蛋白質(zhì)組學(xué)已被廣泛應(yīng)用于疾病相關(guān)研究. 綜述了最近幾年來蛋白質(zhì)組學(xué)在肝臟疾病研究中特別是肝臟腫瘤肝硬化毒/藥物肝損傷等方面的進(jìn)展, 其研究結(jié)果將對(duì)生物標(biāo)記物和藥靶的尋找, 以及致病機(jī)理的闡述具有重要意義.
關(guān)鍵詞 蛋白質(zhì)組學(xué) 肝臟疾病
隨著人類基因組計(jì)劃(HGP)的實(shí)施及人類基因組工作草圖的完成, 生命科學(xué)研究在21 世紀(jì)初進(jìn)入了功能基因組研究時(shí)代. 蛋白質(zhì)組學(xué)研究在這一前沿領(lǐng)域中具有舉足輕重的戰(zhàn)略地位, 已被應(yīng)用于生命科學(xué)的許多領(lǐng)域, 如腫瘤的發(fā)生與發(fā)展、細(xì)胞分化與胚胎發(fā)育基因調(diào)控機(jī)制
重大疾病的發(fā)生與治療、藥學(xué)研究和環(huán)境與健康的關(guān)系等. 蛋白質(zhì)是理解細(xì)胞功能和疾病過程的核心, 沒有在蛋白質(zhì)組學(xué)方面的積極努力, 就不能獲得基因組學(xué)的成果[1].
蛋白質(zhì)組學(xué)概念及研究特點(diǎn)
蛋白質(zhì)組學(xué)是一門以全面的蛋白質(zhì)性質(zhì)研究(如表達(dá)水平轉(zhuǎn)錄后修飾細(xì)胞內(nèi)定位相互作用等) 為基礎(chǔ), 在蛋白質(zhì)整體水平對(duì)疾病機(jī)理細(xì)胞模式功能聯(lián)系等方面進(jìn)行探索的科學(xué).
與基因組研究相比, 蛋白質(zhì)組研究存在明顯的不同, 主要有以下幾點(diǎn): 基因組研究是對(duì)相對(duì)穩(wěn)定的DNA 的靜態(tài)研究, 而蛋白質(zhì)組研究則是對(duì)細(xì)胞不同時(shí)期蛋白質(zhì)表達(dá)的動(dòng)態(tài)研究; 蛋白質(zhì)更能反映細(xì)胞的功能, 磷酸化乙?；腔谆蛠喯貂,；确g后修飾和剪切的存在, 使得蛋白質(zhì)組研究的信息量要多于基因組;基因組可通過PCR 擴(kuò)增, 而蛋白質(zhì)分析較困難, 特別是對(duì)動(dòng)態(tài)表達(dá)的追蹤和低豐度蛋白的分離鑒定, 因而, 蛋白質(zhì)組學(xué)研究又在很大程度上依賴于相關(guān)技術(shù)的發(fā)展, 目前, 在雙向電泳的基礎(chǔ)上, 國(guó)際上又出現(xiàn)了以色譜/電泳-質(zhì)譜為主要技術(shù)平臺(tái)的生物大分子大規(guī)模分離和鑒定的技術(shù)與方法.
2 蛋白質(zhì)組學(xué)在肝病研究中的應(yīng)用
由于蛋白質(zhì)組學(xué)研究更接近生命現(xiàn)象的本質(zhì), 并在藥靶研究中具有潛在價(jià)值, 所以已被廣泛用于疾病相關(guān)研究. 在肝臟研究領(lǐng)域, 蛋白質(zhì)組學(xué)可用來研究肝臟的生理與病理肝臟發(fā)育及肝臟疾病等, 主要肝臟疾病包括肝臟腫瘤肝硬化毒/藥物肝損傷及其他.
