Dolores J. Cahill
Max-Planck-Institute of Molecular Genetics, Ihnestrasse 73, D-14195 Berlin, Germany
Proteomics: A Trends Guide 2000,July, 47-51

摘要

高密度DNA和蛋白質芯片是小的平面，它允許在一次實驗中同步分析幾千個分子指標,。DNA芯片導致了更小的樣本體積,、更有效的分析和更高的輸出。因為蛋白質與核酸相比更加復雜和多樣,，發(fā)展類似的蛋白質組學平臺已經表明是困難的,。此綜述概括近期用于高密度蛋白質芯片制作和應用的技術，重點介紹它在蛋白質組學近期的進展和應用,。

微陣列的生產是一個高度自動化的過程,，它使用點樣針（pin）為基礎或液體微分配的操縱自動儀器在一個平面上排列生物樣本。對于DNA芯片的制作,，PCR技術已經成熟建立并在大規(guī)?；蚪M分析中起中心作用,。陣列所用的表面隨著應用的不同而變化，比如,，如果需要分析大量樣品與相同配體之間的相互作用,，DNA排列到濾膜(比如硝酸纖維素膜、尼龍膜,、聚偏二氟乙烯)上或者包被有不同試劑(比如多聚－L-賴氨酸或者聚丙烯酰胺)的玻片上,。

芯片的制作

相似的技術已經被用來制作高密度蛋白質芯片和微陣列（Fig.1）。此方法牽涉到使用格柵自動儀器從微滴度平皿轉移DNA或者相應表達的蛋白質到尼龍膜（Hybond N+, Amersham, DNA分析用）或者聚偏二氟乙烯膜上（Hybond-PVDF, Amersham, 蛋白質分析用）上的高密度格柵中,。點樣自動儀器在一個servo控制的3軸線性驅動系統(tǒng)上攜帶384個點樣頭,，定位可以準確到5μm，產生的密度大約為300點/cm2,。吸頭的直徑取決于點樣的應用,，但是可以在150μm到450μm之間變化。重組融合蛋白的原位表達以及表達的產物用抗含有His-tag表位的抗體檢測,。非特異性結合的抗體隨之被洗掉,，濾膜與合適的標記的二抗以及底物一起孵育。濾膜暴露于紫外線,，用CCD（charge coupled）攝像機攝取圖像,。專門的圖像分析軟件隨之被用來計數陽性克隆。分格有克隆或PCR產物的尼龍膜－DNA濾膜可以反復使用至少20次,，而沒有顯著的信號強度丟失,。相比之下，排列到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上的蛋白質常規(guī)只能使用一次,。用來制作高密度蛋白質芯片的文庫（單基因系列,，Unigene set）現(xiàn)在可以得到[資源中心/原始數據庫（PZPD），德國柏林].從液態(tài)表達培養(yǎng)物中獲得的蛋白質純化后,，用轉移印章轉到平床點樣自動儀器上,，進行點樣制作蛋白質微陣列。使用這個直徑小于150μm的轉移印章,，4800個樣品可以放到一個顯微玻片上并可以使用最少量的試劑進行同步篩選,。產生的信號是鮮明的、定位好并且可以檢測250amol或者10pg的點樣的測試蛋白質（GAPDH為例）,。一個cDNA蛋白質表達克隆用轉移印章技術可以進行可靠的檢測,，以錯誤閱讀框表達蛋白質的假陽性克隆比率低（11％）。這個改進的排列蛋白質的技術導致了非常敏感的蛋白質表達和高通量篩選的抗體特異性,。使用此方法,，Unigene set中表達的基因可以在一個DNA和蛋白質水平同步進行研究，并提供重組基因和蛋白質資源制作DNA和蛋白質芯片的資源,。

由于這樣的文庫存在重復,，一個改進就是生成非重復,、亦稱為單克隆（Uniclone）,、或單基因－單蛋白質系列（Unigene-Uniprotein set）基因－蛋白質只在陣列中出現(xiàn)一次,，結果導致可以在一個顯微玻片上進行陣列排列。它需要更小的體積（比如100μl）進行篩選（比如血清）,，而不是目前大PVDF膜所需的10ml,。

