本研究對(duì)EV71的流行株進(jìn)行分析,，在Vero細(xì)胞上的適應(yīng)性，以及病毒的抗原性和交叉保護(hù)試驗(yàn)進(jìn)行研究,，旨在能為疫苗的研制提供參考,。
材料與方法
1.1標(biāo)本采集根據(jù)衛(wèi)生部《手足口病預(yù)防控制指南(2009版)》的要求，所有重癥和死亡病例均需采樣,。此外,，以縣(區(qū))為單位，每月最少需采集5例首次就診的普通病例標(biāo)本;采自7省(其中包括昆明市,、普洱市,、楚雄州、曲靖市,、紅河州,、臨滄市、昭通市)臨床診斷為手足口病患兒的2份疤疹液,、7份咽拭子和1份糞便標(biāo)本采樣患者均為輕癥,，結(jié)局為痊愈。確診方法為RT-PCR,，分離細(xì)胞為RD,HEP,。
1.2標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)EV71腸道病毒分離,，RT-FCR試驗(yàn)方法均按衛(wèi)生部《手足口病預(yù)防控制指南(2009版)》中《手足口病標(biāo)本采集及檢測(cè)技術(shù)方案》進(jìn)行。
1.3VP1基因測(cè)序?qū)?株病毒標(biāo)本委托中國(guó)疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行測(cè)序,，應(yīng)用Mega軟件對(duì)所得序列進(jìn)行校正處理,，與GenBank登陸序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建基因親緣性關(guān)系樹(shù),。
1.4病毒滴度和抗原含量測(cè)定按照《手足口病預(yù)防控制指南(2009版)》和文獻(xiàn)所述的方法分別進(jìn)行病毒滴度和抗原含量 測(cè)定
1.5動(dòng)物免疫將分離到的8株病毒接種于生長(zhǎng)成單層的Ver,。細(xì)胞上，病變達(dá)到75%以上進(jìn)行收獲,。對(duì)收獲液經(jīng)560C30min滅活后,，測(cè)定抗原含量。用100U/劑(北京科興生物制品有限公司標(biāo)定)的收獲液腹腔免疫ICR小鼠(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司),，采用0d,14d2針免疫,。第0d,14d,28d采血。4℃條件下離心,，獲得血清,。
1.6中和試驗(yàn)采用微量板細(xì)胞病變法檢測(cè)中和抗體效價(jià)〔7.RJ。血清樣本按2倍系列稀釋法進(jìn)行稀釋?zhuān)?6℃水浴滅活30min,。血清稀釋后分別與100CCID5,。病毒等體積混合，于96孔板中置37qCC0,培養(yǎng)箱中中和2h,，加人Ver,。細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為2x105個(gè)/ml,。置37cCCOZ培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d,顯微鏡下觀察細(xì)胞病變,，以能抑制50%細(xì)胞病變的最高稀釋度的倒數(shù)作為中和效價(jià)。試驗(yàn)設(shè)立細(xì)胞對(duì)照,、血清對(duì)照和病毒對(duì)照,，同時(shí)設(shè)立回滴(回滴結(jié)果在32一320CCIDSO/0.05ml時(shí)，試驗(yàn)成立),。檢測(cè)結(jié)果以1:8判斷為中和抗體陽(yáng)性,。
1.7交叉保護(hù)試驗(yàn)將8個(gè)病毒株免疫后血清分別與A基因型、B3基因型,C4基因型病毒進(jìn)行中和試驗(yàn),。將C4基因型毒株免疫血清分別對(duì)8個(gè)病毒株進(jìn)行中和試驗(yàn),，C4基因型病毒來(lái)自北京科興生物制品有限公司。
2結(jié)果
2.1檢測(cè)結(jié)果實(shí)驗(yàn)室通過(guò)RT-PCR檢測(cè),，8份標(biāo)本結(jié)果均為EV71,。使用Ver。細(xì)胞培養(yǎng)中引起特殊腸道病毒致細(xì)胞病變效應(yīng),，表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮,、分散,、胞質(zhì)內(nèi)顆粒增加，最后細(xì)胞自瓶壁脫落,。8份標(biāo)本在Ver。細(xì)胞中產(chǎn)生明顯病變,，對(duì)其進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn),。
2.2基因測(cè)序病毒滴度:8株病毒在Ver。細(xì)胞中均可有效增值,，但增值水平略有不同,。除1株(299")小于5.OLgCCIDSO/ml以外，其他7株均>5.SSLgCCIDSO/ml,?？乖?8株病毒經(jīng)Vero細(xì)胞傳代后均能監(jiān)測(cè)到抗原，抗原含量均能達(dá)到100U/ml以上,。
