1. 標(biāo)記原理

哺乳動(dòng)物生物發(fā)光,，一般是將Firefly luciferase基因（由554個(gè)氨基酸構(gòu)成，約50KD）即熒光素酶基因整合到預(yù)期觀察的細(xì)胞染色體DNA上以表達(dá)熒光素酶,，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株,，當(dāng)細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)移,、分化時(shí), 熒光素酶也會(huì)得到持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)?；?、細(xì)胞和活體動(dòng)物都可被熒光素酶基因標(biāo)記。將標(biāo)記好的細(xì)胞接種到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)后,，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象,。這種酶在ATP,，氧存在的條件下,，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會(huì)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象,，并且發(fā)光光強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān),。

除Firefly Luciferase外，有時(shí)也會(huì)用到Renilla Luciferase,。二者的底物不一樣,，前者的底物是熒光素（D-luciferin)，后者的底物是coelentarizine,。二者的發(fā)光波長(zhǎng)不一樣,，前者所發(fā)的光波長(zhǎng)在540~600nm,，后者所發(fā)的光波長(zhǎng)在460~540nm左右,。前者所發(fā)的光更容易透過(guò)組織，后者在體內(nèi)的代謝比前者快,，而且特異性沒(méi)有前者好,，所以大部分活體實(shí)驗(yàn)使用Firefly Luciferase作為報(bào)告基因,，如果需要雙標(biāo)記,，也可采用后者作為備選方案。

熒光素酶的發(fā)光是生物發(fā)光,，不需要激發(fā)光，但需要底物熒光素,。熒光素在氧氣,、ATP存在的條件下和熒光素酶發(fā)生反應(yīng),，生成氧化熒光素(oxyluciferin)，并產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象,。

對(duì)于細(xì)菌標(biāo)記,，一般利用發(fā)光酶基因操縱子luxABCDE或luxCDABE,，其由控制的編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成。利用這種辦法進(jìn)行標(biāo)記的細(xì)菌會(huì)持續(xù)發(fā)光,，不需要外源性底物,。但是一般細(xì)菌標(biāo)記需要轉(zhuǎn)座子的幫助把外源基因插入到細(xì)菌染色體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá),。

2. 底物熒光素的特點(diǎn)

熒光素由于諸多優(yōu)點(diǎn)得到廣大科研人員的青睞，主要特點(diǎn)如下：

(1) 熒光素不會(huì)影響動(dòng)物的正常生理功能,。

(2)熒光素是280道爾頓的小分子,，水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透細(xì)胞膜和血腦屏障,。

(3) 熒光素在體內(nèi)擴(kuò)散速度快,，可通過(guò)腹腔注射或尾部靜脈注射進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)。腹腔注射擴(kuò)散較慢,，持續(xù)發(fā)光長(zhǎng),。熒光素腹腔注射老鼠后約1min后表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞開(kāi)始發(fā)光，10min后強(qiáng)度達(dá)到穩(wěn)定的最高點(diǎn),，在最高點(diǎn)持續(xù)約20~30 min后開(kāi)始衰減，約3h后熒光素排除,，發(fā)光全部消失,，最佳檢測(cè)時(shí)間是在注射后15~35min之間；若進(jìn)行熒光素靜脈注射,，擴(kuò)散快,，但發(fā)光持續(xù)時(shí)間很短,。科研人員根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)總結(jié)出熒光素的合適的用量是150mg/kg,，即體重20克的小鼠需要3毫克的熒光素,。

(4) 觀察時(shí)間的間隔沒(méi)有最短限制，只要觀察的條件控制一致就可以,。雖然底物在動(dòng)物體內(nèi)有一定的代謝過(guò)程,，但是上一次底物的殘留曲線可以知道,，可以控制對(duì)下一次觀察結(jié)果的影響,。

