Current Opinion in Chemical Biology 2000, 4:489-494
蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)一個(gè)細(xì)胞或組織所表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行的系統(tǒng)分析,，而質(zhì)譜是它的關(guān)鍵性分析工具,。在過(guò)去的兩年中，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)組技術(shù)中的進(jìn)展增進(jìn)了更高水平自動(dòng)化和敏感性的蛋白質(zhì)識(shí)別技術(shù),。另外,，新的技術(shù)促成了鑒定蛋白質(zhì)功能相關(guān)特性的里程碑性的進(jìn)展,，包括它們的定量和在蛋白質(zhì)復(fù)合物中復(fù)雜情況。
縮寫
2DE two-dimensional gel electrophoresis雙向凝膠電泳
CID collision-induced dissociation碰撞誘導(dǎo)的解離
ESI electrospray ionization電噴霧離子化
FT-ICR Fourier-transform ion cyclotron resonance傅里葉-變換離子回旋加速器共振
ICAT isotope-coded affinity tags
IEF isoelectric focusing等電聚焦
MALDI matrix-assisted laser desorption ionization基質(zhì)輔助的激光解析離子化
Q-TOF quadrupole-TOF
RP reversed phase反向
TOF time-of-flight飛行時(shí)間
簡(jiǎn)介
蛋白質(zhì)組學(xué)的核心組成是系統(tǒng)識(shí)別一個(gè)細(xì)胞或組織中表達(dá)的每一個(gè)蛋白質(zhì),，以及確定每個(gè)蛋白質(zhì)的突出特征(比如,，豐度、修飾狀態(tài)以及在多蛋白質(zhì)復(fù)合體中的復(fù)雜狀態(tài)),。這些分析的技術(shù)包括分離蛋白質(zhì)和肽的分離科學(xué),、識(shí)別和定量分析物的分析科學(xué)和數(shù)據(jù)管理和分析的生物信息學(xué),。它的初步工具包括使用IEF(等電點(diǎn)聚焦)/SDS-PAGE凝膠的高分辨率的雙向凝膠電泳(2DE)，結(jié)合質(zhì)譜和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索來(lái)分離,、識(shí)別和定量在一個(gè)復(fù)合樣本中存在的個(gè)體蛋白質(zhì),，最終識(shí)別被分離的蛋白質(zhì),。一個(gè)常用的方法用在Fig1中用圖解說(shuō)明,。此技術(shù)以及由此而來(lái)的變化(綜述見(jiàn)[1])已經(jīng)被用來(lái)識(shí)別和分類在復(fù)雜樣本中存在的大量蛋白質(zhì)，并在蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)中呈現(xiàn)它們,，該過(guò)程我們這里稱之為"描述蛋白質(zhì)組學(xué)"比如,，Shevchenko等[2]從2D凝膠上系統(tǒng)地鑒定了150個(gè)蛋白質(zhì)。數(shù)目龐大的這樣的數(shù)據(jù)庫(kù)現(xiàn)在可以找到,。同樣的技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)被作為普遍的發(fā)現(xiàn)工具來(lái)動(dòng)態(tài)檢測(cè)一個(gè)細(xì)胞或組織對(duì)外來(lái)或內(nèi)部干擾反應(yīng)而在蛋白質(zhì)組中的改變,。因?yàn)闄z測(cè)動(dòng)態(tài)改變需要精確定量每個(gè)被檢測(cè)成分，我們使用"定量蛋白質(zhì)組學(xué)"來(lái)定義,。
在此報(bào)告中,，我們總結(jié)了自1999年1月至2000年4月來(lái)報(bào)道的與蛋白質(zhì)組學(xué)和質(zhì)譜相關(guān)的最重要的進(jìn)展。在核心質(zhì)譜技術(shù)中的進(jìn)展已經(jīng)導(dǎo)致2DE為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步改進(jìn),。它們同時(shí)又促進(jìn)了傳統(tǒng)凝膠為基礎(chǔ)的方法的替代方法,，諸如引入以同位素稀釋理論為基礎(chǔ)的精確蛋白質(zhì)定量技術(shù)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的系統(tǒng)分析。
