一,、資料與方法
1.研究對象:根據(jù)血生物化學(xué)、腹部彩色多普勒超聲,、胃鏡檢查確診的乙型肝炎肝硬化患者10例,其中HBV病毒載量(1.0~⒐9)×10的3次方拷貝/ml者6例,(1.0~⒐9)×10的6次方拷貝/ml者4例,正常對照6例均為本科室志愿者,HBVDNA未檢測到,。清晨空腹采血10ml,人無菌離心管,2500r/min離心15min,-20℃保存。
2.實驗材料及儀器:人MK白血病細(xì)胞株Dami購自上海信然生物科技有限公司;DMSO購自北京索萊寶公司;PMPI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司;細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測試劑盒CCK8購自武漢博士德生物科技有限公司;·血小板生成素購自美國PEPROTECH公司;二氧化碳孵育箱購自美國Them公司;雙目倒置顯微鏡購自日本Nikon公司;倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司;酶標(biāo)儀購自鄭州安圖生物科技有限公司,。
3.細(xì)胞培養(yǎng):培養(yǎng)細(xì)胞為人MK白血病細(xì)胞株Dami,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10的6次方個/ml,置于乃25cm2培養(yǎng)瓶中,加人含10%胎牛血清的培養(yǎng)基6~7ml,置于37℃,5%二氧化碳孵育箱中培養(yǎng),2~3d傳代一次,取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行各項試驗,每組內(nèi)每例各設(shè)3個復(fù)孔,。
4.CCK-8檢測細(xì)胞增殖抑制:CCK-8,是一種基于2-(2-甲氧基-4-硝基苯酚)-3-（4-硝基苯酚)（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒,在電子載體的作用下被細(xì)胞線粒體中的一些脫氫酶還原變?yōu)槌赛S色。細(xì)胞增殖越多越快,則顏色越深;細(xì)胞毒性越大,則顏色越淺,。因而檢測CCK-8吸光度值與巨核細(xì)胞集落形成數(shù)測定可反映巨核細(xì)胞增殖情況,。收集對數(shù)期細(xì)胞,接種至96孔板,每孔加入200ul細(xì)胞懸液,鋪板使待測細(xì)胞密度調(diào)至10的3次方~10的4次方個/孔,5%二氧化碳,37℃孵育24h至細(xì)胞單層鋪滿孔底。設(shè)立正常對照組,HBV為10的6次方拷貝/ml組;HBV為10的3次方拷貝/ml組,并同時設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基,、CCK-8),對照孔(細(xì)胞,、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液,、CCK-8,每孔除加RMPI1640培養(yǎng)液180ul外,正常對照組加正常人血清20ul,10的3次方拷貝/ml組,、10的6次方拷貝/ml組各加人相應(yīng)血清20ul5%二氧化碳,37℃孵育48h,倒置顯微鏡下觀察,每孔加人20ulCCK-8溶液,分別于30min,1、2,、3,、4h使用酶標(biāo)儀在笱450nm波長處檢測每孔的吸光度值。
5.甲基纖維素法培養(yǎng)骨髓MK集落:培養(yǎng)體系為:10%的β巰基乙醇,40%體積分?jǐn)?shù)為0.9%的甲基纖維素,30%的胎牛血清,10%的10ng/ml促血小板生成素及10ng/ml的GM-CSF,1%細(xì)胞懸液,總量為1ml接種至24孔板中,將培養(yǎng)基置于37℃,濕度100%,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12d后,細(xì)胞用95%乙醇固定,用乙酰膽堿酯酶染色法和蘇木素復(fù)染鑒定骨髓MK集落,顯微鏡下計數(shù)骨髓NIK集落,。集落標(biāo)準(zhǔn)為大于或等于3個MK,。
6,流式檢測骨髓MKCD41的表達(dá):取對數(shù)期細(xì)胞,按1×10的6次方個/ml接種于6孔板內(nèi),每孔2ml,37℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24h,使細(xì)胞均一化。分為3組,分別為正常對照組,HBVDNA為10的3次方拷貝/ml組,HBVDNA為10的6次方拷貝/ml組,。每組分別用不含血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng),依次加人正常人血清,病毒載量為10的3次方拷貝/ml的患者血清,病毒載量為10的6次方拷貝/ml的患者血清各200ul,TPO50ng/ml,每周兩次半量換液,。培養(yǎng)10d后應(yīng)用流式檢測CD41的表達(dá)。
7,統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù),計數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗;滿足單因素方差分析條件進(jìn)行單因素方差分析,然后進(jìn)行MultipleComparisonsLDS兩組之間分析,比較兩組之間的差異,。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,。
二、結(jié)果
1.細(xì)胞增殖抑制的檢測:10的3次方拷貝/ml組,、10的6次方拷貝/ml組的CCK-8悶吸光度值分別為0.267±0.156,、0.246±0.179,明顯低于正常對照組的0.402±0.168,兩組比較,F=5.029,P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;10的3次方拷貝/ml組、10的6次方拷貝/ml組的MK的集落數(shù)明顯減低,分別為31.5±3.0,、27.4±3.1,與正常對照組的49.0±3.4比較,F=132.142,P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,表明不同濃度乙型肝炎病毒載量影響體外MK增殖,。
