Current Opinion in Chemical Biology 2000, 4:489-494
蛋白質(zhì)組學(xué)對一個細(xì)胞或組織所表達(dá)的蛋白質(zhì)進行的系統(tǒng)分析,，而質(zhì)譜是它的關(guān)鍵性分析工具。在過去的兩年中,，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)組技術(shù)中的進展增進了更高水平自動化和敏感性的蛋白質(zhì)識別技術(shù),。另外，新的技術(shù)促成了鑒定蛋白質(zhì)功能相關(guān)特性的里程碑性的進展,，包括它們的定量和在蛋白質(zhì)復(fù)合物中復(fù)雜情況,。
縮寫
2DE two-dimensional gel electrophoresis雙向凝膠電泳
CID collision-induced dissociation碰撞誘導(dǎo)的解離
ESI electrospray ionization電噴霧離子化
FT-ICR Fourier-transform ion cyclotron resonance傅里葉-變換離子回旋加速器共振
ICAT isotope-coded affinity tags
IEF isoelectric focusing等電聚焦
MALDI matrix-assisted laser desorption ionization基質(zhì)輔助的激光解析離子化
Q-TOF quadrupole-TOF
RP reversed phase反向
TOF time-of-flight飛行時間
簡介
蛋白質(zhì)組學(xué)的核心組成是系統(tǒng)識別一個細(xì)胞或組織中表達(dá)的每一個蛋白質(zhì)，以及確定每個蛋白質(zhì)的突出特征(比如,，豐度,、修飾狀態(tài)以及在多蛋白質(zhì)復(fù)合體中的復(fù)雜狀態(tài))。這些分析的技術(shù)包括分離蛋白質(zhì)和肽的分離科學(xué)、識別和定量分析物的分析科學(xué)和數(shù)據(jù)管理和分析的生物信息學(xué),。它的初步工具包括使用IEF(等電點聚焦)/SDS-PAGE凝膠的高分辨率的雙向凝膠電泳(2DE),，結(jié)合質(zhì)譜和數(shù)據(jù)庫搜索來分離、識別和定量在一個復(fù)合樣本中存在的個體蛋白質(zhì),，最終識別被分離的蛋白質(zhì),。一個常用的方法用在Fig1中用圖解說明。此技術(shù)以及由此而來的變化(綜述見[1])已經(jīng)被用來識別和分類在復(fù)雜樣本中存在的大量蛋白質(zhì),，并在蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫中呈現(xiàn)它們,，該過程我們這里稱之為"描述蛋白質(zhì)組學(xué)"比如，Shevchenko等[2]從2D凝膠上系統(tǒng)地鑒定了150個蛋白質(zhì),。數(shù)目龐大的這樣的數(shù)據(jù)庫現(xiàn)在可以找到,。同樣的技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)被作為普遍的發(fā)現(xiàn)工具來動態(tài)檢測一個細(xì)胞或組織對外來或內(nèi)部干擾反應(yīng)而在蛋白質(zhì)組中的改變。因為檢測動態(tài)改變需要精確定量每個被檢測成分,，我們使用"定量蛋白質(zhì)組學(xué)"來定義,。
在此報告中，我們總結(jié)了自1999年1月至2000年4月來報道的與蛋白質(zhì)組學(xué)和質(zhì)譜相關(guān)的最重要的進展,。在核心質(zhì)譜技術(shù)中的進展已經(jīng)導(dǎo)致2DE為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的進一步改進,。它們同時又促進了傳統(tǒng)凝膠為基礎(chǔ)的方法的替代方法，諸如引入以同位素稀釋理論為基礎(chǔ)的精確蛋白質(zhì)定量技術(shù)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的系統(tǒng)分析,。
