CXC趨化因子受體-4(CXCR4)是趨化因子基質細胞衍生因子一1(SDF-lcx)的特異受體.有研究表明,SDF-1cx/CXCR4軸可以促進細胞遷移「23],并且可以促進細胞存活,抑制細胞凋亡.本實驗旨在構建持續(xù)高表達CXCR4的慢病毒載體及慢病毒顆粒包裝鑒定,并探討體外細胞遷移,試圖通過慢病毒載體及SDF-1a/CXCR4軸使持續(xù)高表達的基因治療和細胞治療相結合.
材料與方法
1.材料:第3代4質粒慢病毒包裝系統(tǒng)來源于南開大學.大腸桿菌DH5a感受態(tài)購買自Tiangen公司.Taq酶、T4DNA連接酶,、限制性內切酶XbaT,EcoRT均購自TaKaRa公司.膠回收試劑盒購自Axygen公司.胎牛血清,、DMEM、胰酶一乙二胺四乙酸(EDTA),、青霉素,、鏈霉素均購自Gibc.公司,Transwell小室為Corning-Corstar3422(美國).
2.建立大鼠cDXA文庫:取50gSDnistar大鼠大腦組織,立即放入液氮中,加Trizol100g/L,碾磨均勻,4℃12000g離心10min,吸上清,室溫放置5min,按每1mlTrizol加0.2ml氯仿混勻,室溫放置3min,4℃12000g離心15min,吸上清重復4℃I2000g離心15min,吸上清,按1mlTrizol加0.5ml異丙醇,冰浴15min,40C12000g離心10min棄上清,用70%乙醇漂洗2次,加乙醇4℃7500g離心10min,棄上清,室溫干燥,適量焦磷酸二乙醋(DEPC)H,0溶解,一20℃保存.提取的RNA為模板,逆轉錄一聚合酶鏈反應(RT-PCR)獲得大鼠cDNA文庫,反應體系為:SxRT緩沖液8N.,l,10m,二dNTP2}1,OligoldT(20N,,m)2},1,模板10p,1,MMLV2p,1,DEPCHZ016p,1共40p,1,反應條件為:420C60min,950C5min.
3.PCR獲得目的基因CXCR4:以SDWistar大鼠為模板通過PCR獲得大鼠CXCR4基因,目的基因引物為:上游引物5'-GCTCTAGAGCATGGAAATATA-CACTTCGGAT-3';下游引物5'-GGAATTCC`I"1'AGC'1'G-GAGTGAAAACTTGAG-3';反應條件:DNA變性溫度為:98℃30s;退火溫度為63℃30s;延伸溫度為72℃90s.反應體系為:ddHzO34.61a,1,10xTag緩沖液5閃,dNTP4閃,上游引物2閃,下游引物2閃,cDNA模板2},l,Taq酶0.5p,1,總量為50μ1.
4.構建pCDHl-CXCR4-EF1-copGFP慢病毒載體質粒:用回收試劑盒回收CXCR.4基因片段,CXCR4純化后基因片段與pCDHl-MCS-EF1-copGFP用XbaI,EcoRI雙酶切,T4DNA連接酶將CXCR4基因連人pCDHl-MCS-EFl-copGFP,作用16h.此連接載體質粒命名為pCDHl-CXCR4-EFl-copGFP.
5.pCDHl-CXCR4-EF1-copGFP慢病毒載體質粒鑒定:取5閃連接產物轉化DHSa感受態(tài)細菌,恒溫箱370C培養(yǎng)14h,取單菌落370C,180、擴增14h,提取質粒,采用XbaI,EcoRI雙酶切鑒定,并測序鑒定.
6.HEK293T細胞和Hela細胞培養(yǎng):2種細胞均在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)基中加100U/ml青霉素,100.可L鏈霉素,10%胎牛血清(FBS),培養(yǎng)箱條件為370C,5%的COz.
7第3代4質粒系統(tǒng)慢病毒顆粒包裝:將pRsv-Rev,、pMDLG/pRRE,、pVSV一G和pCDHl-CXCR4-EFl-copGFP4質粒按照1:4:1:1的比例,采用PEI轉染法,PEI4倍體積,質粒1倍體積室溫混勻,靜置10min,轉染293T細胞,8h后換液,60h收集上清,離心2500r,5min,吸上清,0.45p.m的濾網過濾到50ml離心管中,超速離心40C,32000r,90min,棄上清,加雙無培養(yǎng)基4℃過夜重懸分裝,放置于一80℃保存.