2．流式細(xì)胞儀檢測MKCD41表達(dá):10的3次方拷貝/ml組、10的6次方拷貝/ml組MK明顯增加,CD41陽性率分別為57.78%±19.53%,、79.90%±16.90%,與正常對照組的36.46%±20.94%比較,t值分別為3.865,、2.191,P均<0.05,。差異有統(tǒng)計學(xué)意義;10的3次方拷貝/ml組和正常對照組明顯高于同型對照組的1.16%±0.36%,t值分別為3.865、2.191,P均<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;10的3次方拷貝/ml組CD41表達(dá)低于10的6次方拷貝/ml組,t=2.273,P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,表明不同濃度乙型肝炎病毒載量影響體外MK分化,。
三,、討論
外周血血小板是由骨髓中的MK增殖分化而來,在增殖過程中MK按原始、幼稚,、顆粒、產(chǎn)血小板MK順序逐漸成熟,最終脫去血小板變成裸核而消失,。骨髓MK生成血小板是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程,包括造血干細(xì)胞發(fā)育為巨核祖細(xì)胞,又進(jìn)一步分化為成,、熟的MK,并釋出血小板。Dami血細(xì)胞是人MK白血病細(xì)胞株,具有很多骨髓MK的形態(tài)和生物學(xué)方面的特征,當(dāng)被誘導(dǎo)分化時,優(yōu)先分化成MK,。與其他MK株相比,Dami細(xì)胞表達(dá)WIK具有的表面標(biāo)志物,如血小板表面糖蛋白復(fù)合物,、血小板表面糖蛋白Ib(GPIb)、血小板表面糖蛋白A等,并且表面表達(dá)有TPO受體c-Mpl,能夠被誘導(dǎo)增殖和分化而產(chǎn)生c-Mpl板,。由于目前獲得正常人骨髓MK較為困難,且尚缺乏體外培養(yǎng)正常人骨髓NIK的成熟技術(shù),因此Dami是體外研究MK生長發(fā)育及其調(diào)控的較理想模型,。
肝硬化時普遍存在外周血小板減少,但血小板減少原因目前尚不十分清楚。既往認(rèn)為肝硬化患者由于脾大及脾功能亢進(jìn),脾臟病理性腫大阻留,、吞噬血小板,導(dǎo)致血小板減少,。也有人認(rèn)為慢性活動性乙型肝炎伴自身免疫功能紊亂,血小板相關(guān)免疫球蛋白水平升高,使血小板免疫破壞增加,致血小板減少。自從發(fā)現(xiàn)TPO以來,越來越多的研究表明,肝硬化患者血小板減少可能與肝硬化TPO降低有關(guān),TPO降低導(dǎo)致MK分化,、成熟障礙,從而影響血小板生成,。Pradella等檢測肝硬化患者血清TPO、網(wǎng)織血小板,、糖盞蛋白,結(jié)果表明肝硬化患者較正常人血清TPO水平明顯下降,網(wǎng)織血小板絕對值降低,糖盞蛋白明顯增加,提出肝硬化患者血小板降低與血小板清除增加,、生成減少有關(guān)。而Sanjo等研究結(jié)果顯示肝硬化患者血清TPO水平較正常對照組顯著升高,。Kajihara等則發(fā)現(xiàn)在肝硬化患者和健康人之間,TPO水平并沒有差別,認(rèn)為πV的缺乏并不是引起肝硬化血小板減少癥的主要因素,。因此推測乙型肝炎肝硬化血小板減少的主要原因,除TPO外可能還有其他原因參與。
乙型肝炎肝硬化患者體內(nèi)存在乙型肝炎病毒,有研究表明,乙型肝炎病毒可改變造血微環(huán)境,尤其是對骨髓基質(zhì)細(xì)胞的影響,而骨髓基質(zhì)細(xì)胞是骨髓HSC/祖細(xì)胞生長發(fā)育的重要微環(huán)境,其對造血調(diào)控起著非常重要的作用,?；|(zhì)細(xì)胞通過與HsC/IIPC接觸和分泌多種細(xì)胞因子如干細(xì)胞生長因子、TPO,、白細(xì)胞介素6(IL-6)和IL-11等重要造血細(xì)胞因子,調(diào)控HSC/HPC的增殖,、分化,維持骨髓正常造血。當(dāng)機(jī)體感染HBV后,病毒可通過對骨髓基質(zhì)細(xì)胞影響,、干擾機(jī)體造血機(jī)能,。但對于肝硬化患者不同病毒載量是否影響MK增殖、分化,目前國內(nèi)外鮮見報道,。
本實驗10的3次方拷貝/ml組,、10的6次方拷貝/ml組CCK-8的吸光度值和MK集落生成數(shù)均明顯低于正常對照組,且10的3次方拷貝/ml組MK集落生成數(shù)高于10的6次方拷貝/ml組,表明不同濃度乙型肝炎病毒載量影響體外MK增殖,病毒載量越大,其對骨髓MK增殖抑制作用越大,。
CD41既是GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物的單克隆抗體又是GPⅡb的單克隆抗體,其是MK合成的與血小板聚集功能相關(guān)的糖蛋白,是特異性分化抗原,可持續(xù)表達(dá)到血小板,且含量隨MK的分化成熟而不斷增加,生理狀況下隨著MKDNA倍體的增加而表達(dá)增高。測定CD41的活性能可靠地獲知血小板GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物的活性,因此可通過檢測MKCD41的表達(dá)來檢測MK分化程度,。本實驗10的3次方拷貝/ml組,、10的6次方拷貝/ml組MKCD41表達(dá)明顯增加,與正常對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)(P<0.05),10的3次方拷貝/ml組CD41表達(dá)低于10的6次方拷貝/ml組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),表明不同濃度乙型肝炎病毒載量影響體外MK分化。
因此推測,乙型肝炎肝硬化患者在抗病毒治療后,有可能減輕乙型肝炎病毒對骨髓MK增殖,、分化的影響,增加外周血小板量,減輕低血小板血癥,。
