蛋白質(zhì)組 (Proteome) 術(shù)語由澳大利亞科學家1994年提出并被定義為：基因組 (Genome) 表達的全部蛋白質(zhì),。隨著幾種模式生物基因組測序的完成,，蛋白質(zhì)組學 (Proteomics) 成為功能基因組時代重要的研究手段,。與一些簡單的原核生物相比,，植物蛋白質(zhì)組學研究相對落后,，在擬南芥 (Arabidopsis thaliana) 和水稻 (Oryza sativa) 的基因組序列公布后，植物蛋白質(zhì)組學研究逐漸活躍起來,。1999年首篇植物蛋白質(zhì)組學綜述了此前蛋白質(zhì)組學在植物方面的研究進展,，其中大部分研究還不曾涉及用質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)，如今質(zhì)譜已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學研究的重要工具,。隨著蛋白質(zhì)組學研究范圍的拓展,，不再局限于單純分離新的蛋白質(zhì),，蛋白質(zhì)組學現(xiàn)已成為描述和分析一個生物體的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)間的相互作用以及蛋白質(zhì)修飾的學科,。
水稻基因組由430 Mb 個堿基組成,，在禾谷類中較小，由于其基因易于操作,，與其他單子葉植物有共線性,，從而成為單子葉植物研究的模式生物。2002年水稻栽培品種秈稻和粳稻基因組框架圖繪制完成,，同年底水稻基因組精細圖譜完成,，然而從 mRNA 轉(zhuǎn)錄到蛋白質(zhì)的翻譯并不是簡單的對應(yīng)，真正執(zhí)行生命功能的是蛋白質(zhì),，蛋白質(zhì)組學則將基因組序列信息與特定組織器官中蛋白質(zhì)的種類連接起來,。目前水稻蛋白質(zhì)組學的研究逐漸掀起熱潮。
1 蛋白質(zhì)組學研究方法
蛋白質(zhì)組學經(jīng)典的研究方法是雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳 (Two-dimensional PAGE,，簡稱 2-DE)技術(shù),。1975年 O'Farrell 首次使用該技術(shù)分離大腸桿菌的蛋白質(zhì)，后來發(fā)展的固相 pH 梯度 (IPG) 技術(shù),，解決了 2-DE 中 pH 梯度的不穩(wěn)定性,，Gorg 等詳述了聚焦參數(shù)的選擇。雙向電泳后的凝膠經(jīng)過染色(如銀染,、考馬斯亮藍染色等),，然后用圖譜軟件分析及后續(xù)的質(zhì)譜或氨基酸序列等分析，再通過數(shù)據(jù)庫檢索最終達到鑒定蛋白質(zhì)的目的,。目前商品化及非商品化的圖像分析軟件相當多,，如 PD Quest，Melanie,，Image 2D Elite,，Z3，Progenesis 等,。
質(zhì)譜 (Mass Spectrometry) 原理是將蛋白質(zhì)樣品分子離子化,，然后通過質(zhì)荷比分離并確定其分子量?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜 (MALDITOF-MS) 和電噴霧電離質(zhì)譜 (ESI-MS) 兩項軟電離技術(shù)的出現(xiàn),，促進了蛋白質(zhì)高通量的鑒定研究。
近來出現(xiàn)的 MudPIT 多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù),，將蛋白質(zhì)混合物使用兩向分離技術(shù)進行分離,，第1向使用強陽離子交換，第2向使用反向色譜，然后用質(zhì)譜鑒定,。與普通的 2-DE 方法獨立互補,，代表了當前最豐富的蛋白質(zhì)分離鑒定技術(shù)。另外出現(xiàn)的 DIGE 技術(shù)(差異顯示凝膠電泳),，用3種不同的熒光染料 (Cy2,，Cy3，Cy5) 標記不同的樣品,，在同一塊凝膠上電泳,，通過不同波長的激光及發(fā)射過濾器掃描，產(chǎn)生3種不同顏色的熒光信號,?？朔瞬煌z間電泳造成的蛋白點的位置和量的差異，減少了凝膠使用量,，增加了凝膠間的可比性,。