蛋白質(zhì)組分析的MS技術(shù)進展
在此部分,，我們總結(jié)了在MS設(shè)備、它們的控制和操作中的進展,，以及比較質(zhì)譜數(shù)據(jù)和序列數(shù)據(jù)庫識別蛋白質(zhì)所用的搜索工具的進展,。
隨著新型質(zhì)譜儀的引入，蛋白質(zhì)組學(xué)研究現(xiàn)存類型的質(zhì)譜儀性能已經(jīng)顯著改進了,。在此綜述期間最普遍使用的儀器是可以分為兩類：單一階段的質(zhì)譜儀和串聯(lián)質(zhì)譜為基礎(chǔ)的系統(tǒng),。單一階段的質(zhì)譜儀，最顯著的是基質(zhì)輔助的激光解吸電離(MALDI)飛行時間(TOF)儀器,，被用于無數(shù)通過肽質(zhì)譜圖譜技術(shù)大規(guī)模蛋白質(zhì)識別的項目中,。此方法在鑒別表達(dá)自小一些的和完全測序的基因組的蛋白質(zhì)特別成功[3,4]。串聯(lián)質(zhì)譜儀器諸如triple quadrpole,、離子捕獲(ion-trap)和近來引進的混合quadrupole飛行時間(Q-TOF)被常規(guī)應(yīng)用于LC-MS/MS或用電噴霧電離(ESI)來生成肽片段離子譜,，以便通過搜尋序列數(shù)據(jù)庫進行蛋白質(zhì)鑒定。使用儀器控制程序來自動選擇肽離子進行碰撞誘導(dǎo)的解離(CID)(數(shù)據(jù)依賴CID)的不斷增多是這些MS/MS儀器的一個明顯的趨勢,。
一些新的構(gòu)造的具有高潛能的質(zhì)譜儀被引入到蛋白質(zhì)組學(xué)研究中產(chǎn)生深刻影響,。兩個研究組近來一個MALDI離子源和一個混合Q-TOF耦聯(lián)了起來[5,6]。Q-TOF提供的質(zhì)量準(zhǔn)確性和敏感性提升了數(shù)據(jù)庫搜尋結(jié)果并同時使它成為MS/MS從頭測序的當(dāng)然儀器選擇,。MALDI Q-TOF構(gòu)造提供了激動人心的機會進行自動化和高通量應(yīng)用以及在一個樣品盤上存檔樣品進行日后研究的可能,。Medzihradszky等[7]描述了一個不同的混合儀器稱之為MALDI TOF TOF,。此設(shè)備享有許多MALDI Q-TOF的優(yōu)點，另外能夠進行高能量CID和非?？焖俚膾呙杷俾?。傅里葉-變換離子回旋加速器共振(FT-ICR)質(zhì)譜對于蛋白質(zhì)組學(xué)來說相對陌生。這些設(shè)備具有非常高的敏感性和分辨率,，質(zhì)量精確性可以達(dá)到1ppm,。這些特征被用來在一次分析中測量和定量幾百種蛋白質(zhì)的完整的分子質(zhì)量[8]。Goodlett等[9]表明FT-MS測量的一個肽的準(zhǔn)確質(zhì)量以及可以容易獲得的限制因素能夠通過序列數(shù)據(jù)庫搜索被用來識別蛋白質(zhì),。蛋白質(zhì)組學(xué)如果沒有軟件工具來進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)和序列數(shù)據(jù)庫的關(guān)聯(lián)將變得幾無可能?，F(xiàn)存的數(shù)據(jù)庫搜索程序已經(jīng)變得越來越成熟和可以(從網(wǎng)絡(luò))可獲得。另外,，引入了新的算法,。主要相關(guān)程序是Sequest[10]，MASCOT[11],，PeptedeSearch[12],，PROWL[13]和Protein Prospector[14]。在它們中間,，Sequest使用CID譜設(shè)置了蛋白質(zhì)識別的實驗室標(biāo)準(zhǔn)(benchmark),，因為它與邊界MS/MS數(shù)據(jù)工作得最好，并高度可信,，可以從整個LC-MS/MS實驗中自動分析數(shù)據(jù),，并不需要任何使用者的破譯工作。在所提的程序中,，然而,，只有Sequest不能在網(wǎng)絡(luò)上搜索。MASCOT是一個新的,、快速,、網(wǎng)絡(luò)可進入和多功能的程序，具有進行肽指紋分析,、用部分破譯或未破譯的CID譜進行數(shù)據(jù)庫搜索的功能,。