蛋白質(zhì)組分析的MS技術(shù)進(jìn)展
在此部分,，我們總結(jié)了在MS設(shè)備,、它們的控制和操作中的進(jìn)展，以及比較質(zhì)譜數(shù)據(jù)和序列數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別蛋白質(zhì)所用的搜索工具的進(jìn)展,。
隨著新型質(zhì)譜儀的引入,，蛋白質(zhì)組學(xué)研究現(xiàn)存類型的質(zhì)譜儀性能已經(jīng)顯著改進(jìn)了。在此綜述期間最普遍使用的儀器是可以分為兩類：?jiǎn)我浑A段的質(zhì)譜儀和串聯(lián)質(zhì)譜為基礎(chǔ)的系統(tǒng),。單一階段的質(zhì)譜儀,，最顯著的是基質(zhì)輔助的激光解吸電離(MALDI)飛行時(shí)間(TOF)儀器，被用于無(wú)數(shù)通過(guò)肽質(zhì)譜圖譜技術(shù)大規(guī)模蛋白質(zhì)識(shí)別的項(xiàng)目中,。此方法在鑒別表達(dá)自小一些的和完全測(cè)序的基因組的蛋白質(zhì)特別成功[3,4],。串聯(lián)質(zhì)譜儀器諸如triple quadrpole、離子捕獲(ion-trap)和近來(lái)引進(jìn)的混合quadrupole飛行時(shí)間(Q-TOF)被常規(guī)應(yīng)用于LC-MS/MS或用電噴霧電離(ESI)來(lái)生成肽片段離子譜,，以便通過(guò)搜尋序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定,。使用儀器控制程序來(lái)自動(dòng)選擇肽離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)的解離(CID)(數(shù)據(jù)依賴CID)的不斷增多是這些MS/MS儀器的一個(gè)明顯的趨勢(shì)。
一些新的構(gòu)造的具有高潛能的質(zhì)譜儀被引入到蛋白質(zhì)組學(xué)研究中產(chǎn)生深刻影響,。兩個(gè)研究組近來(lái)一個(gè)MALDI離子源和一個(gè)混合Q-TOF耦聯(lián)了起來(lái)[5,6],。Q-TOF提供的質(zhì)量準(zhǔn)確性和敏感性提升了數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋結(jié)果并同時(shí)使它成為MS/MS從頭測(cè)序的當(dāng)然儀器選擇。MALDI Q-TOF構(gòu)造提供了激動(dòng)人心的機(jī)會(huì)進(jìn)行自動(dòng)化和高通量應(yīng)用以及在一個(gè)樣品盤上存檔樣品進(jìn)行日后研究的可能,。Medzihradszky等[7]描述了一個(gè)不同的混合儀器稱之為MALDI TOF TOF,。此設(shè)備享有許多MALDI Q-TOF的優(yōu)點(diǎn)，另外能夠進(jìn)行高能量CID和非常快速的掃描速率,。傅里葉-變換離子回旋加速器共振(FT-ICR)質(zhì)譜對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)來(lái)說(shuō)相對(duì)陌生,。這些設(shè)備具有非常高的敏感性和分辨率，質(zhì)量精確性可以達(dá)到1ppm,。這些特征被用來(lái)在一次分析中測(cè)量和定量幾百種蛋白質(zhì)的完整的分子質(zhì)量[8],。Goodlett等[9]表明FT-MS測(cè)量的一個(gè)肽的準(zhǔn)確質(zhì)量以及可以容易獲得的限制因素能夠通過(guò)序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索被用來(lái)識(shí)別蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)如果沒(méi)有軟件工具來(lái)進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)和序列數(shù)據(jù)庫(kù)的關(guān)聯(lián)將變得幾無(wú)可能?，F(xiàn)存的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索程序已經(jīng)變得越來(lái)越成熟和可以(從網(wǎng)絡(luò))可獲得,。另外，引入了新的算法,。主要相關(guān)程序是Sequest[10],，MASCOT[11]，PeptedeSearch[12],，PROWL[13]和Protein Prospector[14],。在它們中間，Sequest使用CID譜設(shè)置了蛋白質(zhì)識(shí)別的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)(benchmark),，因?yàn)樗c邊界MS/MS數(shù)據(jù)工作得最好,，并高度可信，可以從整個(gè)LC-MS/MS實(shí)驗(yàn)中自動(dòng)分析數(shù)據(jù),，并不需要任何使用者的破譯工作,。在所提的程序中，然而,，只有Sequest不能在網(wǎng)絡(luò)上搜索,。MASCOT是一個(gè)新的、快速,、網(wǎng)絡(luò)可進(jìn)入和多功能的程序,，具有進(jìn)行肽指紋分析、用部分破譯或未破譯的CID譜進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的功能,。
