一,、原理
菌落總數(shù)：指在一定條件下（如需氧情況、營養(yǎng)條件,、pH,、培養(yǎng)溫度和時間等）每克（每毫升）檢樣所生長出來的細(xì)菌菌落總數(shù)。按國家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定,，即在需氧情況下,，37℃培養(yǎng)48h，能在普通營養(yǎng)瓊脂平板上生長的細(xì)菌菌落總數(shù),，所以厭氧或微需氧菌,、有特殊營養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細(xì)菌,，由于現(xiàn)有條件不能滿足其生理需求，故難以繁殖生長,。因此菌落總數(shù)并不表示實(shí)際中的所有細(xì)菌總數(shù),，菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細(xì)菌的種類，所以有時被稱為雜菌數(shù),，需氧菌數(shù)等,。
大腸菌群：指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣,、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌,。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量,，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能,。食品中大腸菌群數(shù)系以100ml（g）檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)（MPN)表示。
人沙門氏菌病有四類綜合癥：沙門氏菌??；傷寒；非傷寒型沙門氏菌敗血癥和無癥狀帶菌者,。沙門氏菌胃腸炎是由除傷寒沙門氏菌外任何一型沙門氏菌而所致,，通常表現(xiàn)為輕度，持久性腹瀉,。傷寒實(shí)際上是由傷寒沙門氏菌所致,。未接受過治療的病人致死率可超過10%，而對經(jīng)過適當(dāng)醫(yī)療的病人其致死率低于1%,，幸存者可變成慢性無癥狀沙門氏菌攜帶者,。這些無癥狀攜帶者不顯示發(fā)病癥狀仍能將微生物傳染給其他人(傳統(tǒng)的例子就是瑪麗傷寒)。
沙門氏菌胃腸炎,，潛伏期一般6-72小時,，主要癥狀為惡心、嘔吐,、腹絞痛,、腹瀉、發(fā)熱寒顫頭痛,。病程一般1-2天或更長,。感染劑量為15-20個菌，死亡率達(dá)1-4%,。最易感群體是年幼兒童,、虛弱者、年長老人,、免疫缺陷者等,。污染源主要是人和家畜的糞便,，沙門氏菌常存在于動物中，特別是禽類和豬,。在許多環(huán)境中也有存在,。從水，土壤,，昆蟲中，從工廠和廚房設(shè)施的表面和動物糞便中已發(fā)現(xiàn)該類細(xì)菌,。它們可以存在于多類食品中,，包括生肉，禽,，奶制品和蛋，魚,，蝦和田雞腿,，酵母，椰子,，醬油和沙拉調(diào)料,，蛋糕粉，奶油夾心甜點(diǎn),，頂端配料,，干明膠,，花生露,，橙汁，可可和巧克力,。
沙門氏菌屬也是嗜溫性細(xì)菌,，在中等溫度,，中性pH,，低鹽和高水活度條件下生長最佳,。生長最低水活度為0.94。兼性厭氧,，對中等加熱敏感,。同樣,，該菌屬能適應(yīng)酸性環(huán)境,。通過衛(wèi)生以防止二次污染,；蒸煮,；巴氏消毒等控制,。正常家庭烹調(diào)，個人衛(wèi)生可以防止煮熟食品的二次污染,，以及控制時間和溫度一般都能充分防止沙門氏菌病的發(fā)生,。
二、目的
1.了解大腸菌群作衛(wèi)生指標(biāo)原因及檢測原理,、菌種鑒定原理,。
2.正確測定食品中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群數(shù)，會從EMB平板上區(qū)分大腸菌群,。