描述蛋白質(zhì)組學(xué)的進展
在此綜述期間之開始，基本上所有的蛋白質(zhì)組計劃都是建立在分離蛋白質(zhì),、 成像和定量的2DE和蛋白質(zhì)鑒定的質(zhì)譜聯(lián)用的基礎(chǔ)上。此方法通過上述的MS發(fā)展,、2DE的進步和創(chuàng)新性的凝膠電泳和MS聯(lián)用的推動下前進,。2DE的前進包括引入新的熒光染色方法，與銀染方法相比可以提供更高的敏感度,、更大動態(tài)范圍[15]和通過擴展第一向的pI范圍與在2DE之前預(yù)分復(fù)雜的蛋白質(zhì)復(fù)合物增強分辨率(綜述參見[16]),。Binz等[17]描述了一個新的方法來系統(tǒng)分離2DE分離的蛋白質(zhì),。所有在2D凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移印跡到一個共價衍生有胰蛋白酶的膜上進行同步消化。生成的肽隨之捕獲在膜上,，然后通過MALDI-TOF質(zhì)譜指紋分析識別,。總的2DE-MS方法已經(jīng)被用來生成來自不同物種的無數(shù)細(xì)胞類型的注解的2D凝膠數(shù)據(jù)庫,。部分這些資源的列表可以通過因特網(wǎng)獲得,。(www.lecb.ncifcrf.gov/EP/table2Ddatabases.html)。
盡管這些進展推進了2DE為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組技術(shù),，它們沒有強調(diào)此方法檢測具體類別蛋白質(zhì)的根本限制,，包括低豐度、差溶解度極大或極小體積以及極端的pI值,。一些研究組因此探索在蛋白質(zhì)組計劃中替代一個或同時兩個凝膠電泳象限,。Loo等[18]直接用MALDI-TOF質(zhì)譜儀掃描IEF凝膠替代2DE的SDS-SAGE象限，這樣產(chǎn)生了一個"虛擬2D凝膠"成像,，在其中蛋白質(zhì)質(zhì)量是用質(zhì)譜測量的,。Oda等[19]用制備用的反相(RP)-HPLC替代2DE的IEF相，Wall等[20]在溶液中應(yīng)用制備用的IEF,，隨后用無孔的樹脂在MALDI-TOF-MS之前進行HPLC分離蛋白質(zhì),。Link等[21]完全擯棄了任何蛋白質(zhì)分離。它們通過消化未分離的蛋白質(zhì)樣品并用二維(強離子交換/RP)層析(LC/LC)耦聯(lián)到一個ESI-MS/MS設(shè)備上分析產(chǎn)生的肽混合物來分析復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物,。使用一個類似的LC/LC-MS/MS,，我們成功地檢測到低豐度酵母蛋白質(zhì)，并因此證明此方法能夠克服2D凝膠的局限性的動態(tài)范圍[22],。
這些進展的目標(biāo)是蛋白質(zhì)組分析技術(shù)的更高的通量,、更強的自動化和增強的綜合性?？梢灶A(yù)計這些進展將會持續(xù),，而且可能為顯微制造技術(shù)應(yīng)用所加速。它的早期范例包括制造樣品處理設(shè)備[23,24]和表面增強的激光解吸/電離(SELDI)蛋白質(zhì)芯片來分離和分析具有特定特征的蛋白質(zhì)和肽[25],。盡管這些方法可能最終在一個樣品中檢測和識別每一個蛋白質(zhì),，但是2DE是個例外，因為它本身不是定量的,。
定量蛋白質(zhì)組學(xué)