描述蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)展
在此綜述期間之開始,，基本上所有的蛋白質(zhì)組計(jì)劃都是建立在分離蛋白質(zhì)、 成像和定量的2DE和蛋白質(zhì)鑒定的質(zhì)譜聯(lián)用的基礎(chǔ)上,。此方法通過(guò)上述的MS發(fā)展,、2DE的進(jìn)步和創(chuàng)新性的凝膠電泳和MS聯(lián)用的推動(dòng)下前進(jìn)。2DE的前進(jìn)包括引入新的熒光染色方法,，與銀染方法相比可以提供更高的敏感度,、更大動(dòng)態(tài)范圍[15]和通過(guò)擴(kuò)展第一向的pI范圍與在2DE之前預(yù)分復(fù)雜的蛋白質(zhì)復(fù)合物增強(qiáng)分辨率(綜述參見(jiàn)[16])。Binz等[17]描述了一個(gè)新的方法來(lái)系統(tǒng)分離2DE分離的蛋白質(zhì),。所有在2D凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移印跡到一個(gè)共價(jià)衍生有胰蛋白酶的膜上進(jìn)行同步消化,。生成的肽隨之捕獲在膜上,，然后通過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜指紋分析識(shí)別?？偟?DE-MS方法已經(jīng)被用來(lái)生成來(lái)自不同物種的無(wú)數(shù)細(xì)胞類型的注解的2D凝膠數(shù)據(jù)庫(kù),。部分這些資源的列表可以通過(guò)因特網(wǎng)獲得。(www.lecb.ncifcrf.gov/EP/table2Ddatabases.html),。
盡管這些進(jìn)展推進(jìn)了2DE為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組技術(shù),，它們沒(méi)有強(qiáng)調(diào)此方法檢測(cè)具體類別蛋白質(zhì)的根本限制，包括低豐度,、差溶解度極大或極小體積以及極端的pI值,。一些研究組因此探索在蛋白質(zhì)組計(jì)劃中替代一個(gè)或同時(shí)兩個(gè)凝膠電泳象限,。Loo等[18]直接用MALDI-TOF質(zhì)譜儀掃描IEF凝膠替代2DE的SDS-SAGE象限,，這樣產(chǎn)生了一個(gè)"虛擬2D凝膠"成像，在其中蛋白質(zhì)質(zhì)量是用質(zhì)譜測(cè)量的,。Oda等[19]用制備用的反相(RP)-HPLC替代2DE的IEF相,，Wall等[20]在溶液中應(yīng)用制備用的IEF，隨后用無(wú)孔的樹脂在MALDI-TOF-MS之前進(jìn)行HPLC分離蛋白質(zhì),。Link等[21]完全擯棄了任何蛋白質(zhì)分離,。它們通過(guò)消化未分離的蛋白質(zhì)樣品并用二維(強(qiáng)離子交換/RP)層析(LC/LC)耦聯(lián)到一個(gè)ESI-MS/MS設(shè)備上分析產(chǎn)生的肽混合物來(lái)分析復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物。使用一個(gè)類似的LC/LC-MS/MS,，我們成功地檢測(cè)到低豐度酵母蛋白質(zhì),，并因此證明此方法能夠克服2D凝膠的局限性的動(dòng)態(tài)范圍[22]。
這些進(jìn)展的目標(biāo)是蛋白質(zhì)組分析技術(shù)的更高的通量,、更強(qiáng)的自動(dòng)化和增強(qiáng)的綜合性,。可以預(yù)計(jì)這些進(jìn)展將會(huì)持續(xù),，而且可能為顯微制造技術(shù)應(yīng)用所加速,。它的早期范例包括制造樣品處理設(shè)備[23,24]和表面增強(qiáng)的激光解吸/電離(SELDI)蛋白質(zhì)芯片來(lái)分離和分析具有特定特征的蛋白質(zhì)和肽[25]。盡管這些方法可能最終在一個(gè)樣品中檢測(cè)和識(shí)別每一個(gè)蛋白質(zhì),，但是2DE是個(gè)例外,，因?yàn)樗旧聿皇嵌康摹?/p>
定量蛋白質(zhì)組學(xué)
