蛋白質(zhì)組 (Proteome) 術(shù)語由澳大利亞科學(xué)家1994年提出并被定義為：基因組 (Genome) 表達(dá)的全部蛋白質(zhì),。隨著幾種模式生物基因組測(cè)序的完成，蛋白質(zhì)組學(xué) (Proteomics) 成為功能基因組時(shí)代重要的研究手段,。與一些簡(jiǎn)單的原核生物相比,，植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究相對(duì)落后，在擬南芥 (Arabidopsis thaliana) 和水稻 (Oryza sativa) 的基因組序列公布后,，植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究逐漸活躍起來,。1999年首篇植物蛋白質(zhì)組學(xué)綜述了此前蛋白質(zhì)組學(xué)在植物方面的研究進(jìn)展，其中大部分研究還不曾涉及用質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白質(zhì),，如今質(zhì)譜已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要工具,。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究范圍的拓展，不再局限于單純分離新的蛋白質(zhì),，蛋白質(zhì)組學(xué)現(xiàn)已成為描述和分析一個(gè)生物體的蛋白質(zhì),，蛋白質(zhì)間的相互作用以及蛋白質(zhì)修飾的學(xué)科。
水稻基因組由430 Mb 個(gè)堿基組成,，在禾谷類中較小,，由于其基因易于操作，與其他單子葉植物有共線性,，從而成為單子葉植物研究的模式生物,。2002年水稻栽培品種秈稻和粳稻基因組框架圖繪制完成，同年底水稻基因組精細(xì)圖譜完成,，然而從 mRNA 轉(zhuǎn)錄到蛋白質(zhì)的翻譯并不是簡(jiǎn)單的對(duì)應(yīng),，真正執(zhí)行生命功能的是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)組學(xué)則將基因組序列信息與特定組織器官中蛋白質(zhì)的種類連接起來,。目前水稻蛋白質(zhì)組學(xué)的研究逐漸掀起熱潮,。
1 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法
蛋白質(zhì)組學(xué)經(jīng)典的研究方法是雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳 (Two-dimensional PAGE，簡(jiǎn)稱 2-DE)技術(shù),。1975年 O'Farrell 首次使用該技術(shù)分離大腸桿菌的蛋白質(zhì),，后來發(fā)展的固相 pH 梯度 (IPG) 技術(shù)，解決了 2-DE 中 pH 梯度的不穩(wěn)定性,，Gorg 等詳述了聚焦參數(shù)的選擇,。雙向電泳后的凝膠經(jīng)過染色(如銀染、考馬斯亮藍(lán)染色等),，然后用圖譜軟件分析及后續(xù)的質(zhì)譜或氨基酸序列等分析,，再通過數(shù)據(jù)庫檢索最終達(dá)到鑒定蛋白質(zhì)的目的。目前商品化及非商品化的圖像分析軟件相當(dāng)多,，如 PD Quest,，Melanie，Image 2D Elite，Z3,，Progenesis 等,。
質(zhì)譜 (Mass Spectrometry) 原理是將蛋白質(zhì)樣品分子離子化，然后通過質(zhì)荷比分離并確定其分子量,?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALDITOF-MS) 和電噴霧電離質(zhì)譜 (ESI-MS) 兩項(xiàng)軟電離技術(shù)的出現(xiàn)，促進(jìn)了蛋白質(zhì)高通量的鑒定研究,。
近來出現(xiàn)的 MudPIT 多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù),，將蛋白質(zhì)混合物使用兩向分離技術(shù)進(jìn)行分離,，第1向使用強(qiáng)陽離子交換,，第2向使用反向色譜，然后用質(zhì)譜鑒定,。與普通的 2-DE 方法獨(dú)立互補(bǔ),，代表了當(dāng)前最豐富的蛋白質(zhì)分離鑒定技術(shù)。另外出現(xiàn)的 DIGE 技術(shù)(差異顯示凝膠電泳),，用3種不同的熒光染料 (Cy2,，Cy3，Cy5) 標(biāo)記不同的樣品,，在同一塊凝膠上電泳,，通過不同波長的激光及發(fā)射過濾器掃描，產(chǎn)生3種不同顏色的熒光信號(hào),?？朔瞬煌z間電泳造成的蛋白點(diǎn)的位置和量的差異，減少了凝膠使用量,，增加了凝膠間的可比性,。