分別取0,1,2,4,8閃病毒感染Hela細胞(1x105個),各3個復孔24h后換液,繼續(xù)37℃培養(yǎng)至48h,倒置相差顯微鏡觀察熒光.
8慢病毒顆粒滴度測定:按照流式細胞儀(BDFACSCalibur)要求處理細胞,鋪24孔板Hela細胞,每孔細胞1x105個,DMEM500},l,37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h然后從80℃冰箱每種病毒取2管超離的病毒按n}}閃/4x,1/8X1/16閃感染.感染前24孔板換液,X00閃D'1IE}}I(含40m彭L的二乙胺基乙基右旋糖昔),37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h,各組設對照組及3個復孔.慢病毒顆粒感染Hela細胞24h第3天)換液,然后繼續(xù)37℃培養(yǎng)至48h二感染后48h,按照流式細胞儀要求處理細胞,處理完細胞后通過流式細胞儀FL1通道測定綠色熒光,并根據(jù)結果計算病毒滴度TCID50/ml.
9.實時定量聚合酶鏈反應(Real-timePCR)檢測Hela細胞表達大鼠CXCR4mRNA水平:取感染表達CXCR4基因慢病毒顆粒72h的Hela細胞(Hela-CXCR4)及傳5代之后的Hela-CXCR4分別5x106個,磷酸鹽緩沖液(PBS)懸浮,離心沉淀后加1mlTrizol,劇烈振蕩以裂解細胞,提取總RNA并行RT-PCR,得到的PCR產物作為模板L4·,行Real-timePCR,引物分別為:甘油醛_3_磷酸脫氫酶(GAPDH):上游5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3',下游5'-TGGT-GAAGACGCCAGTGGA-3';CXCR4:上游5'-CATCT-TCTTGACTGGCATAGTGGGC-3’,下游5’-CTGCTGTA-AAGGTTGACGGTGTAG-3'.反應體系條件如下:第1步:95℃,5min,l個循環(huán).第2步:95℃,30s;56℃,30s;720C30s;40個循環(huán).第3步:720C,2min,1個循環(huán).
10.Transwell小室觀察細胞遷移:小室的直徑為6.5mm,小室孔徑為85N m分別將Hela細胞和Hela-CXCR4細胞置于小室上層,數(shù)量為1x10)個上層培養(yǎng)基為100閃,下層為600閃(分lJ}{加SDF'-1a0,50,100p,g/1.),細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)5h,上層未遷移到下層的細胞棉簽擦掉,下層細胞用4%的多聚甲醛固定30min,結晶紫染色20min、在顯微鏡下分另}}取5個視野計數(shù)細胞遷移數(shù)量.
材料與方法
1.材料:第3代4質粒慢病毒包裝系統(tǒng)來源于南開大學.大腸桿菌DH5a感受態(tài)購買自Tiangen公司.Taq酶、T4DNA連接酶,、限制性內切酶XbaT,EcoRT均購自TaKaRa公司.膠回收試劑盒購自Axygen公司.胎牛血清,、DMEM、胰酶一乙二胺四乙酸(EDTA),、青霉素,、鏈霉素均購自Gibc.公司,Transwell小室為Corning-Corstar3422(美國).
2.建立大鼠cDXA文庫:取50gSDnistar大鼠大腦組織,立即放入液氮中,加Trizol100g/L,碾磨均勻,4℃12000g離心10min,吸上清,室溫放置5min,按每1mlTrizol加0.2ml氯仿混勻,室溫放置3min,4℃12000g離心15min,吸上清重復4℃I2000g離心15min,吸上清,按1mlTrizol加0.5ml異丙醇,冰浴15min,40C12000g離心10min棄上清,用70%乙醇漂洗2次,加乙醇4℃7500g離心10min,棄上清,室溫干燥,適量焦磷酸二乙醋(DEPC)H,0溶解,一20℃保存.提取的RNA為模板,逆轉錄一聚合酶鏈反應(RT-PCR)獲得大鼠cDNA文庫,反應體系為:SxRT緩沖液8N.,l,10m,二dNTP2}1,OligoldT(20N,,m)2},1,模板10p,1,MMLV2p,1,DEPCHZ016p,1共40p,1,反應條件為:420C60min,950C5min.
3.PCR獲得目的基因CXCR4:以SDWistar大鼠為模板通過PCR獲得大鼠CXCR4基因,目的基因引物為:上游引物5'-GCTCTAGAGCATGGAAATATA-CACTTCGGAT-3';下游引物5'-GGAATTCC`I"1'AGC'1'G-GAGTGAAAACTTGAG-3';反應條件:DNA變性溫度為:98℃30s;退火溫度為63℃30s;延伸溫度為72℃90s.反應體系為:ddHzO34.61a,1,10xTag緩沖液5閃,dNTP4閃,上游引物2閃,下游引物2閃,cDNA模板2},l,Taq酶0.5p,1,總量為50μ1.
