細胞膜脂質(zhì)雙層上G蛋白偶聯(lián)受體的計算機模擬圖(Medi-Mation Ltd / Photo Researchers)
[towersimper：本文為譯文,，僅用作研究之用,，不得用作商業(yè)開發(fā)，轉(zhuǎn)載請標明翻譯者towersimper和原文作者Robert Michael Stroud]
在所有已知蛋白中,，膜蛋白差不多占據(jù)了40%,，包括受體,，通道蛋白，信號分子,，是細胞通信所必需的,，如果膜蛋白功能失效，則會導致很多疾病,。然而迄今為止,，在已知的蛋白結(jié)構總量當中，膜蛋白只占據(jù)一小部分,?；诮Y(jié)構的設計是開發(fā)藥物的一種強有力的武器，且藥物要能有效治療,，作用位點就必須精準,，且副作用最小化。X射線晶體學,，仍然是解決不同大小的蛋白的原子結(jié)構的唯一通用方法,。然而，由于非常難于制備高純度的膜蛋白和得到它們的晶體,，該方法也無從施展,。
這是一個實際的問題，因為親水性蛋白,，如位于細胞質(zhì)的那些蛋白,，在溶液中能比較容易地結(jié)晶，但是膜蛋白含有位于脂質(zhì)層(lipid layer)的疏水性區(qū)域,。為了維持它們的形狀,，這些親脂性的結(jié)構域就必須被類似于天然細胞膜上的組分所包圍，這就使得人們很難得到衍射性能不錯的晶體,。不過,，在過去兩年內(nèi)，一些技術上的進步使得人們有能力確定膜蛋白的結(jié)構,。
提取與穩(wěn)定化
技術上的進步是對結(jié)晶過程的多個步驟進行改良的結(jié)果,。一個例子來自斯克利普斯研究所的Raymond Stevens和他的同事們，他們發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)在確定對腎上腺素(adrenaline)作出反應的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor, GPCR)的結(jié)構中是必需的,。當Stevens試圖使GPCR結(jié)晶時,，他發(fā)現(xiàn)膽固醇分子是晶體形成所必需的，而且從晶體結(jié)構上看,，膽固醇起著GPCR二聚體分子之間膠黏劑的作用[1],。這也可從下面的觀察結(jié)果中得到結(jié)構上的解釋：在細胞膜上，膽固醇是受體GPCR形成二聚體和發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導功能所必需的。
使用去污劑(detergent)分離膜蛋白對于它們能夠形成晶體的問題上產(chǎn)生著深刻的影響,。典型的去污劑,，如
β-辛基谷氨酸(beta-octyl glucoside)，能夠產(chǎn)生較大的脂質(zhì)球團(globule),，也被稱作微團(micelle),，它含有一個磷脂單層，且磷脂單鏈尾部面朝內(nèi),。大的微團增加脂質(zhì)對蛋白的比值,，使得膜蛋白很難聚集到一個適合晶體形成的密度。Stevens與一些化學家合作設計出新的去污劑,，比如基于膽酸鹽的兩性分子,，能產(chǎn)生較小的微團，從而膜蛋白分子更緊密地聚集,，從而形成更好的晶體[2],。
第三個改善晶體形成的因素是蛋白的起源。蛋白產(chǎn)生的數(shù)量和質(zhì)量依賴于有機體,，細胞類型,，啟動子和用來表達蛋白的載體。然而,，人們還無法預先知曉哪些生物種類或哪種表達方法能產(chǎn)生性能較好的蛋白,。鑒于很多膜蛋白在多種生物種類中表達，應當對同源基因進行測試和篩選以便找到最適合形成晶體的的蛋白[3],。研究人員如今可以使用高通量的方法在大量的蛋白表達和純化條件中篩選出最佳條件,，從而有助于加快找到合適的且能形成晶體的實驗過程[4]。
這種優(yōu)化方法的一個顯著性例子來自洛克菲勒大學羅德-馬克金農(nóng)(Rod MacKinnon)實驗室,。因為對CLC氯離子轉(zhuǎn)運蛋白的機制感興趣,，該實驗室的研究人員通過在蛋白30個位點中的每個位點上用一個蛋氨酸替換一個自然條件下存在的氨基酸，從而改善從他們制備的晶體中得到的數(shù)據(jù),。他們?nèi)缓髮⒅卦匚鴺擞涍@些蛋氨酸，以便幫助更精確地驗證這個蛋白的原子結(jié)構,。
再設計蛋白