目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究出現(xiàn)的許多新技術(shù)，大有取代 2-DE 的趨勢(shì),，但考慮到試驗(yàn)費(fèi)用,，應(yīng)用能力以及使用的廣泛性，2-DE 依然有前景,，特別是與免疫檢測(cè)結(jié)合使用,，其仍然是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要工具。功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究涉及蛋白質(zhì)的活性,，因此需考慮翻譯后修飾及蛋白質(zhì)問的相互作用,，蛋白質(zhì)的相互作用是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，一切生命活動(dòng)幾乎都是通過蛋白質(zhì)間的相互作用而實(shí)現(xiàn)的,。目前用來檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用的方法有酵母雙雜交系統(tǒng)法,，蛋白質(zhì)芯片法，噬菌體展示技術(shù)等。
2 蛋白質(zhì)組學(xué)在水稻中的應(yīng)用
1)發(fā)育的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,。在蛋白質(zhì)組學(xué)概念提出來之前,，許多研究者就已采用 2-DE 技術(shù)對(duì)水稻各組織器官的蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離及比較，Komatsu 等用 2-DE 分析水稻胚,、胚乳及葉的蛋白質(zhì),，考馬斯亮藍(lán)染色后分別檢測(cè)出約600、100,、150個(gè)蛋白點(diǎn),，通過 N 端或內(nèi)部氨基酸測(cè)序，鑒定了27種蛋白質(zhì),，超過70％的蛋白質(zhì) N 端封閉,。Tsugita 等對(duì)水稻10種組織器官分離出 4892 個(gè)蛋白質(zhì)，對(duì)其中2.8％的蛋白質(zhì)進(jìn)一步分析,，只有1.1％(56個(gè))測(cè)序,，由于當(dāng)時(shí)基因組及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫有限，即使一些被測(cè)序的蛋白質(zhì)也不知其功能,。水稻重要的繁殖器官花藥在小孢子早期發(fā)育易受環(huán)境影響,，Imin 等通過 2-DE 分離、銀染得到約4000種花藥蛋白,，代表了整個(gè)基因組的10％,，其中53個(gè)點(diǎn)得到鑒定，大部分是持家蛋白,，分子伴侶,，富甘氨酸蛋白，以及調(diào)控翻譯的腫瘤蛋白(首次在花藥研究中報(bào)道)等,。同時(shí),，一些與代謝密切相關(guān)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)也開展了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，如水稻線粒體,，通過質(zhì)譜分析鑒定了149個(gè)蛋白,，并確定了其中85個(gè)蛋白質(zhì)的功能。在制備亞細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品時(shí),，如有必要可先用顯微激光切割技術(shù)進(jìn)行專一樣品的富集后再進(jìn)一步裂解,。其他涉及研究的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)還有質(zhì)膜，高爾基體膜,，葉綠體等,。目前水稻蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫包含了23張參考圖，有詳細(xì)的采樣部位,、樣品制備及電泳條件,，鑒定方法,，點(diǎn)擊蛋白點(diǎn)鏈接相應(yīng)的信息等(http://gene64.dna.affrc.go.jp/rpd/)。建立高質(zhì)量的水稻 2-DE 參考圖譜對(duì)水稻蛋白質(zhì)組學(xué)以及水稻基因組功能的精確注釋是非常重要的,。
2)在環(huán)境脅迫下的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,。基因的表達(dá)受各種環(huán)境因子的影響,，主要包括生物和非生物因子脅迫等,。用各種脅迫處理水稻，可以分離新的蛋白及基因,，同時(shí)可深入了解水稻對(duì)這些環(huán)境脅迫的適應(yīng)機(jī)制,。水稻對(duì)干旱脅迫相當(dāng)敏感，干旱嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量,。Salekdeh 等對(duì)干旱脅迫下以及恢復(fù)灌溉后水稻葉片蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析,，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下有42個(gè)蛋白點(diǎn)的豐度有顯著變化，從而鑒定了一些干旱應(yīng)答蛋白,，這將有助于提高水稻抗旱育種以及改善作物品質(zhì)和提高產(chǎn)量,。