在非2DE為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)分析中加入一個(gè)定量的元素，可行的技術(shù)-穩(wěn)定的同位素標(biāo)記[26]已經(jīng)被應(yīng)用到蛋白質(zhì)分析中,。此方法涉及將化學(xué)組成相同但穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)(如使用2H,、13C、15N等)摻到樣品中,。因?yàn)殡婋x效率對(duì)于不同肽是高度多變的,，對(duì)于一個(gè)肽的唯一適合的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)是標(biāo)記有穩(wěn)定同位素的同一個(gè)肽。定量蛋白質(zhì)分布圖因此用含有相同蛋白質(zhì)但不同豐度,、并標(biāo)記有重穩(wěn)定同位素的第二個(gè)樣品與一個(gè)蛋白質(zhì)混合物(參考樣品)進(jìn)行比較而完成,。在理論上,，分析對(duì)標(biāo)本中所有的肽具有相同的序列但是不同的質(zhì)量。因?yàn)殡膶?duì)具有相同的物理化學(xué)特性,，它們被認(rèn)為在提取,、分離和電離中具有相同的表現(xiàn)。因此,，低和高質(zhì)量組成的強(qiáng)度的比率提供了精確測(cè)定在原始蛋白質(zhì)混合物中肽的相對(duì)豐度(因而得到蛋白質(zhì)的),。三個(gè)研究組基于穩(wěn)定同位素技術(shù)已經(jīng)獨(dú)立報(bào)告測(cè)量蛋白質(zhì)分布圖[8,19,27]，另外兩個(gè)研究組正在寫它的手稿(H Langen等,，個(gè)人通訊,；P James等，個(gè)人通訊),。在方法中,，摻入的同位素以及使用的分析步驟中這些技術(shù)存在差別。
Oda等[19]在含有自然豐度的同位素氮(14N,99.6%;15N,0.4%)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)酵母培養(yǎng)物,，而另外一個(gè)培養(yǎng)物在同樣富集15N(＞96%)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng),。在合適的生長(zhǎng)期過(guò)后，收集細(xì)胞,，通過(guò)RP-HPLC以及隨后的SDS-PAGE提取和分離興趣蛋白質(zhì),。膠內(nèi)消化切除的興趣點(diǎn)導(dǎo)致肽段生成，然后用肽質(zhì)量圖譜鑒定,。研究者測(cè)定了兩個(gè)釀酒酵母生成的42個(gè)高豐度蛋白質(zhì),，發(fā)現(xiàn)它們只在表達(dá)G1期細(xì)胞周期素CLN2的能力上有差異。此實(shí)驗(yàn)技術(shù)的差錯(cuò)百分比發(fā)現(xiàn)是優(yōu)異的(±10%),。研究者們用同一技術(shù)繼續(xù)研究在酵母蛋白-Ste20中的差異磷酸化狀態(tài),。Pasa-Tolic等[8]利用穩(wěn)定同位素耗竭的培養(yǎng)基傳遞一個(gè)特異的同位素信號(hào)到蛋白質(zhì)中。它們比較在正常和少見(jiàn)的同位素耗竭(13C,、15N和2H"耗竭")培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的E.Coli對(duì)鈣壓力反應(yīng),。通過(guò)FT-ICR-MS進(jìn)行了完整的蛋白質(zhì)質(zhì)量測(cè)定。盡管沒(méi)有檢測(cè)到蛋白質(zhì),，200個(gè)不同蛋白質(zhì)的表達(dá)比率進(jìn)行了比較,。
很明顯，用15N富集或耗竭的培養(yǎng)基的穩(wěn)定同位素代謝蛋白質(zhì)標(biāo)記與2DE或其它分離技術(shù)結(jié)合允許定量的蛋白質(zhì)分布圖,。然而,，此技術(shù)有一些缺點(diǎn)。首先,，此技術(shù)不允許直接從組織中分析蛋白質(zhì),。第二，穩(wěn)定同位素富集的培養(yǎng)基昂貴,，并可能它們本身影響到細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)生成,。第三,，因?yàn)橥凰負(fù)饺雽?dǎo)致質(zhì)量的微小增加直到序列確定后才知道。因此,，蛋白質(zhì)鑒定必須在定量之前進(jìn)行,。