目前進行的工作是用人胎腦cDNA文庫（hEx1）亞表達系的寡聚核苷酸指紋圖，群集具有相似序列的克隆,，從每個群集中選擇一個克隆,，重新排列陣列生成非重復的單基因－單蛋白質系列。

 Fig.1.蛋白質組學中微陣列的應用

蛋白質和DNA微陣列可以平行設置進行同步分析文庫中的基因和其所表達的蛋白質,?？乖?抗體芯片也可以從此基因文庫中制作用于診斷。來自蛋白質芯片的重組蛋白[或者來自雙向凝膠電泳（2DE）]可以用來制作最小蛋白質鑒別物（MPIs）,它們可以用來鑒別2DE凝膠上的同源蛋白質,。它們通過使用基質輔助的激光解吸飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）進行分析,。蛋白質微陣列也被用于篩選分析（比如抗體、DNA,、RNA,、代謝物和藥物），抗體芯片用于蛋白質組分布圖,，以及核磁共振(NMR)或X線用于大規(guī)模生成的重組蛋白質的結構分析,?？s寫：PCR,，聚合酶鏈反應；IPTG,，異丙基硫代－β－D－半乳糖苷,。

直到目前，仍然沒有能夠用象DNA芯片那樣的高密度和自動化的方法分析蛋白質,。此問題在應用類似自動化技術到高通量,、大規(guī)模的蛋白質分析制作cDNA表達文庫、高密度蛋白質芯片和微陣列中變得突出,。

蛋白質芯片的近期進展

新技術

在此領域有許多其它進展,，近來已有綜述。這樣的進展包括在濾膜上制作低密度蛋白質陣列,，諸如通用蛋白質陣列系統(tǒng)（UPA）,。它建立在96孔微滴定板基礎上。在此系統(tǒng)中,，蛋白質微陣列被印到通過憎水Teflon罩所形成的含有96孔的光學平玻璃板上[10],。在每個孔中,，使用連接到精確、高速,、X-Y-Z自動儀器上的36毛細管為基礎的印刷頭點樣144元素（4×36）的陣列,。標準ELISA技術和掃描CCD檢測器被用于陣列抗原的成像。

其它蛋白質微陣列的方法被報道使用硅的光刻印刷或者金單層,，結合使用微球傳感器的微孔或噴墨到聚苯乙烯膜上,。這樣的模式牽涉到通過定型單個蛋白質（比如BSA、親和素和單克隆抗體）制作微型免疫分析模式,。

抗體芯片

免疫傳感芯片已經被研制,，從而可以同步檢測臨床分析物。這里,，捕獲抗體和分析物被排列到有十字交叉樣流室的顯微玻片上,。檢測是通過熒光標記和CCD為基礎的光學讀數裝置。這是以低密度模式（6×6模式）完成的,，但是此步驟有高通量潛能,，因為涉及到自動化成像分析和微流體力學，它已經成為酶活力和其它分析的一個未來模式(Caliper Technologies, Mountain View, CA, USA; Orchid Biocomputer, Princeton, NJ, USA),。

一個制作抗體陣列的進一步方法已經被描述,，它使用微模水凝膠‘印章‘和一個氨基接受表面。此印章將蛋白質存放為亞單層,，可以用125I標記或原子能顯微鏡顯示,，而抗體活性是保持的。

寡聚核苷酸芯片

一個凝膠光學或過硫酸鹽誘導的共聚合技術已經被發(fā)展來制作聚丙乙烯凝膠墊上的寡聚核苷酸,、DNA和蛋白質微芯片三維陣列（從10×1μm到100×100μm）,其為一個憎水玻璃界面所分隔,。三維聚丙乙烯凝膠提供了比二維玻璃支持物超過100倍固定的能力，因此顯著地增強了測量的敏感性,。

組織芯片

組織微陣列已經被研制進行腫瘤標本的高通量分子分布圖,，它使用自動穿孔柱（0.6mm寬，3－4mm高）,，采取1000個包埋在石蠟中的個體腫瘤活檢組織,，將它們排列到45×20mm石蠟塊中（可以從Beecher Instruments, Silver Spring, MD, USA購得）。連續(xù)切片后,，腫瘤標本進行免疫組化,、熒光原位雜交（FISH）和RNA/RNA原位雜交的平行分析。此系統(tǒng)能夠在不到2小時內顯微掃描含有645個標本的免疫組化陣列玻片,。它對于許多處于不同疾病階段的不同患者的同步分析,，快速建立新的候選標記基因中有應用。