3.了解食品中和食物中毒樣品中沙門氏菌的檢驗
三,、 儀器和材料
1. 溶液或試劑
2. 樣品：水樣、飲料等
3. 培養(yǎng)基：具體見附錄1
4. 儀器或其它用具 滅菌三角燒瓶,，滅菌培養(yǎng)皿,，滅菌吸管，滅菌試管無菌三角玻棒,、
記號筆,，接種環(huán)、試管架,、酒精燈,、火柴、標(biāo)簽紙等,。
四,、 實(shí)驗內(nèi)容與方法
（一） 樣品的采集和處理
1. 自來水水樣
先沖洗水龍頭，用酒精燈灼燒龍頭,，放水5－10min,，在酒精燈旁打開水樣瓶蓋（或棉花塞）,，取所需的水量后蓋上瓶蓋（或棉塞）,，迅速送回實(shí)驗室檢驗，若來不及檢驗放在4℃冰箱內(nèi)保存,，24h內(nèi)檢驗,。
經(jīng)氯處理的水中含余氯，會減少水中細(xì)菌的數(shù)目,，采樣瓶在滅菌前加入硫代硫酸鈉,，以便取樣時消除氯的作用。硫代硫酸鈉的用量視采樣瓶的大小而定。若是500mL的采樣瓶,，加入1.5％的硫代硫酸鈉溶液1.5mL（可消除余氯量為2mg/L的450mL水樣中全部氯量,。
2. 河湖、井水,、海水
用特制的采樣瓶采集水樣,，若是測定好氧微生物，應(yīng)立即改換無菌棉花塞,。迅速送回實(shí)驗室檢驗,，若來不及檢驗放在4℃冰箱內(nèi)保存，24h內(nèi)檢驗,，污水要在6h以內(nèi)結(jié)束檢驗,。
3. 蛋類
液全蛋（均狀）：無菌操作稱25g置于無菌的500mL錐形燒瓶或其它合適容器中。加225mL胰胳胨（胰化物）大豆肉湯（TSB）并振蕩充分混勻,。在室溫下靜置60分鐘，振搖使其充分混勻,，用試紙測定pH值,。必要時調(diào)節(jié)pH值至6.8±0.2，置35℃培養(yǎng)24±2小時,。
4. 液奶（去脂牛奶,，含2%脂肪牛奶，全脂奶,，和脫脂奶）
無菌操作稱取25g或者吸取25mL樣品,，放入滅菌帶螺旋帽的廣口瓶中（500mL）或其他合適的容器內(nèi)。振搖使充分混勻,，用試紙測定pH值,。必要時用滅菌的1NNaOH或1NHcl調(diào)節(jié)pH至6.8±0.2。在測定最終pH前要蓋緊瓶蓋并充分混勻,。
（二） 菌落總數(shù)的測定
檢樣→做成幾個適當(dāng)倍數(shù)的稀釋度→選擇2個~3個適宜稀釋度各取1mL分別加入滅菌培養(yǎng)皿中→每皿內(nèi)加入適量營養(yǎng)瓊脂（36℃±1℃,，48h±2h）→菌落計數(shù)→報告
（三） 多管發(fā)酵法測定大腸菌群
1. 初發(fā)酵試驗
在3根含有10ml單倍的乳糖蛋白胨發(fā)酵試管中各加入樣品0.1ml，在3根含有10ml單倍的乳糖蛋白胨發(fā)酵試管中各加入樣品1ml,，在3根含有10ml雙倍濃縮（或者5ml三倍濃縮）的乳糖蛋白胨發(fā)酵試管中各加入樣品10ml（如圖所示）,。混勻后,，37℃培養(yǎng)24h,，24h未產(chǎn)氣的繼續(xù)培養(yǎng)至48h。
2. EMB平板分離
經(jīng)24h培養(yǎng)后,，將產(chǎn)酸產(chǎn)氣及48h產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管,，分別劃線接種于伊紅美蘭瓊脂平板上，再于37℃培養(yǎng)18~24h，將符合下列特征的菌落的一小部分,，進(jìn)行涂片,，革蘭氏染色，鏡檢,。
1深紫黑色,、有金屬光澤。
2紫黑色,，不帶或略帶金屬光澤,。
3淡紫紅色、中心顏色較深,。
3.復(fù)發(fā)酵試驗
經(jīng)過涂片,、染色、鏡檢,，如為革蘭氏陰性無芽孢桿菌,，則挑取該菌落的另一部分，重新接種于普通濃度的乳糖蛋白胨發(fā)酵管中,，每管可接種來自同一初發(fā)酵管的同類型菌落1~3個,，37℃培養(yǎng)24h，結(jié)果若產(chǎn)酸產(chǎn)氣,，即證實(shí)有大腸菌群的存在,。
