熒光定量PCR是指在傳統(tǒng)PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團,其熒光基團會與PCR每次循環(huán)產(chǎn)生的新鏈的量成同比例增長,,再利用檢測熒光信號的積累實時監(jiān)測整個PCR進程,,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。
熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種:熒光探針和熒光染料,。熒光探針如:TaqMan熒光探針,,熒光染料如:SYBR熒光染料,。
在熒光定量PCR檢測中經(jīng)常出現(xiàn)的一些定義值的含義:
Ct值:每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
熒光域值:PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號,,熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍,。
Ct值與起始模板的關(guān)系:每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多,,Ct值越小,。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),,縱坐標(biāo)代Ct值。因此,,只要獲得未知樣品的Ct值,,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種:熒光探針和熒光染料,。熒光探針如:TaqMan熒光探針,,熒光染料如:SYBR熒光染料,。
在熒光定量PCR檢測中經(jīng)常出現(xiàn)的一些定義值的含義:
Ct值:每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
熒光域值:PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號,,熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍,。
Ct值與起始模板的關(guān)系:每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多,,Ct值越小,。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),,縱坐標(biāo)代Ct值。因此,,只要獲得未知樣品的Ct值,,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。