3. 光學(xué)原理

光在哺乳動(dòng)物組織內(nèi)傳播時(shí)會(huì)被散射和吸收，光子遇到細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)時(shí)會(huì)發(fā)生折射現(xiàn)象,，而且不同類型的細(xì)胞和組織吸收光子的特性并不一樣,。血紅蛋白（hemoglobin）是造成體內(nèi)可見(jiàn)光被吸收的主要因素，其吸收可見(jiàn)光中藍(lán)綠光波段的大部分,。但是在可見(jiàn)光大于600納米的紅光波段,，血紅蛋白的吸收作用卻很小。因此,，在偏紅光區(qū)域, 大量的光可以穿過(guò)組織和皮膚而被檢測(cè)到。利用活體動(dòng)物生物發(fā)光成像技術(shù)最少可以檢測(cè)到皮下的幾百個(gè)細(xì)胞,。當(dāng)然,，由于發(fā)光源在老鼠體內(nèi)深度的不同可看到的最少細(xì)胞數(shù)是不同的。一般認(rèn)為,，每一厘米深度,，發(fā)光強(qiáng)度衰減10倍，血液豐富的組織或器官（比如心臟,、肝臟,、肺臟）衰減多，與骨骼相鄰的組織或器官衰減少,。在相同的深度情況下,，檢測(cè)到的發(fā)光強(qiáng)度和細(xì)胞的數(shù)量具有非常好的線性關(guān)系，可由儀器量化檢測(cè)到的光強(qiáng)度,，反映出細(xì)胞的數(shù)量。

活體生物發(fā)光成像技術(shù)是一項(xiàng)在某些領(lǐng)域有不可替代優(yōu)勢(shì)的技術(shù),，比如腫瘤轉(zhuǎn)移研究,、藥物開(kāi)發(fā)、基因治療,、干細(xì)胞示蹤等方面。

1．腫瘤學(xué)

活體生物發(fā)光成像技術(shù)能夠讓研究人員能夠直接快速的測(cè)量各種癌癥模型中腫瘤的生長(zhǎng),、轉(zhuǎn)移以及對(duì)藥物的反應(yīng)。其特點(diǎn)是極高的靈敏度使微小的腫瘤病灶（少到幾百個(gè)細(xì)胞）也可以被檢測(cè)到,，比傳統(tǒng)方法的靈敏度大大提高了,；非常適合于腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)的定量分析；避免由于宰殺老鼠而造成的組間差異,；節(jié)省動(dòng)物成本。由于以上特點(diǎn),，使基于轉(zhuǎn)移模型,、原位模型、自發(fā)腫瘤模型等方面的腫瘤學(xué)研究得到發(fā)展,。建立腫瘤轉(zhuǎn)移模型,，可以觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況，進(jìn)一步探討腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制,；可進(jìn)行原位接種，觀察原位以及原位轉(zhuǎn)移模型,，使腫瘤學(xué)研究更接近腫瘤臨床發(fā)病的微觀環(huán)境,；通過(guò)建立自發(fā)腫瘤模型，可以觀察腫瘤發(fā)生機(jī)理,。（圖11-1）,。

圖11-1 腫瘤的長(zhǎng)期檢測(cè)，左圖分別是7天,，14天,，30天成像。來(lái)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院

2．藥物研究

在藥效學(xué)評(píng)價(jià)方面,，熒光素酶癌癥模型可用于癌癥體內(nèi)用藥在整體動(dòng)物水平上進(jìn)行長(zhǎng)期療效跟蹤觀察,。利用無(wú)創(chuàng)傷活體成像對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的檢測(cè)，可對(duì)癌癥治療之前和過(guò)程中的癌細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)和評(píng)估,。這種方式提供一個(gè)很好的對(duì)癌細(xì)胞的反應(yīng)和復(fù)發(fā)評(píng)估的預(yù)診斷途徑,。用活體成像的方法比傳統(tǒng)技術(shù)有更高的靈敏度，當(dāng)用傳統(tǒng)的方法還不能檢測(cè)到瘤塊時(shí),，用該技術(shù)已經(jīng)可以檢測(cè)到很強(qiáng)的信號(hào)。由于該技術(shù)只是檢測(cè)活細(xì)胞,，不能檢測(cè)已經(jīng)凋亡的細(xì)胞,。而用傳統(tǒng)的方法，不能區(qū)別正常細(xì)胞與凋亡的細(xì)胞,，所以該技術(shù)可以比傳統(tǒng)技術(shù)更早更靈敏的發(fā)現(xiàn)藥物的療效,。

