腸道病毒71型(enterovirus71,EV71)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬,，基因分型將其分為A,B和C三個基因型，其中B型和C型又可進一步分為B1一BS和C1一CS'-'}oEV71感染常引起手足口病(hand-foot-mouthdisease,HFMD)}z},，主要發(fā)生在5歲以下兒童，少數(shù)病例可并發(fā)腦炎,、無菌性腦膜炎,、肺水腫或肺出血、急性軟癱和心肌炎等,，可導致死亡,。自1997年以來，EV71在亞太地區(qū)流行[4-6]0自2008年,，該病在我國發(fā)生大流行,，已成為我國現(xiàn)階段重大的公共衛(wèi)生問題之一。2009年,，云南省共報告手足口病巧062例,，其中重癥302例，死亡13例，發(fā)病率為33.1543/10萬,，死亡率為0.02886/10萬,。迄今，尚無治療EV71感染患者的特效藥物,，疫苗是預防手足口病的最有效措施,。 　　

　　本研究對EV71的流行株進行分析，在Vero細胞上的適應性,，以及病毒的抗原性和交叉保護試驗進行研究,，旨在能為疫苗的研制提供參考。 　　

　　材料與方法 　　

　　1.1標本采集根據(jù)衛(wèi)生部《手足口病預防控制指南(2009版)》的要求,，所有重癥和死亡病例均需采樣,。此外，以縣(區(qū))為單位,，每月最少需采集5例首次就診的普通病例標本;采自7省(其中包括昆明市,、普洱市、楚雄州,、曲靖市,、紅河州、臨滄市,、昭通市)臨床診斷為手足口病患兒的2份疤疹液,、7份咽拭子和1份糞便標本采樣患者均為輕癥，結局為痊愈,。確診方法為RT-PCR,，分離細胞為RD,HEP。 　　

　　1.2標本的實驗室檢測EV71腸道病毒分離,，RT-FCR試驗方法均按衛(wèi)生部《手足口病預防控制指南(2009版)》中《手足口病標本采集及檢測技術方案》進行,。 　　

　　1.3VP1基因測序將8株病毒標本委托中國疾病預防控制中心進行測序，應用Mega軟件對所得序列進行校正處理,，與GenBank登陸序列進行比對,，并構建基因親緣性關系樹。 　　

　　1.4病毒滴度和抗原含量測定按照《手足口病預防控制指南(2009版)》和文獻所述的方法分別進行病毒滴度和抗原含量　　測定
　　1.5動物免疫將分離到的8株病毒接種于生長成單層的Ver,。細胞上,，病變達到75%以上進行收獲。對收獲液經560C30min滅活后,，測定抗原含量,。用100U/劑(北京科興生物制品有限公司標定)的收獲液腹腔免疫ICR小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)，采用0d,14d2針免疫,。第0d,14d,28d采血。4℃條件下離心，獲得血清,。 　　

　　1.6中和試驗采用微量板細胞病變法檢測中和抗體效價〔7.RJ,。血清樣本按2倍系列稀釋法進行稀釋，56℃水浴滅活30min,。血清稀釋后分別與100CCID5,。病毒等體積混合，于96孔板中置37qCC0,培養(yǎng)箱中中和2h,，加人Ver,。細胞懸液，細胞濃度為2x105個/ml,。置37cCCOZ培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d,顯微鏡下觀察細胞病變,，以能抑制50%細胞病變的最高稀釋度的倒數(shù)作為中和效價。試驗設立細胞對照,、血清對照和病毒對照,，同時設立回滴(回滴結果在32一320CCIDSO/0.05ml時，試驗成立),。檢測結果以1:8判斷為中和抗體陽性,。 　　

　　1.7交叉保護試驗將8個病毒株免疫后血清分別與A基因型、B3基因型,C4基因型病毒進行中和試驗,。將C4基因型毒株免疫血清分別對8個病毒株進行中和試驗,，C4基因型病毒來自北京科興生物制品有限公司。 　　

　　2結果
　　2.1檢測結果實驗室通過RT-PCR檢測,，8份標本結果均為EV71,。使用Ver。細胞培養(yǎng)中引起特殊腸道病毒致細胞病變效應,，表現(xiàn)為細胞圓縮,、分散、胞質內顆粒增加,，最后細胞自瓶壁脫落,。8份標本在Ver。細胞中產生明顯病變,，對其進行后續(xù)試驗,。 　　

　　2.2基因測序病毒滴度:8株病毒在Ver。細胞中均可有效增值,，但增值水平略有不同,。除1株(299")小于5.OLgCCIDSO/ml以外，其他7株均>5.SSLgCCIDSO/ml,?？乖?8株病毒經Vero細胞傳代后均能監(jiān)測到抗原，抗原含量均能達到100U/ml以上。