我們近來(lái)發(fā)表了一個(gè)建立在同位素編碼的親和標(biāo)簽(ICAT)基礎(chǔ)上的新的定量蛋白質(zhì)分布圖方法[27]。在此方法中(Fig2),，穩(wěn)定同位素在半胱氨酸被一個(gè)重(d8)或輕(d0)試劑選擇性烷基化后摻入,。兩個(gè)蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行混合。在此時(shí),，任何一個(gè)可選用的分級(jí)分離技術(shù)來(lái)富集低豐度蛋白質(zhì)或減小混合物的復(fù)雜性,，而同時(shí)嚴(yán)格保持相對(duì)量。在分析前,，蛋白質(zhì)混合物用胰蛋白酶進(jìn)行消化并通過(guò)一個(gè)單體親和素-瓊脂糖柱,。因?yàn)镮CAT標(biāo)記含有穩(wěn)定同位素信息以及一個(gè)生物素標(biāo)簽，ICAT標(biāo)記(含有半胱氨酸)的肽被選擇性提取進(jìn)行微毛細(xì)管LC-ESI-MS/MS分析,。ICAT標(biāo)記對(duì)的共洗脫液的離子強(qiáng)度比率允許定量,，而隨后的MS/MS掃描提供了蛋白質(zhì)識(shí)別,。在單次分析中,，在生長(zhǎng)在半乳糖或乙醇上的酵母的蛋白質(zhì)表達(dá)分布圖之間進(jìn)行了比較。
ICAT策略有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn),。首先,，此方法兼容任何量的從體液、細(xì)胞或任何生長(zhǎng)條件下的組織中收集的蛋白質(zhì),。第二,，烷基化反應(yīng)高度特異，而只在鹽,、去污劑和穩(wěn)定劑(如SDS,、尿素、鹽酸胍)存在的情況下發(fā)生,。第三,，通過(guò)只分離含有半胱氨酸的肽肽混合物的復(fù)雜性下降了。第四,，ICAT策略允許幾乎任何類型的生物化學(xué),、免疫或物理分級(jí)分離，使其兼容低豐度蛋白質(zhì)的分析,。此方法存在兩個(gè)缺點(diǎn),。第一，ICAT標(biāo)記(~500Da)的大小是相當(dāng)大的修飾,，并在整個(gè)MS分析過(guò)程中保留在每個(gè)肽上,。這使得數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的算法復(fù)雜化,，特別是小的肽段(<7氨基酸)。只有小比例的蛋白質(zhì)是沒(méi)有半胱氨酸的(在酵母中為8%),，然而,，可以合成除了對(duì)巰基以外其它基團(tuán)特異的ICAT試劑。
蛋白質(zhì)混合物的分析
大多數(shù)細(xì)胞的功能都不是單個(gè)蛋白質(zhì)而是蛋白質(zhì)復(fù)合體也叫作多蛋白復(fù)合體來(lái)實(shí)現(xiàn)的,。因此,，特異性蛋白質(zhì)相互作用的識(shí)別是蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)關(guān)鍵性組成，因?yàn)樗苯雨P(guān)系到生物反應(yīng)中的蛋白質(zhì)功能,?？傮w上，上述分析蛋白質(zhì)混合物的方法很適合蛋白質(zhì)復(fù)合體的分析,。確實(shí),，一些最有科學(xué)回報(bào)性的蛋白質(zhì)質(zhì)譜應(yīng)用已經(jīng)進(jìn)入了這個(gè)舞臺(tái)。Link等[21]用LC/LC-MS/ MS單步分析在酵母核糖體中識(shí)別了超過(guò)70個(gè)蛋白質(zhì),。Rout等[28]徹底分析了酵母核孔復(fù)合體的組成,、結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。Rappsilber等[29]已經(jīng)利用化學(xué)連接和MS檢測(cè)多蛋白質(zhì)復(fù)合體的空間組成,，Heller等[30]已經(jīng)檢測(cè)了T細(xì)胞受體復(fù)合體的組成,。這些項(xiàng)目極其依賴于高產(chǎn)出的完全分離靶復(fù)合體的技術(shù)。為了此目的,，Bouveret等[31]發(fā)展了串聯(lián)親和純化{TAP}方法,，并通過(guò)檢測(cè)酵母拼接體展示了它的令人印象深刻的效率。
結(jié)論
蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)主要的力量是其通過(guò)系統(tǒng)分析表達(dá)的蛋白質(zhì)來(lái)分析生物過(guò)程的動(dòng)力學(xué),。此綜述中所描述的技術(shù)進(jìn)展,，特別是精確測(cè)定擾動(dòng)誘導(dǎo)的為數(shù)眾多的蛋白質(zhì)的量變，以及分析蛋白質(zhì)功能復(fù)合體的能力顯著增強(qiáng)了我們從全盤立足點(diǎn)研究生物過(guò)程和系統(tǒng),。隨后的一年在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究領(lǐng)域?qū)?huì)是既令人印象深刻又激動(dòng)人心的,。繼續(xù)的技術(shù)進(jìn)展將使研究者們獲得正真的蛋白質(zhì)分析(即分析一個(gè)細(xì)胞中所有表達(dá)的蛋白質(zhì))并讓對(duì)定義蛋白質(zhì)功能狀態(tài)至關(guān)重要的全面測(cè)定形式成為可能。