利用活體成像技術(shù)高靈敏度,、觀察方便的特點(diǎn)，在抗腫瘤藥物臨床前研究中,，通過(guò)給予腫瘤接種的小鼠不同劑量,，不同給藥時(shí)間,、不同給藥途徑，觀察抗腫瘤藥物的最佳給藥途徑,、給藥劑量及給藥時(shí)間,，從而制定合適的劑型與服藥時(shí)間。

在藥物代謝方面,，標(biāo)記與藥物代謝有關(guān)的基因，比如CYP3A4等,，研究不同的藥物對(duì)該基因表達(dá)的影響,，從而可以間接知道相關(guān)藥物在體內(nèi)代謝的情況。

在藥劑學(xué)研究方面，可以通過(guò)把熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒直接裝載在藥物載體中,，觀察藥物載體的靶向臟器與體內(nèi)分布規(guī)律（圖11-2）,。在藥理學(xué)方面，還可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因小鼠的應(yīng)用,，觀察藥物作用的通路,，用熒光素酶基因標(biāo)記某一個(gè)興趣基因，觀察藥物作用的通路,。

圖11-2利用IL-1Β轉(zhuǎn)基因小鼠篩選抗炎癥藥物，來(lái)自上海南方模式生物研究中心

3．基因治療

基因治療是將正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^(guò)一定方式導(dǎo)入靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用,，從而達(dá)到治療疾病目的,。目前，基因治療主要是以病毒做載體,，可應(yīng)用熒光素酶基因作為報(bào)告基因加入載體,，觀察目的基因是否到達(dá)動(dòng)物體內(nèi)的特異組織和是否持續(xù)高效表達(dá)，這種非侵入方式具有低毒性及免疫反應(yīng)輕微等優(yōu)點(diǎn)且可以直接實(shí)時(shí)觀察,，了解病毒或載體侵染的部位和時(shí)域信息；熒光素酶基因也可以插入脂質(zhì)體包裹的DNA分子中,，用來(lái)觀察脂質(zhì)體為載體的DNA運(yùn)輸和基因治療情況,；也可以表達(dá)熒光素酶基因的質(zhì)粒裸DNA為模型DNA,，直接注入動(dòng)物體內(nèi),，利用生物發(fā)光成像可以分析不同載體、不同注射位點(diǎn),、不同注射量對(duì)熒光素酶基因表達(dá)的影響,，同時(shí)也可以時(shí)空量化分析基因表達(dá)的分布、水平和持續(xù)時(shí)間,。這種可視的方法直觀地評(píng)價(jià)DNA的轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)效率,，在基因治療研究中具有重要的指導(dǎo)作用。

4．干細(xì)胞及免疫學(xué)

用熒光素酶標(biāo)記干細(xì)胞有以下幾種方法：一種是標(biāo)記組成性表達(dá)的基因,，做成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,，干細(xì)胞就被標(biāo)記了，若干細(xì)胞移植到另外動(dòng)物體內(nèi),，可以用活體生物發(fā)光成像技術(shù)示蹤干細(xì)胞在體內(nèi)的增殖,、分化及遷徙的過(guò)程,；另外一種方法是用慢病毒直接標(biāo)記干細(xì)胞后，移植到體內(nèi)觀測(cè)其增殖,、分化及遷徙過(guò)程,，研究其修復(fù)、治療損傷或缺陷部分的效果,，進(jìn)一步探討其機(jī)制,。