目前蛋白質(zhì)組學研究出現(xiàn)的許多新技術(shù)，大有取代 2-DE 的趨勢,，但考慮到試驗費用,，應(yīng)用能力以及使用的廣泛性，2-DE 依然有前景,，特別是與免疫檢測結(jié)合使用,，其仍然是蛋白質(zhì)組學研究的重要工具。功能蛋白質(zhì)組學研究涉及蛋白質(zhì)的活性,，因此需考慮翻譯后修飾及蛋白質(zhì)問的相互作用,，蛋白質(zhì)的相互作用是生命活動的基礎(chǔ)，一切生命活動幾乎都是通過蛋白質(zhì)間的相互作用而實現(xiàn)的,。目前用來檢測蛋白質(zhì)相互作用的方法有酵母雙雜交系統(tǒng)法,，蛋白質(zhì)芯片法，噬菌體展示技術(shù)等,。
2 蛋白質(zhì)組學在水稻中的應(yīng)用
1)發(fā)育的蛋白質(zhì)組學研究,。在蛋白質(zhì)組學概念提出來之前，許多研究者就已采用 2-DE 技術(shù)對水稻各組織器官的蛋白質(zhì)組分進行分離及比較,，Komatsu 等用 2-DE 分析水稻胚,、胚乳及葉的蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍染色后分別檢測出約600,、100、150個蛋白點,，通過 N 端或內(nèi)部氨基酸測序,，鑒定了27種蛋白質(zhì)，超過70％的蛋白質(zhì) N 端封閉,。Tsugita 等對水稻10種組織器官分離出 4892 個蛋白質(zhì),，對其中2.8％的蛋白質(zhì)進一步分析,，只有1.1％(56個)測序，由于當時基因組及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫有限,，即使一些被測序的蛋白質(zhì)也不知其功能,。水稻重要的繁殖器官花藥在小孢子早期發(fā)育易受環(huán)境影響，Imin 等通過 2-DE 分離,、銀染得到約4000種花藥蛋白,，代表了整個基因組的10％，其中53個點得到鑒定,，大部分是持家蛋白,，分子伴侶，富甘氨酸蛋白,，以及調(diào)控翻譯的腫瘤蛋白(首次在花藥研究中報道)等,。同時，一些與代謝密切相關(guān)的亞細胞結(jié)構(gòu)也開展了蛋白質(zhì)組學研究,，如水稻線粒體,，通過質(zhì)譜分析鑒定了149個蛋白，并確定了其中85個蛋白質(zhì)的功能,。在制備亞細胞蛋白質(zhì)樣品時,，如有必要可先用顯微激光切割技術(shù)進行專一樣品的富集后再進一步裂解。其他涉及研究的亞細胞結(jié)構(gòu)還有質(zhì)膜,，高爾基體膜,，葉綠體等。目前水稻蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫包含了23張參考圖,，有詳細的采樣部位,、樣品制備及電泳條件，鑒定方法,，點擊蛋白點鏈接相應(yīng)的信息等(http://gene64.dna.affrc.go.jp/rpd/),。建立高質(zhì)量的水稻 2-DE 參考圖譜對水稻蛋白質(zhì)組學以及水稻基因組功能的精確注釋是非常重要的。
2)在環(huán)境脅迫下的蛋白質(zhì)組學研究,?；虻谋磉_受各種環(huán)境因子的影響，主要包括生物和非生物因子脅迫等,。用各種脅迫處理水稻,，可以分離新的蛋白及基因，同時可深入了解水稻對這些環(huán)境脅迫的適應(yīng)機制,。水稻對干旱脅迫相當敏感,，干旱嚴重影響水稻的產(chǎn)量。Salekdeh 等對干旱脅迫下以及恢復(fù)灌溉后水稻葉片蛋白質(zhì)組進行分析，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下有42個蛋白點的豐度有顯著變化,，從而鑒定了一些干旱應(yīng)答蛋白,，這將有助于提高水稻抗旱育種以及改善作物品質(zhì)和提高產(chǎn)量。
