可缺少的一部分。比如,，利用體外預(yù)實(shí)驗(yàn)初步檢測轉(zhuǎn)染熒光素酶的腫瘤細(xì)胞發(fā)光值,，選擇轉(zhuǎn)染率相對(duì)高且穩(wěn)定的一批細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。對(duì)于通常進(jìn)行的細(xì)胞檢測來說,，具體可以通過活體成像儀器檢測活細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度,，也可以通過體外化學(xué)發(fā)光和熒光檢測儀檢測細(xì)胞裂解液的發(fā)光強(qiáng)度。

當(dāng)用體外化學(xué)發(fā)光和熒光檢測儀時(shí),，可以更準(zhǔn)確地捕捉到發(fā)光值,、更穩(wěn)定的輸出發(fā)光值。對(duì)于生物發(fā)光方式而言,，實(shí)驗(yàn)所需的儀器是微孔板式化學(xué)發(fā)光檢測儀，如Berthold Centro LB 960,。對(duì)于熒光方式而言,，實(shí)驗(yàn)所需的儀器是微孔板式熒光檢測儀，如Berthold Twinkle^TM LB 970,。(圖11-7)

     

圖11-7 左側(cè)為Berthold Centro LB 960,，右側(cè)為Berthold TwinkleTM LB 970

3.  活體成像

首先麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，可采用異氟烷（isoflurane）或克他命/甲苯噻嗪（ketamine/xylazine）混合液麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,。如果采用氣體麻醉,，可先注射底物。氣體麻醉的優(yōu)點(diǎn)是動(dòng)物可以很快進(jìn)入麻醉狀態(tài),，一旦停止麻醉氣體供應(yīng),，動(dòng)物會(huì)在幾分鐘內(nèi)蘇醒。

對(duì)于生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)來說,，接著注射底物熒光素,。最佳的檢測時(shí)間是在注射后15到35分鐘之間。但需要注意的是,，對(duì)于不同的動(dòng)物模型,，發(fā)光動(dòng)力學(xué)過程并不完全一致，最好先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定何時(shí)發(fā)光信號(hào)最強(qiáng),。

成像,，對(duì)于生物發(fā)光來說，檢測時(shí)間一般是1分鐘到5分鐘，如果信號(hào)特別弱,，也可以延長到10分鐘,，如果信號(hào)特別強(qiáng)，也可在1分鐘以內(nèi),。對(duì)于熒光來說,，檢測時(shí)間是1秒以內(nèi)。為節(jié)約時(shí)間,，檢測生物發(fā)光,，最多可同時(shí)檢測5只小鼠。對(duì)于熒光實(shí)驗(yàn),，麻醉好就可以馬上檢測,。由于激發(fā)光照射的角度會(huì)影響檢測的信號(hào)值，所以熒光實(shí)驗(yàn)建議每次只檢測1只動(dòng)物,。