肝癌患者的預(yù)后差,手術(shù)切除被認(rèn)為是根治肝癌的最好手段,但術(shù)后容易發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,然而對(duì)于肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移目前治療手段有限上~.我們前期的研究表明:鈣蛋白酶小亞基I(Capn4)的表達(dá)隨肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)2廠但其具體機(jī)制尚不清楚,本研究旨在探討Capn4促進(jìn)肝癌侵襲與轉(zhuǎn)移的機(jī)制.
一,、材料與方法
1.材料:HCCLM6由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所樊嘉教授惠贈(zèng);pGMLV-shRNA-Capn4和pGMI,.V-cDV}-Capn4由卜海吉滿生物科技有限公司合成.
2.細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒感染:HCCLVI6,Hep3B細(xì)胞在含10%胎牛Il1L清DMEVI與MEA-T培養(yǎng)基中培養(yǎng),感染方法按照義獻(xiàn).,、48h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)與紅色熒光蛋白(RFP)表達(dá)判斷轉(zhuǎn)染效率.
3逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè):細(xì)胞總RA提取參照Trizol試劑盒說明書進(jìn)行操作;Capn4,、波動(dòng)蛋自(Vimentin),E一鈣薪蛋白(E-cadherin)及甘油醛_3_磷酸脫氫酶(GAPDH)引物由[海申能博彩生物有限公司合成;逆轉(zhuǎn)錄參照試劑盒說明書進(jìn)行.
4.esternblot分析與免疫組織化學(xué):免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化物酶(SP)法,胞膜見棕褐色顆粒為E-cadherin表達(dá)陽性細(xì)胞,而細(xì)胞質(zhì)見棕褐色顆粒為Capn4與Vimentin表達(dá)陽性細(xì)胞.
5.免疫熒光檢測(cè):培養(yǎng)至細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行免疫熒光染色,熒光顯微鏡200倍視野下觀察.
二、結(jié)果
1.慢病毒感染建立不同Capn4表達(dá)的肝癌細(xì)胞株:慢病毒轉(zhuǎn)染48h后的熒光照片顯示轉(zhuǎn)染滿意,轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分別命名為HCCLM6-vshCapn4}Hep3B-Capn4一.D}-RT-PCR,、western檢測(cè)顯示下調(diào)和上調(diào)Capn4結(jié)果滿意.
2.Transvcell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵襲能力:通過計(jì)數(shù)各組穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)并進(jìn)行比較后,發(fā)現(xiàn)Capn4下調(diào)后,月和翻細(xì)胞穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)明h;咸少:而在}=i}]Ca}}n-t表達(dá)的Hep3B細(xì)胞,其浸襲與轉(zhuǎn)移能力明顯升高.
3調(diào)節(jié)Cepn=1表達(dá)后細(xì)胞形態(tài)、上皮與間皮標(biāo)記改變:與HCCLM6-vshCapn4及Hep3B-Vlock比較,較多HCCLM6-Mock與Hep3B-cD1tA-Capn4細(xì)胞呈梭形,而RT-PCR與}Uester 1Mcat檢則的結(jié)果表明扦嘻HCCI.l6一,、shCapn-1與He}a}B-)lock細(xì)胞中,E-cadh.川r表達(dá)較HCCL}16-Mock與Hep3B-cD1}-Capn}l高,而}imentin卻呈相反趨勢(shì),免疫熒光結(jié)果也支持以上結(jié)果.
4.免疫組織化學(xué)檢測(cè)肝癌組織中Cape與E-cadherin蛋白的表達(dá):Capri4蛋白陽性染色主要定位于癌細(xì)胞胞質(zhì),呈棕黃色或棕褐色,染色均一E一二dher工Il定位于細(xì)胞膜在}.t31)n}高表達(dá)的肝癌組織,可見到絕大部分E-cadherin表達(dá)明顯卜調(diào),而}imentin表達(dá)上調(diào)幾份.
討論
Calpain是由大小2個(gè)亞基共同構(gòu)成,28000的Capn4是其調(diào)節(jié)性小亞基,與80000的大亞基以異二構(gòu)體的形式存在Calpain是1個(gè)胞質(zhì)富集的蛋自酶,能清除很多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)和結(jié)構(gòu)蛋白,涉及廣泛的細(xì)胞功能,包括:細(xì)胞侵襲運(yùn)動(dòng),、增殖、凋亡等近年來,Calpain與腫瘤的關(guān)系口益受到重視.