砍掉蛋白的末端是人們經(jīng)常使用的一個使得細胞質(zhì)中的蛋白更容易形成晶體的小技巧,。類似地，去掉膜蛋白的親水性區(qū)域和柔韌性的末端也促進晶體形成,。人類水通道蛋白4(human aquaporin 4, HA4)與肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)類似的自身免疫疾病視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitis optica)相關聯(lián),。通過切掉HA4的柔韌性區(qū)域，我們獲得了一個高清晰的晶體結(jié)構[5],。另一個方法就是引入突變,，改變蛋白序列從而穩(wěn)定某種特定的蛋白構象，并經(jīng)篩選后找出可能固定其他柔韌性區(qū)域的突變。
而采用更劇烈的設計方法---大規(guī)?；蛟僭O計(wholesale gene redesign)---使得通過其他方法不能開展研究的蛋白的結(jié)構解析成為可能,。一些氨基酸有多個密碼子---核苷酸三聯(lián)體組成遺傳密碼---以及不同生物種類對產(chǎn)生同一個蛋白的不同密碼子有偏好。由于密碼子偏好影響蛋白翻譯效率,，從一個有機體中取得一基因,，將它在另一個有機體中進行表達，有可能改善蛋白生產(chǎn),。我們最近設計了一個鐮狀瘧原蟲(Plasmodium falciparum)水通道蛋白的基因,，讓它在大腸桿菌(Escherichia coli)的質(zhì)膜組分中表達。我們通過使用大腸桿菌偏好的密碼子來改變鐮狀瘧原蟲的基因序列,，這一過程也稱作密碼子最優(yōu)化,。盡管DNA序列發(fā)生變化，但其表達的蛋白質(zhì)序列仍然保持不變[6],。
最近幾年技術的快速發(fā)展使得人們確定膜蛋白的結(jié)構和它們怎樣發(fā)揮作用的前景更加光明,。我們現(xiàn)在能開始探討一些跨膜過程的機制，這些機制與多種疾病相關聯(lián),，如癌癥,，糖尿病，精神分裂癥(schizophrenia)和抑郁癥,，而以前在這些疾病中,，膜蛋白的信號轉(zhuǎn)導功能缺陷在原子結(jié)構水平上進行研究難度非常大。\\生命科學論壇\\ towersimper 編譯
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References：
1. V. Cherezov et al., “High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor,” Science, 318:1258-65, 2007.
2. Q. Zhang et al., “Designing facial amphiphiles for the stabilization of integral membrane proteins,” Angew Chem Int Ed Engl, 46:7023-25, 2007.
3. E.B. Gonzales et al., “Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors,” Nature, 460:599-604, 2009.
4. M. Li et al., “Selecting optimum eukaryotic integral membrane proteins for structure determination by rapid expression and solubilization screening,” J Mol Biol, 385:820-30, 2009. Free F1000 Evaluation
5. J.D. Ho et al., “Crystal structure of human aquaporin 4 at 1.8 A and its mechanism of conductance,” PNAS, 106:7437-42, 2009.
6. Z. E. Newby et al., “Crystal structure of the aquaglyceroporin PfAQP from the malarial parasite Plasmodium falciparum,” Nat Struct Mol Biol, 15:619-25, 2008.
Source：Robert Michael Stroud. An Insoluble Problem? The challenges of crystallizing membrane proteins—and how they’re being overcome. The Scientist:Vol 25(5): 49, May 2011 | http://www.the-scientist.com/article/display/58135/