2.1 肝細(xì)胞癌
肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC) 是最主要的肝臟腫瘤, 約占原發(fā)性肝癌的90%以上, 早期診斷困難, 病程發(fā)展快, 5 年生存率小于5%. HCC 在肝硬化病人中有較高的發(fā)生率, HBV 和HCV 慢性感染亦是其發(fā)病的高危因素. 因此, 尋找有效的腫瘤標(biāo)志物用于高危人群的篩查疾病的早期診斷藥物靶標(biāo)的設(shè)計(jì)及癌變機(jī)理研究成為HCC 研究的當(dāng)務(wù)之急.
腫瘤標(biāo)志物是存在于人體組織或體液中能被定量測(cè)量并對(duì)惡性腫瘤患者有臨床意義的生物分子[2], 人們已在細(xì)胞組織樣品和血清水平開展了這方面的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.
1. (1) 細(xì)胞水平: Seow 等人[3]對(duì)人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HCC-M 作了全譜分析, 對(duì)408 個(gè)點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS 分析, 有301 個(gè)點(diǎn)得到了較好的質(zhì)譜圖, 經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定出了屬于192 個(gè)基因的272 種蛋白質(zhì). 這些蛋白質(zhì)中除了一些看家基因外, 還出現(xiàn)了可能與腫瘤發(fā)生過程相關(guān)的蛋白, 如14-3-3 蛋白膜聯(lián)蛋白抑制素和硫氧還蛋白過氧化物酶. 對(duì)其余29 種未鑒定的蛋白進(jìn)行nESI MS/MS (nano- electrospray ionization MS/MS) 和de novo 測(cè)序, 全部得到鑒定, 其中包含已報(bào)道的腫瘤相關(guān)蛋白磷酸酪氨酸磷酸酶激活因子RNA 結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)亞單位復(fù)制蛋白A 32 kD 亞單位和唾液酸磷酸合成酶[4]. 還發(fā)現(xiàn)一種新的核蛋白HCC-1[5], 其cDNA 水平在胰腺癌中上調(diào), 在高分化肝細(xì)胞癌中也上調(diào), 而在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)入低分化狀態(tài)時(shí)下調(diào). 尋找HCC-1 相互作用蛋白R(shí)NA/DNA 的工作正在進(jìn)行. 在以上工作的基礎(chǔ)上, Liang 等人[6]建立了肝癌細(xì)胞系HCC-M 的蛋白質(zhì)雙向電泳數(shù)據(jù)庫(kù)(http://proteome.btc.nus.edu.sg/hccm), 此外, 還將搜集其他肝癌細(xì)胞系
2. 正常肝組織和腫瘤組織的蛋白表達(dá)信息, 以確定早期診斷的標(biāo)記物和腫瘤特異性治療靶標(biāo).
Yu 等人[7]對(duì)比了人肝癌細(xì)胞系BEL-7404 和正常人肝細(xì)胞系L-02 的雙向電泳結(jié)果, 在99 個(gè)差異點(diǎn)中鑒定出12 個(gè)蛋白點(diǎn), 還將反義EGFR 的cDNA 序列轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞, 發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受抑, 與對(duì)照相比有40 個(gè)蛋白表達(dá)變化, 其中3 個(gè)蛋白有向正常細(xì)胞表達(dá)水平變化的趨勢(shì)[8].
(2) 組織樣本: Wu 等人[9]運(yùn)用雙向電泳技術(shù)對(duì)3 例正常肝組織和8 例HCC 肝組織的核基質(zhì)蛋白進(jìn)行對(duì)比分析, 鑒定出4 個(gè)HCC 特異蛋白, 認(rèn)為這些核基質(zhì)蛋白的發(fā)現(xiàn)可能為HCC 的發(fā)生發(fā)展發(fā)病機(jī)理研究提供新途徑.