Agrawal 等采用 2-DE 結(jié)合氨基酸測(cè)序及免疫雜交技術(shù)研究臭氧脅迫下水稻幼苗葉蛋白的表達(dá)，與對(duì)照相比,，50多個(gè)點(diǎn)有差異，其中與光合作用相關(guān)的主要蛋白 RuBisCO 減少,，另外誘導(dǎo)出與防御有關(guān)的蛋白累積,，包括 OsPR5，OsPR10,，SOD,，APX，鈣結(jié)合蛋白等,，這些蛋白可以作為潛在的分子標(biāo)記檢測(cè)水稻及其他植物與臭氧脅迫相關(guān)的損傷,。同樣，金屬脅迫也會(huì)對(duì)光合作用產(chǎn)生破壞,，造成 RuBisCO 大,、小亞基斷裂以及影響防御相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)，如 OsPR5,，OsPR10,，SOD。
Kim 等用水稻病原菌對(duì)水稻懸浮培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行處理,，誘導(dǎo)產(chǎn)生了病原相關(guān)蛋白 OsPR10,，異黃酮還原酶類似蛋白 OsPR10，β-葡聚糖酶等蛋白進(jìn)行了首次報(bào)道,。水稻黃斑駁病毒 (RYMV) 對(duì)水稻產(chǎn)量的影響,，Ventelon-Debout 等對(duì)兩個(gè)水稻品種 IR64 (對(duì)該病毒敏感)和 Azucena (相對(duì)不敏感)的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)組的研究表明,，病毒感染后兩者分別有40和24個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)有明顯變化，有些只在 IR64 中表達(dá),，如 HSP70,，PR-10a，乙烯誘導(dǎo)蛋白等,，有些只在后者中存在,，如 Chaperonin CPN60-2 等，而與糖酵解有關(guān)的酶在兩個(gè)品種中都有變化,。
Rakwal 等用茉莉酸 (JA) 處理水稻,，葉和莖外觀上表現(xiàn)為相關(guān)的組織壞死，RuBisCO 亞基大量減少,，莖中出現(xiàn)一種新的 28KD 的堿性蛋白酶抑制劑及一種酸性的 17KD 的病程相關(guān)蛋白,，這些蛋白在植物的自我防御中起到了潛在的作用。Shen 等用赤霉素處理水稻葉鞘,，發(fā)現(xiàn)表達(dá)變化的鈣網(wǎng)蛋白參與赤霉素信號(hào)調(diào)節(jié)葉鞘的伸長,。還有其他的植物激素及生長物質(zhì)如：脫落酸、水楊酸,、乙烯等處理水稻后再用蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)一步研究特異蛋白的表達(dá),。
3)突變體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。突變體是遺傳學(xué)研究的重要材料,，通過正求遺傳學(xué)研究可以找到產(chǎn)生突變性狀的基因,。而將突變體與野生植株的蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較研究，可直觀地將差異表達(dá)的蛋白呈現(xiàn)出來,，進(jìn)一步研究這些蛋白質(zhì)有助于揭示突變體的生理生化及遺傳機(jī)制,。
Komatsu 等對(duì)水稻綠色和白化幼苗的蛋白質(zhì)通過 2-DE 分離，N-端及內(nèi)部氨基酸測(cè)序,，發(fā)現(xiàn)參與光合作用的蛋白質(zhì)只在綠苗中出現(xiàn),，在白化苗中以前體存在不能參與光合作用；抗壞血酸過氧化物酶只出現(xiàn)于白化苗中,，起到細(xì)胞保護(hù)的作用,。葉綠素突變體有利于研究高等植物光合作用，葉綠體遺傳與發(fā)育等,。王玉忠等對(duì)溫敏失綠突變體水稻失綠前后的 2-DE 圖譜比較表明,，失綠部分某蛋白 P1 特異缺失，而在復(fù)綠后,，P1 正常表達(dá),，推測(cè)該蛋白與葉綠素代謝密切相關(guān)。溫敏核不育水稻是兩系核不育水稻重要的育種材料,，低溫下才可育,。謝錦云等對(duì)不育和可育花藥樣品通過 2-DE 分離,，肽質(zhì)量指紋譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索，從不育到可育圖譜上,，明顯上調(diào)的蛋白質(zhì)包括幾丁質(zhì)酶,，酸性磷酸酶，谷蛋白前體等,，明顯下調(diào)的蛋白有谷氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶等,。模擬病斑突變體 (Lesion Mimic Mutant) 通常能在無病原物存在的情況下產(chǎn)生系統(tǒng)性過敏性壞死斑，并表現(xiàn)出對(duì)多種病原物抗性的提高,。Tsunezuka 等對(duì)一種 cdr2 突變體的3個(gè)病斑形成階段用 2-DE 分離,，與野生型相比，有37個(gè)蛋白點(diǎn)差異表達(dá),，其中28個(gè)點(diǎn)在突變體中表達(dá)上調(diào),，9個(gè)點(diǎn)表達(dá)下調(diào)，通過質(zhì)譜鑒定,，差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)與防御作用相關(guān),。此外有27個(gè)蛋白為代謝酶類，暗示該突變體發(fā)生的細(xì)胞程序化死亡與活躍的代謝有關(guān),。