我們的前期研究提示Capn4蛋白在人肝癌細(xì)胞浸襲轉(zhuǎn)移中有著重要的作用5一惡性腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ).首先是腫瘤細(xì)胞擺脫細(xì)胞間的赫附作用即失去接觸性抑制E-cadherin是1種跨膜糖蛋白,由723一748個(gè)氨基酸組成,廣泛分布于上皮細(xì)胞中,表達(dá)下降時(shí)細(xì)胞間赫附作用減弱,腫瘤細(xì)胞易于脫離原發(fā)灶6」本研究結(jié)果顯示,鄰近癌灶的正常肝細(xì)胞膜表面強(qiáng)烈均質(zhì)表達(dá)E-cadherin,而其在肝癌細(xì)胞膜上染色多不均勻,偶見細(xì)胞質(zhì)中模糊,、彌散染色,且E-cadherin在肝癌組織中的陽性率遠(yuǎn)低于正常肝組織有研究結(jié)果顯示,肝癌組織中E-cadherin的表達(dá),除明顯弱于正常肝組織外,還與多種臨床病理因素相關(guān)如門脈癌栓,肝癌細(xì)胞低分化等,提示E-cadherin表達(dá)減弱與肝癌細(xì)胞的低分化趨向,、浸潤性密切相關(guān)[7]進(jìn)而,本研究結(jié)果顯idsE-cadherin與Capn4表達(dá)呈負(fù)相關(guān),而和Vimentin呈相同趨勢(shì)提示高表達(dá)Capn4可能下調(diào)E-cadherin的表達(dá),Capn4的這一作用可能與其參與1秀導(dǎo)肝細(xì)胞癌L皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān).
參考文獻(xiàn)
湯釗猷. 原發(fā)性肝癌的研究進(jìn)展[J].中國腫瘤臨床,1998.137-142.
DS,Dai Z,Zhou J. Capn4 overexpression underlies tumor invasion and metastasis after liver transplantation for hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2009,(2):461-475.doi:10.1002/hep.22638.
Shi GM,Ke AW,Zhou J. CD151 modulates expression of matrix metalloproteinase 9 and promotes neoangiogenesis and progression of hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2009.183-196.
Storr S J,Carragher NO,frame MC. The calpain system and cancer[J].Nature Reviews Cancer,2011.365-374.
柏斗勝,樊嘉,代智. 肝癌肝移植相關(guān)定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2007,(12):1517- 1519.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2007.12.024.
Giannelli G. The epithelial-mesenchymal transition:fact or fiction in cancer[J].Hepatology,2009.1344-1346.
van Zijl F,Zulehner G,Petz M. Epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma[J].FUTURE ONCOLOGY,2009.1169-1179.
一,、材料與方法
1.材料:HCCLM6由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所樊嘉教授惠贈(zèng);pGMLV-shRNA-Capn4和pGMI,.V-cDV}-Capn4由卜海吉滿生物科技有限公司合成.
2.細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒感染:HCCLVI6,Hep3B細(xì)胞在含10%胎牛Il1L清DMEVI與MEA-T培養(yǎng)基中培養(yǎng),感染方法按照義獻(xiàn).,、48h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)與紅色熒光蛋白(RFP)表達(dá)判斷轉(zhuǎn)染效率.
3逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè):細(xì)胞總RA提取參照Trizol試劑盒說明書進(jìn)行操作;Capn4,、波動(dòng)蛋自(Vimentin),E一鈣薪蛋白(E-cadherin)及甘油醛_3_磷酸脫氫酶(GAPDH)引物由[海申能博彩生物有限公司合成;逆轉(zhuǎn)錄參照試劑盒說明書進(jìn)行.
4.esternblot分析與免疫組織化學(xué):免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化物酶(SP)法,胞膜見棕褐色顆粒為E-cadherin表達(dá)陽性細(xì)胞,而細(xì)胞質(zhì)見棕褐色顆粒為Capn4與Vimentin表達(dá)陽性細(xì)胞.
5.免疫熒光檢測(cè):培養(yǎng)至細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行免疫熒光染色,熒光顯微鏡200倍視野下觀察.
二、結(jié)果
1.慢病毒感染建立不同Capn4表達(dá)的肝癌細(xì)胞株:慢病毒轉(zhuǎn)染48h后的熒光照片顯示轉(zhuǎn)染滿意,轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分別命名為HCCLM6-vshCapn4}Hep3B-Capn4一.D}-RT-PCR,、western檢測(cè)顯示下調(diào)和上調(diào)Capn4結(jié)果滿意.
2.Transvcell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵襲能力:通過計(jì)數(shù)各組穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)并進(jìn)行比較后,發(fā)現(xiàn)Capn4下調(diào)后,月和翻細(xì)胞穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)明h;咸少:而在}=i}]Ca}}n-t表達(dá)的Hep3B細(xì)胞,其浸襲與轉(zhuǎn)移能力明顯升高.