在非2DE為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)分析中加入一個定量的元素,，可行的技術(shù)-穩(wěn)定的同位素標(biāo)記[26]已經(jīng)被應(yīng)用到蛋白質(zhì)分析中。此方法涉及將化學(xué)組成相同但穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)(如使用2H,、13C,、15N等)摻到樣品中。因為電離效率對于不同肽是高度多變的,，對于一個肽的唯一適合的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)是標(biāo)記有穩(wěn)定同位素的同一個肽,。定量蛋白質(zhì)分布圖因此用含有相同蛋白質(zhì)但不同豐度,、并標(biāo)記有重穩(wěn)定同位素的第二個樣品與一個蛋白質(zhì)混合物(參考樣品)進行比較而完成。在理論上,，分析對標(biāo)本中所有的肽具有相同的序列但是不同的質(zhì)量,。因為肽對具有相同的物理化學(xué)特性，它們被認(rèn)為在提取,、分離和電離中具有相同的表現(xiàn),。因此，低和高質(zhì)量組成的強度的比率提供了精確測定在原始蛋白質(zhì)混合物中肽的相對豐度(因而得到蛋白質(zhì)的),。三個研究組基于穩(wěn)定同位素技術(shù)已經(jīng)獨立報告測量蛋白質(zhì)分布圖[8,19,27],，另外兩個研究組正在寫它的手稿(H Langen等，個人通訊,；P James等,，個人通訊)。在方法中,，摻入的同位素以及使用的分析步驟中這些技術(shù)存在差別,。
Oda等[19]在含有自然豐度的同位素氮(14N,99.6%;15N,0.4%)的培養(yǎng)基中生長酵母培養(yǎng)物，而另外一個培養(yǎng)物在同樣富集15N(＞96%)的培養(yǎng)基中生長,。在合適的生長期過后,，收集細(xì)胞，通過RP-HPLC以及隨后的SDS-PAGE提取和分離興趣蛋白質(zhì),。膠內(nèi)消化切除的興趣點導(dǎo)致肽段生成,，然后用肽質(zhì)量圖譜鑒定。研究者測定了兩個釀酒酵母生成的42個高豐度蛋白質(zhì),，發(fā)現(xiàn)它們只在表達(dá)G1期細(xì)胞周期素CLN2的能力上有差異,。此實驗技術(shù)的差錯百分比發(fā)現(xiàn)是優(yōu)異的(±10%)。研究者們用同一技術(shù)繼續(xù)研究在酵母蛋白-Ste20中的差異磷酸化狀態(tài),。Pasa-Tolic等[8]利用穩(wěn)定同位素耗竭的培養(yǎng)基傳遞一個特異的同位素信號到蛋白質(zhì)中,。它們比較在正常和少見的同位素耗竭(13C、15N和2H"耗竭")培養(yǎng)基中生長的E.Coli對鈣壓力反應(yīng),。通過FT-ICR-MS進行了完整的蛋白質(zhì)質(zhì)量測定,。盡管沒有檢測到蛋白質(zhì)，200個不同蛋白質(zhì)的表達(dá)比率進行了比較,。
很明顯,，用15N富集或耗竭的培養(yǎng)基的穩(wěn)定同位素代謝蛋白質(zhì)標(biāo)記與2DE或其它分離技術(shù)結(jié)合允許定量的蛋白質(zhì)分布圖。然而,，此技術(shù)有一些缺點,。首先，此技術(shù)不允許直接從組織中分析蛋白質(zhì)。第二,，穩(wěn)定同位素富集的培養(yǎng)基昂貴，并可能它們本身影響到細(xì)胞生長和蛋白質(zhì)生成,。第三,，因為同位素?fù)饺雽?dǎo)致質(zhì)量的微小增加直到序列確定后才知道。因此,，蛋白質(zhì)鑒定必須在定量之前進行,。
