利用定制好的DNA切割酶,，研究人員可以大大提高人類細(xì)胞同源重組的概率,，這對(duì)基因治療具有巨大的應(yīng)用潛力。
通過(guò)定向同源重組,，可以改變活細(xì)胞的基因組序列,，進(jìn)而對(duì)整個(gè)動(dòng)物體進(jìn)行基因重組,，這在生物學(xué)上帶來(lái)了一場(chǎng)革命。不幸的是,，盡管傳統(tǒng)的定向策略在小鼠胚胎干細(xì)胞中非常有效,，但被用于人類時(shí)則不盡人意，其同源重組率相當(dāng)?shù)?。其他的替代方法（如利用病毒載體）也有一定效果,，但存在轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)不恰當(dāng)，或內(nèi)源基因序列被破壞的危險(xiǎn),，這會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的后果,。
在雙鏈DNA斷裂處同源重組發(fā)生的機(jī)率非常高；理論上來(lái)說(shuō),，如果能準(zhǔn)確地選擇基因組斷裂區(qū),，則基因定向化可能更加有效。其中人們熟知且最具特征的DNA結(jié)合蛋白基元是鋅指狀物,，它通過(guò)α-螺旋區(qū)域識(shí)別并結(jié)合特定的3-4個(gè)核苷酸序列,，Johns Hopkins和Srinivasan Chandrasegaran 的研究表明，交換具有不同特性的鋅指狀物區(qū)域,，可以改變核酸酶的定向性,。Utah大學(xué)的Dana Carroll 和德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心的Matthew Porteus，對(duì)該項(xiàng)工作進(jìn)行了更進(jìn)一步研究,，即利用嵌合的鋅指狀物核酸酶（ZFNs）刺激青蛙,、果蠅和人類細(xì)胞進(jìn)行同源重組（Bibikova等人，2003,；Porteus和Baltimore,，2003）。
通過(guò)與Porteus進(jìn)行合作,，Michael Holmes和他在Sangamo 生物科學(xué)公司（位于美國(guó)加利福尼亞洲的Richmond）的同事著手改進(jìn)這一技術(shù),，同時(shí)也是為了尋求新的基因治療方法。“事實(shí)上,，我們可以將鋅指狀物定位到基因組的任何序列中,，”Holmes說(shuō)，“并且,，我們可以用具有3個(gè),、4個(gè)或6個(gè)鋅指狀物的區(qū)域來(lái)完成這項(xiàng)工作，這可以使我們了解可識(shí)別9個(gè),、12個(gè)或18個(gè)堿基對(duì)的區(qū)域的基本特征,。”為了進(jìn)行切割，兩個(gè)鋅指狀物核酸酶必須同時(shí)起作用：兩個(gè)酶分別與目標(biāo)兩側(cè)的位點(diǎn)結(jié)合,，再進(jìn)行切割,，然后染色體和“供體”DNA分子之間進(jìn)行同源重組,，從而改變?nèi)旧w的基因序列。
Figure 1. ZFN-assisted homologous recombination.
(a) Two ZFNs, each with a DNA-binding domain consisting of several zinc-finger motifs engineered to bind on either side of a genomic mutation (red), introduce a double-stranded DNA break, removing the mutation. (b) The homology-directed repair pathway mediates the efficient homologous recombination of a donor DNA fragment (purple) lacking the mutation. (c) The mutated gene has been repaired.
利用人類紅白血病K562細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn),，研究小組發(fā)現(xiàn)了IL2RG基因,，該基因?qū)е耎連接嚴(yán)重結(jié)合免疫缺陷（SCID）。利用最適合的鋅指狀物核酸酶來(lái)調(diào)節(jié)沉默點(diǎn)突變體的導(dǎo)入,，研究人員將同源重組率提高到21%,。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，同源重組率仍然穩(wěn)定,，甚至在一個(gè)月之后,，被改變基因的細(xì)胞相對(duì)比例仍然保持不變。第二輪的試驗(yàn)結(jié)果表明,，在處理的細(xì)胞中,，內(nèi)源等位基因位點(diǎn)被修飾的細(xì)胞占6.6%。適當(dāng)降低雜合和純合突變體中可檢測(cè)的mRNA和蛋白質(zhì)水平,，這一試驗(yàn)技術(shù)也可被用于將結(jié)構(gòu)改變的雜合和純合突變體導(dǎo)入到相同基因中,。該研究小組聲稱，他們研制的鋅指狀物核酸酶既可調(diào)節(jié)點(diǎn)突變體的導(dǎo)入,，也可調(diào)節(jié)大序列片斷的導(dǎo)入,。
在闡明高效定向雙等位基因修飾的可行性之后，Holmes指出,，他的研究小組現(xiàn)正在著力改善這一試驗(yàn)系統(tǒng)的實(shí)際應(yīng)用性,。“我想我們的短期目標(biāo)是構(gòu)建更好的載體系統(tǒng)，以使我們能將我們的核酸酶和供體分子導(dǎo)入到一些重要的分子中,，比如T細(xì)胞和干細(xì)胞，并使這項(xiàng)技術(shù)既可以用于動(dòng)物研究,，必要時(shí)也可用于臨床試驗(yàn),。”這項(xiàng)技術(shù)可能對(duì)基因治療的應(yīng)用具有重要作用，用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的初步計(jì)劃已在進(jìn)行中,。“我們正在計(jì)劃利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行X連接SCID項(xiàng)目,，我們認(rèn)為，另外一個(gè)項(xiàng)目可能在不久的將來(lái)對(duì)臨床試驗(yàn)具有非常大的潛力,，那就是以CCR5為目標(biāo),，對(duì)CCR5 進(jìn)行修飾，來(lái)增加細(xì)胞抵抗HIV感染的抗性,。”
REFERENCES
rnov, F.D. et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature; published online 3 April 2005. | Article | PubMed |
Porteus, M.H. & Baltimore, D. Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells. Science 300, 763 (2003). | Article | PubMed | ISI |
Bibikova, M. et al. Enhancing gene targeting with designed zinc-finger nucleases. Science 300, 764 (2003). | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