證實(shí)有大腸菌群存在后，再根據(jù)初發(fā)酵試驗的陽性管數(shù)查表,，即得大腸菌群數(shù),。
（四）沙門氏菌的檢驗
1.增菌試驗
取樣25g (m1)，加入225ml緩沖蛋白胨水中,，36+1℃培養(yǎng)4小時,，移取10ml接種于100ml氯化鎂孔雀綠增菌液內(nèi)，于42℃培養(yǎng)18～24小時,。
2.分離純化
取增菌液1環(huán),，劃線接種于一個DHL平板上，于36℃培養(yǎng)18～24小時,，沙門氏菌Ⅰ,、Ⅱ、Ⅳ,、Ⅴ,、Ⅵ、在DHL平板上菌落特征為無色半透明,，產(chǎn)硫化氫菌落中心帶黑色或幾乎全黑色,，沙門氏菌Ⅲ在DHL平板上菌落特征為乳糖遲緩陽性或影星的菌株與其它沙門氏菌相同，乳糖陽性的菌株為粉紅色，中心帶黑色,。
3.生化試驗
挑取選擇性瓊脂平板上的可疑菌落,，接種于三糖鐵瓊脂中。在三糖鐵瓊脂中內(nèi),，沙門氏菌的主要反應(yīng)：斜面為紅色,，底部變黑并產(chǎn)氣。
4.血清學(xué)試驗（試驗略）
5.菌型的判定和結(jié)果報告
綜合以上生化試驗和血清學(xué)分型鑒定的結(jié)果,，按照有關(guān)沙門氏菌屬抗原表（見GB/T 4789.4－2003第27頁）判定菌型,，并報告結(jié)果。
五,、實(shí)驗報告
（一）菌落計數(shù)及報告方法
用肉眼觀察,，計平板上的細(xì)菌菌落總數(shù)，也可用放大鏡和菌落計數(shù)器計數(shù),。記下同一濃度的三個平板上的菌落總數(shù),，計算平均值，再乘以稀釋倍數(shù)即1mL檢樣中細(xì)菌菌落總數(shù),。各種不同情況的計算方法如下：
1首先選擇平均菌落數(shù)在30~300之間者進(jìn)行計算,，當(dāng)只有一個稀釋度的平均菌落符合此范圍時，則以該平均菌落數(shù)乘以其稀釋倍數(shù)報告之（表10－1例1）,。
2若有兩個稀釋度的平均菌落落在30~300之間,，則按兩者之菌落總數(shù)之比值來決定,，若其比值小于2應(yīng)報告兩者之平均數(shù),，若大于2則報告其中較小的菌落總數(shù)（表10－1例2及例3）.
3若所用稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（表10－1例4）.
4若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30,，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（表10－1例5）,。
5若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30~300之間，則以最接近300或者30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（表10－1例6）,。
6在求同稀釋度的平均數(shù)時,，若其中一個平板上有較大片狀菌落生長時，則不宜采用,，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的平均菌落數(shù),。若片狀菌落約為平板的一半，而另一半平板上的菌落數(shù)分布很均勻,，則可按半平板上的菌落計數(shù),，然后乘以2作為整個平板的菌落數(shù)。
7菌落計數(shù)的報告,，菌落數(shù)在100以內(nèi)時按實(shí)有數(shù)報告,，大于100時，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的位數(shù),，以四舍五入方法計算,。為了縮短梳子后面的零數(shù)，可用10的指數(shù)來表示,。在報告菌落數(shù)位“無法計數(shù)”時,，應(yīng)注明樣品的稀釋倍數(shù)。