Yoon 等人[10]運(yùn)用雙向電泳技術(shù)對(duì)11 例HCC 肝組織及對(duì)應(yīng)的非腫瘤組織核基質(zhì)蛋白組分進(jìn)行對(duì)比分析, 發(fā)現(xiàn)鈣網(wǎng)硬蛋白在HCC 的核基質(zhì)中大量存在, 此結(jié)果可被免疫雜交證實(shí), 但兩種組織中的鈣網(wǎng)硬蛋白總量相似. 經(jīng)免疫熒光顯微鏡分析, 發(fā)現(xiàn)腫瘤組織的核被免疫熒光染色. 鈣網(wǎng)硬蛋白也在多種腫瘤細(xì)胞系的核基質(zhì)中被發(fā)現(xiàn), 其形成與增多可能與細(xì)胞生長(zhǎng)活化有關(guān).
Park 等人[11]對(duì)10 例HCC 病人的癌組織和鄰近非癌組織進(jìn)行雙向電泳及MALDI-MS 分析以尋找新的HCC 標(biāo)志物, 發(fā)現(xiàn)HCC 中出現(xiàn)人醛脫氫酶3 型(class 3 aldehyde dehydrogenase, ALDH-3)的3 種變異體, ALDH-2 的2 個(gè)變異體消失不見, 而ALDH-1 的4 個(gè)變異體保持不變, 且ALDH-3 與ALDH-2 變異體的相伴出現(xiàn)和消失在各例HCC 中均發(fā)生, 表明ALDH 同工酶變異體的變化可能與HCC 密切相關(guān).
Lim 等人[12]對(duì)比了6 位Edmondson 級(jí)肝細(xì)胞癌病人自身的正常肝組織 .肝硬化組織和肝癌組織的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜, 找出了21 種在6 名病人中都有相同表達(dá)變化模式的蛋白, 其中肌氨酸脫氫酶 .肝羧酸酯酶肽基-脯氨酸異構(gòu)酶A 和核纖層蛋白B1 在肝癌組織中的表達(dá)出現(xiàn)顯著變化, 被認(rèn)為是新的肝細(xì)胞癌候選標(biāo)志物, 而核纖層蛋白B1 在肝硬化和肝癌組織中的表達(dá)逐漸上升, 被認(rèn)為是肝硬化候選標(biāo)志物.
為探討HCC 中的鐵缺失, Park 等人[13]運(yùn)用雙向電泳及MALDI-MS 對(duì)比分析19 例HCC 病人的癌組織和鄰近非癌組織, 發(fā)現(xiàn)前者的鐵蛋白輕鏈水平降低或無法檢測(cè)到, Western blotting 和免疫組化也證實(shí)了相同的結(jié)果. 相反, 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在同一HCC 患者中表達(dá)水平上升. 有趣的是, 通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR 發(fā)現(xiàn)鐵蛋白輕鏈mRNA 與正常對(duì)照同水平, 提示翻譯或翻譯后修飾可能抑制了HCC 中的輕鏈水平. 基于PCR 的雜合子丟失分析, 表明只有一例患者在鐵蛋白輕鏈定位的19q13.3-q13.4 區(qū)有染色體丟失, 說明輕鏈抑制現(xiàn)象不像是結(jié)構(gòu)基因組變化所致, 從而在蛋白質(zhì)組和基因組水平為HCC 發(fā)生中未解決的鐵缺失問題提供了新線索.
(3) 血清: Steel 等人[14]運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法, 從處于疾病不同階段的個(gè)體中采集血清經(jīng)雙向電泳分析來鑒定隨病程變化的蛋白多肽, 證明血清多肽數(shù)量的變化及翻譯后修飾的變化(如聚糖結(jié)構(gòu)的變化)可用于HCC 的診斷和進(jìn)展評(píng)估.