3 水稻蛋白質(zhì)組信息學(xué)
現(xiàn)代生命科學(xué)研究與生物信息學(xué)的發(fā)展關(guān)系密切,，生物信息學(xué)不僅僅是收集數(shù)據(jù)，更重要的是處理,、分析,、解釋及開發(fā)應(yīng)用這些數(shù)據(jù)。目前各類核酸序列數(shù)據(jù)庫,、基因組數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)序列及結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫等日益完善,，為迅速準(zhǔn)確地研究和鑒定蛋白質(zhì)奠定了基礎(chǔ),。蛋白質(zhì)高通量地鑒定除了需要精密的質(zhì)譜儀器及相關(guān)的硬件支持外，最終的鑒定結(jié)果與各大數(shù)據(jù)庫直接相關(guān),。網(wǎng)上提供的相應(yīng)軟件支持在線的鑒定,，通過同源匹配得分值排序從而鑒定蛋白質(zhì)的歸屬，當(dāng)然這種檢索的成功率與蛋白質(zhì)物種來源的各種信息數(shù)據(jù)庫的積累直接相關(guān),。水稻蛋白質(zhì)組學(xué)研究相關(guān)的主要網(wǎng)站有：SWISS-2DPAGE 數(shù)據(jù)庫中國鏡像站點(diǎn)(http://cn.expasy.org/ch2d/),，提供雙向電泳參考圖譜及在線檢索軟件等；水稻蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫 Rice Proteome Database (http://gene64.dna.affrc.go.jp/rpd/),；水稻花藥蛋白質(zhì)組圖譜網(wǎng)站(http://semele.anu.edu.au/2d/2d.html),。
4 結(jié)論與前景
蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵問題是分離混合蛋白的重復(fù)性和分辨率，鑒于傳統(tǒng) 2-DE 的某些局限性(如：堿性蛋白,，膜蛋白,，疏水蛋白等分離效果有所欠缺),，新技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用是必然的。2-DE 在目前的蛋白質(zhì)分離科學(xué)中仍然占據(jù)重要的位置,，與其他具快速,、高通量特征的方法相互補(bǔ)充將是當(dāng)前及未來相當(dāng)長時(shí)間內(nèi)研究蛋白質(zhì)組的一種趨勢(shì)。
目前已經(jīng)建立了一些水稻蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)庫,，包括各組織器官,，亞細(xì)胞及不同發(fā)育期的雙向電泳圖譜。對(duì)水稻在各種環(huán)境脅迫下以及各種水稻突變體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究也是一項(xiàng)重要的研究內(nèi)容,，在這種情況下建立的參考圖也將非常有意義,，因其直接改善水稻的品質(zhì)和產(chǎn)量的相關(guān)性。目前水稻蛋白質(zhì)組學(xué)主要集中環(huán)境因子影響下的基因組表達(dá)變化,，完整的水稻蛋白組學(xué)還要深入研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾 (PTMs),，以及蛋白質(zhì)之間相互作用復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，這是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一項(xiàng)艱巨任務(wù),。
水稻有關(guān)的各種序列信息庫日益豐富,，如基因序列，表達(dá)序列標(biāo)簽 (EST) 等,，對(duì)于深入研究其生理活動(dòng),、遺傳機(jī)制都大有裨益。隨著各種數(shù)據(jù)庫的不斷充實(shí),，生物信息學(xué)本身的發(fā)展,，以及質(zhì)譜等高通量支撐技術(shù)的改進(jìn)，將會(huì)開展大規(guī)模的水稻功能基因組研究,?？傊镜鞍踪|(zhì)數(shù)據(jù)庫和與其基因組數(shù)據(jù)庫的整合，將有助于我們整體理解作為重要農(nóng)作物的水稻,，同時(shí)水稻的蛋白質(zhì)組學(xué)研究也為其他禾谷類農(nóng)作物的功能基因組研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),。