Agrawal 等采用 2-DE 結(jié)合氨基酸測序及免疫雜交技術(shù)研究臭氧脅迫下水稻幼苗葉蛋白的表達,，與對照相比,，50多個點有差異，其中與光合作用相關(guān)的主要蛋白 RuBisCO 減少,，另外誘導(dǎo)出與防御有關(guān)的蛋白累積,，包括 OsPR5，OsPR10,，SOD,，APX，鈣結(jié)合蛋白等,，這些蛋白可以作為潛在的分子標記檢測水稻及其他植物與臭氧脅迫相關(guān)的損傷,。同樣，金屬脅迫也會對光合作用產(chǎn)生破壞,，造成 RuBisCO 大,、小亞基斷裂以及影響防御相關(guān)蛋白質(zhì)的表達，如 OsPR5,，OsPR10,，SOD。
Kim 等用水稻病原菌對水稻懸浮培養(yǎng)細胞進行處理,，誘導(dǎo)產(chǎn)生了病原相關(guān)蛋白 OsPR10,，異黃酮還原酶類似蛋白 OsPR10，β-葡聚糖酶等蛋白進行了首次報道,。水稻黃斑駁病毒 (RYMV) 對水稻產(chǎn)量的影響,，Ventelon-Debout 等對兩個水稻品種 IR64 (對該病毒敏感)和 Azucena (相對不敏感)的懸浮培養(yǎng)細胞蛋白質(zhì)組的研究表明，病毒感染后兩者分別有40和24個蛋白點表達有明顯變化,，有些只在 IR64 中表達,，如 HSP70，PR-10a,，乙烯誘導(dǎo)蛋白等,，有些只在后者中存在，如 Chaperonin CPN60-2 等,，而與糖酵解有關(guān)的酶在兩個品種中都有變化,。
Rakwal 等用茉莉酸 (JA) 處理水稻，葉和莖外觀上表現(xiàn)為相關(guān)的組織壞死,，RuBisCO 亞基大量減少,，莖中出現(xiàn)一種新的 28KD 的堿性蛋白酶抑制劑及一種酸性的 17KD 的病程相關(guān)蛋白,，這些蛋白在植物的自我防御中起到了潛在的作用。Shen 等用赤霉素處理水稻葉鞘,，發(fā)現(xiàn)表達變化的鈣網(wǎng)蛋白參與赤霉素信號調(diào)節(jié)葉鞘的伸長。還有其他的植物激素及生長物質(zhì)如：脫落酸,、水楊酸,、乙烯等處理水稻后再用蛋白質(zhì)組學進一步研究特異蛋白的表達。
3)突變體的蛋白質(zhì)組學研究,。突變體是遺傳學研究的重要材料,，通過正求遺傳學研究可以找到產(chǎn)生突變性狀的基因。而將突變體與野生植株的蛋白質(zhì)組進行比較研究,，可直觀地將差異表達的蛋白呈現(xiàn)出來,，進一步研究這些蛋白質(zhì)有助于揭示突變體的生理生化及遺傳機制。
Komatsu 等對水稻綠色和白化幼苗的蛋白質(zhì)通過 2-DE 分離,，N-端及內(nèi)部氨基酸測序,，發(fā)現(xiàn)參與光合作用的蛋白質(zhì)只在綠苗中出現(xiàn)，在白化苗中以前體存在不能參與光合作用,；抗壞血酸過氧化物酶只出現(xiàn)于白化苗中,，起到細胞保護的作用。葉綠素突變體有利于研究高等植物光合作用,，葉綠體遺傳與發(fā)育等,。王玉忠等對溫敏失綠突變體水稻失綠前后的 2-DE 圖譜比較表明，失綠部分某蛋白 P1 特異缺失,，而在復(fù)綠后,，P1 正常表達，推測該蛋白與葉綠素代謝密切相關(guān),。溫敏核不育水稻是兩系核不育水稻重要的育種材料,，低溫下才可育。謝錦云等對不育和可育花藥樣品通過 2-DE 分離,，肽質(zhì)量指紋譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索,，從不育到可育圖譜上，明顯上調(diào)的蛋白質(zhì)包括幾丁質(zhì)酶,，酸性磷酸酶,，谷蛋白前體等，明顯下調(diào)的蛋白有谷氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶等,。模擬病斑突變體 (Lesion Mimic Mutant) 通常能在無病原物存在的情況下產(chǎn)生系統(tǒng)性過敏性壞死斑,，并表現(xiàn)出對多種病原物抗性的提高。Tsunezuka 等對一種 cdr2 突變體的3個病斑形成階段用 2-DE 分離,，與野生型相比,，有37個蛋白點差異表達,，其中28個點在突變體中表達上調(diào)，9個點表達下調(diào),，通過質(zhì)譜鑒定,，差異表達的蛋白點與防御作用相關(guān)。此外有27個蛋白為代謝酶類,，暗示該突變體發(fā)生的細胞程序化死亡與活躍的代謝有關(guān),。