4.構建pCDHl-CXCR4-EF1-copGFP慢病毒載體質粒:用回收試劑盒回收CXCR.4基因片段,CXCR4純化后基因片段與pCDHl-MCS-EF1-copGFP用XbaI,EcoRI雙酶切,T4DNA連接酶將CXCR4基因連人pCDHl-MCS-EFl-copGFP,作用16h.此連接載體質粒命名為pCDHl-CXCR4-EFl-copGFP.
5.pCDHl-CXCR4-EF1-copGFP慢病毒載體質粒鑒定:取5閃連接產物轉化DHSa感受態(tài)細菌,恒溫箱370C培養(yǎng)14h,取單菌落370C,180、擴增14h,提取質粒,采用XbaI,EcoRI雙酶切鑒定,并測序鑒定.
6.HEK293T細胞和Hela細胞培養(yǎng):2種細胞均在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)基中加100U/ml青霉素,100.可L鏈霉素,10%胎牛血清(FBS),培養(yǎng)箱條件為370C,5%的COz.
7第3代4質粒系統(tǒng)慢病毒顆粒包裝:將pRsv-Rev,、pMDLG/pRRE,、pVSV一G和pCDHl-CXCR4-EFl-copGFP4質粒按照1:4:1:1的比例,采用PEI轉染法,PEI4倍體積,質粒1倍體積室溫混勻,靜置10min,轉染293T細胞,8h后換液,60h收集上清,離心2500r,5min,吸上清,0.45p.m的濾網過濾到50ml離心管中,超速離心40C,32000r,90min,棄上清,加雙無培養(yǎng)基4℃過夜重懸分裝,放置于一80℃保存.
分別取0,1,2,4,8閃病毒感染Hela細胞(1x105個),各3個復孔24h后換液,繼續(xù)37℃培養(yǎng)至48h,倒置相差顯微鏡觀察熒光.
8慢病毒顆粒滴度測定:按照流式細胞儀(BDFACSCalibur)要求處理細胞,鋪24孔板Hela細胞,每孔細胞1x105個,DMEM500},l,37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h然后從80℃冰箱每種病毒取2管超離的病毒按n}}閃/4x,1/8X1/16閃感染.感染前24孔板換液,X00閃D'1IE}}I(含40m彭L的二乙胺基乙基右旋糖昔),37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h,各組設對照組及3個復孔.慢病毒顆粒感染Hela細胞24h第3天)換液,然后繼續(xù)37℃培養(yǎng)至48h二感染后48h,按照流式細胞儀要求處理細胞,處理完細胞后通過流式細胞儀FL1通道測定綠色熒光,并根據(jù)結果計算病毒滴度TCID50/ml.
9.實時定量聚合酶鏈反應(Real-timePCR)檢測Hela細胞表達大鼠CXCR4mRNA水平:取感染表達CXCR4基因慢病毒顆粒72h的Hela細胞(Hela-CXCR4)及傳5代之后的Hela-CXCR4分別5x106個,磷酸鹽緩沖液(PBS)懸浮,離心沉淀后加1mlTrizol,劇烈振蕩以裂解細胞,提取總RNA并行RT-PCR,得到的PCR產物作為模板L4·,行Real-timePCR,引物分別為:甘油醛_3_磷酸脫氫酶(GAPDH):上游5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3',下游5'-TGGT-GAAGACGCCAGTGGA-3';CXCR4:上游5'-CATCT-TCTTGACTGGCATAGTGGGC-3’,下游5’-CTGCTGTA-AAGGTTGACGGTGTAG-3'.反應體系條件如下:第1步:95℃,5min,l個循環(huán).第2步:95℃,30s;56℃,30s;720C30s;40個循環(huán).第3步:720C,2min,1個循環(huán).
10.Transwell小室觀察細胞遷移:小室的直徑為6.5mm,小室孔徑為85N m分別將Hela細胞和Hela-CXCR4細胞置于小室上層,數(shù)量為1x10)個上層培養(yǎng)基為100閃,下層為600閃(分lJ}{加SDF'-1a0,50,100p,g/1.),細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)5h,上層未遷移到下層的細胞棉簽擦掉,下層細胞用4%的多聚甲醛固定30min,結晶紫染色20min、在顯微鏡下分另}}取5個視野計數(shù)細胞遷移數(shù)量.