Le 等人[15] 搜集了37 名HCC 患者31 名慢性HBV/HCV 感染而無HCC 的患者143 名對(duì)照(116 名其他腫瘤患者3 名SLE 患者24 名健康人)的血清, 將腫瘤細(xì)胞系蛋白經(jīng)雙向電泳分離后與血清進(jìn)行Western blotting, 發(fā)現(xiàn)8 種蛋白的抗體在大于10% 的HCC 患者血清中檢測(cè)出而健康個(gè)體中沒有, 其中4 種蛋白在慢性肝炎病人血清中有相對(duì)較高的檢出率, 而另4 種蛋白的抗體主要在HCC 患者血清中檢出. 認(rèn)為抗體檢測(cè)可用于HCC 的診斷以及HBV 和HCV 慢性攜帶的高危人群的篩查.
Poon 等人[2]利用雙向電泳分離HCC 病人以及肝硬化病人和正常人的血清, 經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)包括AFP 在內(nèi)的20 多種蛋白出現(xiàn)HCC 特異性的上調(diào)或下調(diào)表達(dá). 在HCC 組及對(duì)照組50%的個(gè)體中出現(xiàn)的點(diǎn)被用于對(duì)比分析, 保證了無偏性地反映HCC 特異性的蛋白質(zhì)組特征; 使用熒光染色及成像技術(shù), 不僅可獲得較好的線性范圍, 而且更適用于通過對(duì)比分析以確定血清中含量甚微的腫瘤標(biāo)志物(mg/mL, ng/mL 甚至pg/ mL), 并且對(duì)比了腫瘤切除前后的血清, 以驗(yàn)證新發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志物. 血清中大量存在的白蛋白尚需提前去除以防干擾, 腫瘤標(biāo)志物被驗(yàn)證后, 還需進(jìn)一步的確認(rèn)和更大樣本量的臨床研究.
2.2 肝硬化
肝硬化是一種或多種病因長(zhǎng)期或反復(fù)作用造成的彌漫性肝臟損傷, 其中肝星狀細(xì)胞的活化是啟動(dòng)肝纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié). 受損的肝細(xì)胞
鄰近的內(nèi)皮細(xì)胞枯否氏細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞和血小板都可激活肝性狀細(xì)胞, 促其合成大量細(xì)胞外基質(zhì)[16]. 因此, 肝性狀細(xì)胞也成為肝硬化相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究的目標(biāo).
Kawada 等人[17] 通過對(duì)大鼠星狀細(xì)胞的蛋白質(zhì)組分析, 發(fā)現(xiàn)了一種新蛋白STAP(stellate cellactivationassosiated protein). 它只在星狀細(xì)胞中檢測(cè)到, 在纖維化肝中分離到的體內(nèi)激活星狀細(xì)胞和體外原代培養(yǎng)的活化星狀細(xì)胞中高表達(dá), 可能通過清除過氧化物發(fā)揮抗肝纖維化的作用.
Kristensen 等人[18] 對(duì)比靜態(tài)和激活的大鼠肝星狀細(xì)胞, 發(fā)現(xiàn)有27 種蛋白在體內(nèi)和體外激活的星狀細(xì)胞都有相同表達(dá)變化, 其中鈣周期蛋白, calgizzarin, galectin-1 上調(diào), 肝羧酸酯酶10, 絲氨酸蛋白酶抑制物3 下調(diào). 還列出了150 余種星狀細(xì)胞蛋白, 從而加深了在蛋白質(zhì)水平對(duì)星狀細(xì)胞活化這一肝纖維化關(guān)鍵事件的認(rèn)識(shí).
2.3 毒/藥物肝損傷
肝臟具有重要的解毒功能, 在生物異源污染物的生物轉(zhuǎn)化藥物代謝中發(fā)揮重要作用. 但當(dāng)毒物的攝入超過肝臟的代償能力后, 會(huì)對(duì)肝臟造成損傷. 蛋白質(zhì)組學(xué)已被用于闡明毒物導(dǎo)致肝損傷的作用機(jī)理, 并為毒物的早期確定提供毒理學(xué)標(biāo)記物.
