本研究對EV71的流行株進行分析,，在Vero細胞上的適應(yīng)性，以及病毒的抗原性和交叉保護試驗進行研究,，旨在能為疫苗的研制提供參考,。
材料與方法
1.1標(biāo)本采集根據(jù)衛(wèi)生部《手足口病預(yù)防控制指南(2009版)》的要求,，所有重癥和死亡病例均需采樣。此外,，以縣(區(qū))為單位,，每月最少需采集5例首次就診的普通病例標(biāo)本;采自7省(其中包括昆明市、普洱市,、楚雄州,、曲靖市、紅河州,、臨滄市,、昭通市)臨床診斷為手足口病患兒的2份疤疹液、7份咽拭子和1份糞便標(biāo)本采樣患者均為輕癥,，結(jié)局為痊愈,。確診方法為RT-PCR，分離細胞為RD,HEP,。
1.2標(biāo)本的實驗室檢測EV71腸道病毒分離,，RT-FCR試驗方法均按衛(wèi)生部《手足口病預(yù)防控制指南(2009版)》中《手足口病標(biāo)本采集及檢測技術(shù)方案》進行。
1.3VP1基因測序?qū)?株病毒標(biāo)本委托中國疾病預(yù)防控制中心進行測序,，應(yīng)用Mega軟件對所得序列進行校正處理,，與GenBank登陸序列進行比對，并構(gòu)建基因親緣性關(guān)系樹,。
1.4病毒滴度和抗原含量測定按照《手足口病預(yù)防控制指南(2009版)》和文獻所述的方法分別進行病毒滴度和抗原含量 測定
1.5動物免疫將分離到的8株病毒接種于生長成單層的Ver,。細胞上，病變達到75%以上進行收獲,。對收獲液經(jīng)560C30min滅活后,，測定抗原含量。用100U/劑(北京科興生物制品有限公司標(biāo)定)的收獲液腹腔免疫ICR小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司),，采用0d,14d2針免疫,。第0d,14d,28d采血。4℃條件下離心,，獲得血清,。
1.6中和試驗采用微量板細胞病變法檢測中和抗體效價〔7.RJ。血清樣本按2倍系列稀釋法進行稀釋,，56℃水浴滅活30min,。血清稀釋后分別與100CCID5。病毒等體積混合,，于96孔板中置37qCC0,培養(yǎng)箱中中和2h,，加人Ver。細胞懸液,，細胞濃度為2x105個/ml,。置37cCCOZ培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d,顯微鏡下觀察細胞病變,，以能抑制50%細胞病變的最高稀釋度的倒數(shù)作為中和效價。試驗設(shè)立細胞對照,、血清對照和病毒對照,，同時設(shè)立回滴(回滴結(jié)果在32一320CCIDSO/0.05ml時，試驗成立),。檢測結(jié)果以1:8判斷為中和抗體陽性,。
1.7交叉保護試驗將8個病毒株免疫后血清分別與A基因型、B3基因型,C4基因型病毒進行中和試驗,。將C4基因型毒株免疫血清分別對8個病毒株進行中和試驗,，C4基因型病毒來自北京科興生物制品有限公司。
2結(jié)果
2.1檢測結(jié)果實驗室通過RT-PCR檢測,，8份標(biāo)本結(jié)果均為EV71,。使用Ver。細胞培養(yǎng)中引起特殊腸道病毒致細胞病變效應(yīng),，表現(xiàn)為細胞圓縮、分散,、胞質(zhì)內(nèi)顆粒增加,，最后細胞自瓶壁脫落。8份標(biāo)本在Ver,。細胞中產(chǎn)生明顯病變,，對其進行后續(xù)試驗。
2.2基因測序病毒滴度:8株病毒在Ver,。細胞中均可有效增值,，但增值水平略有不同。除1株(299")小于5.OLgCCIDSO/ml以外,，其他7株均>5.SSLgCCIDSO/ml,。抗原含量:8株病毒經(jīng)Vero細胞傳代后均能監(jiān)測到抗原,，抗原含量均能達到100U/ml以上,。