我們近來發(fā)表了一個建立在同位素編碼的親和標(biāo)簽(ICAT)基礎(chǔ)上的新的定量蛋白質(zhì)分布圖方法[27]。在此方法中(Fig2),，穩(wěn)定同位素在半胱氨酸被一個重(d8)或輕(d0)試劑選擇性烷基化后摻入,。兩個蛋白質(zhì)混合物進行混合。在此時,，任何一個可選用的分級分離技術(shù)來富集低豐度蛋白質(zhì)或減小混合物的復(fù)雜性,，而同時嚴(yán)格保持相對量。在分析前,，蛋白質(zhì)混合物用胰蛋白酶進行消化并通過一個單體親和素-瓊脂糖柱,。因為ICAT標(biāo)記含有穩(wěn)定同位素信息以及一個生物素標(biāo)簽，ICAT標(biāo)記(含有半胱氨酸)的肽被選擇性提取進行微毛細(xì)管LC-ESI-MS/MS分析,。ICAT標(biāo)記對的共洗脫液的離子強度比率允許定量,，而隨后的MS/MS掃描提供了蛋白質(zhì)識別。在單次分析中,，在生長在半乳糖或乙醇上的酵母的蛋白質(zhì)表達(dá)分布圖之間進行了比較,。
ICAT策略有幾個優(yōu)點。首先,，此方法兼容任何量的從體液,、細(xì)胞或任何生長條件下的組織中收集的蛋白質(zhì)。第二,，烷基化反應(yīng)高度特異,，而只在鹽、去污劑和穩(wěn)定劑(如SDS,、尿素,、鹽酸胍)存在的情況下發(fā)生。第三,，通過只分離含有半胱氨酸的肽肽混合物的復(fù)雜性下降了,。第四，ICAT策略允許幾乎任何類型的生物化學(xué),、免疫或物理分級分離,，使其兼容低豐度蛋白質(zhì)的分析。此方法存在兩個缺點,。第一,，ICAT標(biāo)記(~500Da)的大小是相當(dāng)大的修飾,，并在整個MS分析過程中保留在每個肽上。這使得數(shù)據(jù)庫搜索的算法復(fù)雜化,，特別是小的肽段(<7氨基酸),。只有小比例的蛋白質(zhì)是沒有半胱氨酸的(在酵母中為8%)，然而,，可以合成除了對巰基以外其它基團特異的ICAT試劑,。
蛋白質(zhì)混合物的分析
大多數(shù)細(xì)胞的功能都不是單個蛋白質(zhì)而是蛋白質(zhì)復(fù)合體也叫作多蛋白復(fù)合體來實現(xiàn)的。因此,，特異性蛋白質(zhì)相互作用的識別是蛋白質(zhì)組學(xué)的一個關(guān)鍵性組成,，因為它直接關(guān)系到生物反應(yīng)中的蛋白質(zhì)功能?？傮w上,，上述分析蛋白質(zhì)混合物的方法很適合蛋白質(zhì)復(fù)合體的分析。確實,，一些最有科學(xué)回報性的蛋白質(zhì)質(zhì)譜應(yīng)用已經(jīng)進入了這個舞臺,。Link等[21]用LC/LC-MS/ MS單步分析在酵母核糖體中識別了超過70個蛋白質(zhì)。Rout等[28]徹底分析了酵母核孔復(fù)合體的組成,、結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運機制,。Rappsilber等[29]已經(jīng)利用化學(xué)連接和MS檢測多蛋白質(zhì)復(fù)合體的空間組成，Heller等[30]已經(jīng)檢測了T細(xì)胞受體復(fù)合體的組成,。這些項目極其依賴于高產(chǎn)出的完全分離靶復(fù)合體的技術(shù),。為了此目的，Bouveret等[31]發(fā)展了串聯(lián)親和純化{TAP}方法,，并通過檢測酵母拼接體展示了它的令人印象深刻的效率,。
結(jié)論
蛋白質(zhì)組學(xué)的一個主要的力量是其通過系統(tǒng)分析表達(dá)的蛋白質(zhì)來分析生物過程的動力學(xué)。此綜述中所描述的技術(shù)進展,，特別是精確測定擾動誘導(dǎo)的為數(shù)眾多的蛋白質(zhì)的量變,，以及分析蛋白質(zhì)功能復(fù)合體的能力顯著增強了我們從全盤立足點研究生物過程和系統(tǒng)。隨后的一年在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究領(lǐng)域?qū)羌攘钊擞∠笊羁逃旨尤诵牡?。繼續(xù)的技術(shù)進展將使研究者們獲得正真的蛋白質(zhì)分析(即分析一個細(xì)胞中所有表達(dá)的蛋白質(zhì))并讓對定義蛋白質(zhì)功能狀態(tài)至關(guān)重要的全面測定形式成為可能,。