3 水稻蛋白質(zhì)組信息學
現(xiàn)代生命科學研究與生物信息學的發(fā)展關(guān)系密切，生物信息學不僅僅是收集數(shù)據(jù),，更重要的是處理,、分析、解釋及開發(fā)應(yīng)用這些數(shù)據(jù),。目前各類核酸序列數(shù)據(jù)庫,、基因組數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)序列及結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫等日益完善,，為迅速準確地研究和鑒定蛋白質(zhì)奠定了基礎(chǔ),。蛋白質(zhì)高通量地鑒定除了需要精密的質(zhì)譜儀器及相關(guān)的硬件支持外，最終的鑒定結(jié)果與各大數(shù)據(jù)庫直接相關(guān),。網(wǎng)上提供的相應(yīng)軟件支持在線的鑒定,，通過同源匹配得分值排序從而鑒定蛋白質(zhì)的歸屬，當然這種檢索的成功率與蛋白質(zhì)物種來源的各種信息數(shù)據(jù)庫的積累直接相關(guān),。水稻蛋白質(zhì)組學研究相關(guān)的主要網(wǎng)站有：SWISS-2DPAGE 數(shù)據(jù)庫中國鏡像站點(http://cn.expasy.org/ch2d/),，提供雙向電泳參考圖譜及在線檢索軟件等；水稻蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫 Rice Proteome Database (http://gene64.dna.affrc.go.jp/rpd/),；水稻花藥蛋白質(zhì)組圖譜網(wǎng)站(http://semele.anu.edu.au/2d/2d.html),。
4 結(jié)論與前景
蛋白質(zhì)組學研究的關(guān)鍵問題是分離混合蛋白的重復(fù)性和分辨率，鑒于傳統(tǒng) 2-DE 的某些局限性(如：堿性蛋白,，膜蛋白,，疏水蛋白等分離效果有所欠缺)，新技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用是必然的,。2-DE 在目前的蛋白質(zhì)分離科學中仍然占據(jù)重要的位置,，與其他具快速、高通量特征的方法相互補充將是當前及未來相當長時間內(nèi)研究蛋白質(zhì)組的一種趨勢,。
目前已經(jīng)建立了一些水稻蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)庫,，包括各組織器官，亞細胞及不同發(fā)育期的雙向電泳圖譜,。對水稻在各種環(huán)境脅迫下以及各種水稻突變體的蛋白質(zhì)組學研究也是一項重要的研究內(nèi)容,，在這種情況下建立的參考圖也將非常有意義，因其直接改善水稻的品質(zhì)和產(chǎn)量的相關(guān)性,。目前水稻蛋白質(zhì)組學主要集中環(huán)境因子影響下的基因組表達變化,，完整的水稻蛋白組學還要深入研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾 (PTMs),，以及蛋白質(zhì)之間相互作用復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，這是蛋白質(zhì)組學研究的一項艱巨任務(wù),。
水稻有關(guān)的各種序列信息庫日益豐富,，如基因序列，表達序列標簽 (EST) 等,，對于深入研究其生理活動,、遺傳機制都大有裨益。隨著各種數(shù)據(jù)庫的不斷充實,，生物信息學本身的發(fā)展，以及質(zhì)譜等高通量支撐技術(shù)的改進,，將會開展大規(guī)模的水稻功能基因組研究,。總之水稻蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫和與其基因組數(shù)據(jù)庫的整合,，將有助于我們整體理解作為重要農(nóng)作物的水稻,，同時水稻的蛋白質(zhì)組學研究也為其他禾谷類農(nóng)作物的功能基因組研究打下堅實的基礎(chǔ)。