芯片

捕獲和分析特異性標記的蛋白質的配體包被的表面現(xiàn)在已經有了,，包括SELDI蛋白質芯片（Ciphergen Biosystems, Palo Alto, CA, USA）,XNA on Gold(INTERACTIVA, ulm, Germany)和多種Biacore芯片（Biacore, Uppsala, Sweden）,。表面細胞質基因組共振,，此項Biacore應用的新進展對芯片模式的相互作用的研究貢獻很大。SELDI和BIA-MS技術將親和捕獲和高分辨率質譜分析與新的,、有效定性蛋白質和相互作用的配手的手段結合了起來,，并有諸如表位作圖和受體－配體或蛋白質－藥物相互作用研究的應用。

優(yōu)點和應用

陣列技術相對傳統(tǒng)分析儀器的主要優(yōu)點是廣泛的平行分析,。因為這樣的陣列或芯片比傳統(tǒng)測試系統(tǒng)要小,，它們因此在標本和試劑的使用上是高度經濟的。在制作和應用DNA芯片上已經獲得了重大的進展,，比如它們應用于差異基因表達（轉錄分布圖）,、單核苷酸多態(tài)性（SNP）基因定型應用或者多態(tài)性分析。比如,，Sequenom的MassArray（Sequenom Corp., San Diego, CA, USA）質譜為基礎的高通量基因定型涉及到自動化的陣列設計,，它測定不同基因型之間的質量差異。

蛋白質芯片同樣促進個體克隆的DNA系列信息與蛋白質產物的之間聯(lián)系,，再回到整個基因組水平,。這使得翻譯的基因產物直接經得起高通量實驗的檢驗，并建立起蛋白質表達和DNA系列數據之間的直接聯(lián)系,。這意味著,，例如，差異表達的基因通過cDNA微陣列被識別后,，同一克隆可以在不同細胞系統(tǒng)或者通過體外轉錄和/或翻譯進行同步蛋白質表達分析,。在相同的蛋白質微陣列上，表達克隆因為與其它蛋白質（比如抗體）和從核酸到小分子配體結合而被篩選出來,。蛋白質陣列的可用性應該允許下列功能的進行：（1）蛋白質－蛋白質相互作用,；（2）配體－藥物相互作用；（3）酶－底物相互作用,；（4）陣列上進行更高通量的分析,。陽性的相互作用隨之能夠通過例如一個標記藥物或配體的存在,，通過將標簽相互作用的蛋白質,，通過使用一個特異的抗體或者使用質譜測定相互作用配手的存在而被檢測出來。這個多能性應該使得蛋白質微陣列成為診斷用途,、高通量配體－受體相互作用研究以及抗體特異性定性的多用途工具,。

蛋白質芯片的一個進一步應用是體液中DNA、蛋白質,、肽和抗體的圖譜繪制,，它被認為能夠促進對健康和疾病的理解。比如,，通過篩選血清,、腦脊液和其它健康和疾病的體液可能識別與疾病相關的蛋白質,。描繪和監(jiān)測一個疾病的狀態(tài)，諸如自身免疫性疾病,，通過監(jiān)測特殊治療的效應或者抗體對疫苗的反應,，能夠產生診斷或預后抗原的信息。這樣的篩選也能夠產生新的靶標,，它在生物技術和醫(yī)學有廣泛的用途,。

大數量的重組蛋白質也能夠被用來生成特異的抗這些高通量蛋白質比如噬菌體展示的抗體。這樣的抗體本身也將成為有價值的資源,，并也能夠被用來制作抗體芯片,。然而，這種高通量生成的特異性抗體目前是昂貴和需要大量人力的,。能夠獲得大量的重組蛋白質也使得這些蛋白質大量表達,，也就能夠以高通量形式形成結晶并進行結構分析。這樣的一個創(chuàng)意目前正在德國進行,，稱為蛋白質結構工廠的一個多集團計劃,。