過氧化物酶增殖因子(peroxisome proliferators, PPs) 可引起肝細(xì)胞增殖抑制調(diào)亡, Chevalier 等人[19] 對(duì)比大鼠肝原代細(xì)胞在過氧化物酶增殖因子nafeno-pin 和EGF 作用下蛋白表達(dá)變化模式的不同, 找出了毒蕈堿類乙酰膽堿受體3, 中間絲波形蛋白和ATP 合成酶b亞基等32 種nafenopin 誘導(dǎo)的蛋白, 用于進(jìn)一步闡明PPs 的致癌機(jī)理, 并為非遺傳毒性致癌物的早期確定提供了毒理學(xué)標(biāo)記. Macdonald 等人[20] 通過比較野生型和PPs 激活受體? 無效小鼠在PPs 作用下的蛋白表達(dá), 找出18 種差異蛋白, 其中包括有抗凋亡作用的葡萄糖調(diào)控蛋白94 的組成性過表達(dá), 為PPs 激活的抗凋亡機(jī)制研究提供了思路.
Zeindl-Eberhart 等人[21] 對(duì)N-methyl-N-nitrosourea, diethylnitrosamine 和N-nitrosomor-pholine 等3 種基因毒性亞硝基化合物及非基因毒性nafenopin 致大鼠肝癌進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析, 發(fā)現(xiàn)兩種肝特異性酶3?-羥基類固醇脫氫酶和d-3-甾酮-5b還原酶在各種毒物所致肝癌中都有上調(diào)表達(dá). Witzmann 等人[22] 對(duì)噴氣機(jī)燃料蒸汽的大鼠肝毒性進(jìn)行了蛋白豐度和蛋白電荷修飾指數(shù)分析. Tonge 等人[23] 運(yùn)用熒光雙向差異電泳蛋白質(zhì)組技術(shù)分析了撲熱息痛處理的小鼠肝組織表達(dá)變化. 此外, 蛋白質(zhì)組分析還被用于酒精退熱凈[25] 嘧啶衍生物[26] SKF-106689 [27] 和洛伐他丁[28] 等對(duì)肝臟影響的研究.
2.4 其他
蛋白質(zhì)組學(xué)還被用于研究Huntington’s 病不同組織在病程發(fā)展中的蛋白表達(dá)變化[29] 以及肝片吸蟲的分泌物與宿主免疫逃避[30]等.
3 結(jié)語
蛋白質(zhì)組學(xué)研究在最近幾年得到了飛速的發(fā)展, 已被廣泛用于疾病相關(guān)研究. 但肝病相關(guān)蛋白質(zhì)組研究現(xiàn)多集中在以2DE 和質(zhì)譜為基礎(chǔ)的差異分析上, 2DE 對(duì)低豐度高疏水性蛋白的分析有一定的限制, 將各種新的差異分析技術(shù)(ICAT, SELDI, LCM 和多維色譜等)引入到差異分析中來, 尋找更多有意義的肝病診斷標(biāo)志物和與致病機(jī)理相關(guān)的蛋白, 將是今后發(fā)展的方向, 此目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)依賴于分析規(guī)模分辨率(尤其對(duì)于低豐度蛋白)和重復(fù)性的提高. 臨床需求與實(shí)驗(yàn)室研究的結(jié)合亦很重要. 蛋白質(zhì)組學(xué)亞洲和大洋洲人類蛋白質(zhì)組組織(Asian and Oceanian Human Proteome Organization, AOHUPO) 已于2002 年3 月宣布啟動(dòng)人類肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃(Human Liver Proteome Project, HLPP), 同年10 月22 日成立了中國(guó)蛋白質(zhì)組組織(China Human Proteome Orgnization), 并召開了人類蛋白質(zhì)組組織肝臟專題討論會(huì). 肝病在我國(guó)有較高的發(fā)病率, 我們更應(yīng)抓住這一契機(jī), 利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)與方法進(jìn)行相關(guān)的基礎(chǔ)研究與應(yīng)用研究.
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