可以通過(guò)標(biāo)記免疫細(xì)胞，觀察免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞等的識(shí)別和殺死功能,，評(píng)價(jià)免疫細(xì)胞的免疫特異性,、增殖、遷移及功能等,；通過(guò)標(biāo)記異體細(xì)胞,，觀察異體細(xì)胞對(duì)器官移植影響；也可進(jìn)行一些關(guān)于免疫因子的研究等,。

5．基因表達(dá)模式與基因功能研究

研究基因表達(dá)可以從影響基因表達(dá)的各個(gè)不同的層面進(jìn)行相關(guān)的研究,，如利用融合蛋白（p27-luc融合蛋白研究其在Cdk細(xì)胞分裂周期的表達(dá)），興趣基因啟動(dòng)子控制的熒光素酶（Catenin在腫瘤轉(zhuǎn)移的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制）,，siRNA方式和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等方法,。

為研究目的基因是在何時(shí)、何種刺激下表達(dá),，將熒光素酶基因插入目的基因啟動(dòng)子的下游,，并穩(wěn)定整合于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染色體中，形成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型,。通過(guò)這種方法實(shí)現(xiàn)熒光素酶和目的基因的平行表達(dá),，從而可以直接觀察目的基因的表達(dá)模式，包括數(shù)量,、時(shí)間,、部位及影響其表達(dá)和功能的因素等；也可用于研究動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中特定基因的時(shí)空表達(dá)情況,，觀察藥物誘導(dǎo)特定基因表達(dá),；以及其它生物學(xué)事件引起的相應(yīng)基因表達(dá)或關(guān)閉。

6．蛋白質(zhì)相互作用

可利用動(dòng)物體內(nèi)生物發(fā)光成像技術(shù)研究活體動(dòng)物體內(nèi)蛋白與蛋白的相互作用,。其原理是將分開(kāi)時(shí)都不單獨(dú)發(fā)光的熒光酶的C端和N端分別連接在兩個(gè)不同的蛋白質(zhì)上,，若是這兩個(gè)蛋白質(zhì)之間有相互作用，熒光酶的C端和N端就會(huì)被連接到一起,，激活熒光素酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá),，在有底物存在時(shí)出現(xiàn)生物發(fā)光。在活體條件下研究藥物對(duì)蛋白質(zhì)相互作用的影響，可以觀察到在體外實(shí)驗(yàn)中無(wú)法模擬的活體環(huán)境對(duì)蛋白質(zhì)相互作用的影響,。

7．細(xì)胞凋亡

利用活體動(dòng)物生物發(fā)光成像技術(shù),，直接觀察活體動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞凋亡。具體原理是用分子生物學(xué)方法在熒光酶的兩端連接上抑制其發(fā)光的蛋白(如雌激素),，但在其連接處加上caspase (細(xì)胞凋亡時(shí)特異表達(dá)的一種酶)的酶切點(diǎn),。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，表達(dá)caspase,，切開(kāi)抑制熒光酶發(fā)光的蛋白,，使熒光素酶開(kāi)始發(fā)光。

8. 疾病機(jī)理

可以標(biāo)記與某種疾病密切相關(guān)的基因,，做成轉(zhuǎn)基因小鼠,，通過(guò)特定的藥物作用或其他條件下該基因表達(dá)的變化，來(lái)推測(cè)該疾病的發(fā)病機(jī)理和藥物對(duì)疾病治療的效果等,。

9．其他

如RNAi,、蛋白質(zhì)核運(yùn)輸?shù)取Ｔ跓晒馑孛富虻囊欢私右芯康牡鞍踪|(zhì)的基因,，另一端接肯定在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)的蛋白的基因,，當(dāng)核外的蛋白運(yùn)輸?shù)胶藘?nèi)時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致熒光素酶N端,、C端靠近,，恢復(fù)發(fā)光。