3調(diào)節(jié)Cepn=1表達(dá)后細(xì)胞形態(tài)、上皮與間皮標(biāo)記改變:與HCCLM6-vshCapn4及Hep3B-Vlock比較,較多HCCLM6-Mock與Hep3B-cD1tA-Capn4細(xì)胞呈梭形,而RT-PCR與}Uester 1Mcat檢則的結(jié)果表明扦嘻HCCI.l6一,、shCapn-1與He}a}B-)lock細(xì)胞中,E-cadh.川r表達(dá)較HCCL}16-Mock與Hep3B-cD1}-Capn}l高,而}imentin卻呈相反趨勢(shì),免疫熒光結(jié)果也支持以上結(jié)果.
4.免疫組織化學(xué)檢測(cè)肝癌組織中Cape與E-cadherin蛋白的表達(dá):Capri4蛋白陽性染色主要定位于癌細(xì)胞胞質(zhì),呈棕黃色或棕褐色,染色均一E一二dher工Il定位于細(xì)胞膜在}.t31)n}高表達(dá)的肝癌組織,可見到絕大部分E-cadherin表達(dá)明顯卜調(diào),而}imentin表達(dá)上調(diào)幾份.
討論
Calpain是由大小2個(gè)亞基共同構(gòu)成,28000的Capn4是其調(diào)節(jié)性小亞基,與80000的大亞基以異二構(gòu)體的形式存在Calpain是1個(gè)胞質(zhì)富集的蛋自酶,能清除很多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)和結(jié)構(gòu)蛋白,涉及廣泛的細(xì)胞功能,包括:細(xì)胞侵襲運(yùn)動(dòng),、增殖、凋亡等近年來,Calpain與腫瘤的關(guān)系口益受到重視.
我們的前期研究提示Capn4蛋白在人肝癌細(xì)胞浸襲轉(zhuǎn)移中有著重要的作用5一惡性腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ).首先是腫瘤細(xì)胞擺脫細(xì)胞間的赫附作用即失去接觸性抑制E-cadherin是1種跨膜糖蛋白,由723一748個(gè)氨基酸組成,廣泛分布于上皮細(xì)胞中,表達(dá)下降時(shí)細(xì)胞間赫附作用減弱,腫瘤細(xì)胞易于脫離原發(fā)灶6」本研究結(jié)果顯示,鄰近癌灶的正常肝細(xì)胞膜表面強(qiáng)烈均質(zhì)表達(dá)E-cadherin,而其在肝癌細(xì)胞膜上染色多不均勻,偶見細(xì)胞質(zhì)中模糊,、彌散染色,且E-cadherin在肝癌組織中的陽性率遠(yuǎn)低于正常肝組織有研究結(jié)果顯示,肝癌組織中E-cadherin的表達(dá),除明顯弱于正常肝組織外,還與多種臨床病理因素相關(guān)如門脈癌栓,肝癌細(xì)胞低分化等,提示E-cadherin表達(dá)減弱與肝癌細(xì)胞的低分化趨向,、浸潤性密切相關(guān)[7]進(jìn)而,本研究結(jié)果顯idsE-cadherin與Capn4表達(dá)呈負(fù)相關(guān),而和Vimentin呈相同趨勢(shì)提示高表達(dá)Capn4可能下調(diào)E-cadherin的表達(dá),Capn4的這一作用可能與其參與1秀導(dǎo)肝細(xì)胞癌L皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān).
參考文獻(xiàn)
湯釗猷. 原發(fā)性肝癌的研究進(jìn)展[J].中國腫瘤臨床,1998.137-142.
DS,Dai Z,Zhou J. Capn4 overexpression underlies tumor invasion and metastasis after liver transplantation for hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2009,(2):461-475.doi:10.1002/hep.22638.
Shi GM,Ke AW,Zhou J. CD151 modulates expression of matrix metalloproteinase 9 and promotes neoangiogenesis and progression of hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2009.183-196.
Storr S J,Carragher NO,frame MC. The calpain system and cancer[J].Nature Reviews Cancer,2011.365-374.
柏斗勝,樊嘉,代智. 肝癌肝移植相關(guān)定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2007,(12):1517- 1519.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2007.12.024.
Giannelli G. The epithelial-mesenchymal transition:fact or fiction in cancer[J].Hepatology,2009.1344-1346.
van Zijl F,Zulehner G,Petz M. Epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma[J].FUTURE ONCOLOGY,2009.1169-1179.