蛋白質組－基因組鏈接

使用單蛋白質系統(tǒng)（Uniprotein Set）中蛋白質的蛋白質芯片在蛋白質組學中的應用已經被認為在目前基因組學和蛋白質組學方法之間架立了橋梁?；蚪M學方法,，如前所述，是使用DNA芯片繪制一個細胞中mRNA庫的圖譜,，其作為基因表達的第一層次直接反映了基因活動并被用來研究基因表達和發(fā)現(xiàn)新的疾病相關的基因,。這通常是在高密度DNA芯片上進行的。蛋白質組學方法涉及使用質譜確定的肽譜,、序列標簽或者個體蛋白質裂解產物的片段－離子指紋圖在序列數據庫中識別個體蛋白質,。這兩個方法可以通過使用單克隆系列中的蛋白質進行鏈接。這涉及到具體描述質譜提供的最少系列的每個蛋白質信息,，我們命名為"最少蛋白質識別物"（MinimalProtein Identifiers,， MPIs）。MPIs含有準確的酶解產物的分子質量,，連同片段－離子數據,。它們可以從雙向凝膠電泳（2DE）上切下來的點和諸如單蛋白質系列中的重組蛋白質生成并能夠被用來識別2DE凝膠上的同源蛋白質，反過來也是一樣,。通過使用高通量的基質輔助的激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF）在數據庫中記錄結果,。一旦記錄下來，可以認為MPIs將使我們能夠快速識別已知和未知基因產物,，以及在序列數據庫中識別蛋白質,。具備有這些特點后，MPIs使得我們能夠牢靠地比較不同生物樣本的2DE凝膠，而不必計較它們的形式,、溶解度和所使用的分離技術,。此方法導致了更加可靠的蛋白質識別，因為它是從2DE凝膠點所測的MPIs與從表達蛋白質所測的MPIs進行比較,，而不是與從DNA序列預測的MPIs進行比較,。獲得的結果和識別的陽性結果可以被測序或者與從單基因微陣列獲得的表達圖譜結果進行比較，因此將2DE凝膠獲的結果與任何被研究中的系統(tǒng)表達圖譜進行了鏈接,。

未來展望

這樣一個蛋白質組學方法的缺點是它需要不僅應用已建立的技術諸如高性能的微陣列,、大規(guī)模的表達和高分辨率的2DE，也需要新發(fā)展的自動化技術,。這些包括自動化2DE,、凝膠成像、點識別,、蛋白質裂解后的點切除,、樣品純化和質譜分析以及閉環(huán)數據獲取和處理的軟件。一個高通量MALDI-TOF－MS技術近來已經被發(fā)展進行有力的,、快速和高精度的蛋白質控制,。高通量技術的發(fā)展對于這樣的蛋白質分析是需要的，因為大數量的蛋白質參與機體的自穩(wěn)態(tài),，即使是最簡單的有機體也是一樣的,。

總之，蛋白質芯片的進步依賴于改進的蛋白質表達系統(tǒng),，因為盡管E.Coli產生大量的異源蛋白質,，此系統(tǒng)有一些缺點。它們包括在蛋白質在包涵體中的聚集和累積,，以及細菌宿主不能進行翻譯后修飾,，磷酸化或糖基化。未來克服這個問題,，我們近來研制了一個在Pichi pastoris和E.coli中雙蛋白質表達系統(tǒng),，它結合了兩個系統(tǒng)的優(yōu)點，諸如可溶性蛋白質表達的改善（A.Lueking等,，未發(fā)表）,，但不需亞克隆。這樣表達的可溶性蛋白質對于許多應用是需要的,，比如應用于治療,、體外相互作用研究,、生成抗體識別結構表位以及結晶和核磁共振（NMR）研究,。具有網上檢測的高通量自動化芯片雜交設備，加上整合的圖像和數據分析工具的改進將加快DNA和蛋白質芯片輸出的速度和質量。

DNA和蛋白質芯片似乎是功能基因組學和蛋白質組學的新的和多功能工具,。人們認為蛋白質芯片將使高通量篩選廣泛種類的分子間相互作用成為可能,。因為這是一個進步非常快的領域,，蛋白質芯片對診斷,、藥物篩選、發(fā)育分析和蛋白質組學的真正貢獻還有待我們眼見為實,。