突變體是某個性狀發(fā)生可遺傳變異的材料，或某個基因發(fā)生突變的材料,。長期以來,，水稻育種家盡力地發(fā)現(xiàn)和分離有價值的自然突變和變異材料。自20世紀70年代以來,，γ  射線和  MNU  或  EMS  理化誘變創(chuàng)制的人工突變體在遺傳育種中開始應(yīng)用,，此外，T-DNA  插入和轉(zhuǎn)座子標簽等插入突變篩選突變體法的發(fā)展,，大大地加快了突變體的創(chuàng)制步伐,，全球建立了一系列的突變體庫  (Sallaud  et  al.，2004,；Kurata  et  al.,，2005),。隨著水稻全基因組測序工作的完成,，水稻突變體已廣泛應(yīng)用于鑒定調(diào)控水稻形態(tài)和生理性狀與基因的連鎖分析及其相關(guān)基因的克隆和功能研究,。本文就水稻突變體的創(chuàng)制方法、變異的機制,、突變體/基因分類及數(shù)量,、水稻重要基因的克隆等研究進展進行綜述,。  

1  水稻突變體創(chuàng)制方法  

1.1  自發(fā)突變  

　　在自然環(huán)境下發(fā)生的遺傳信息的變異或突變,。但突變率低，一般少于0.1％,。水稻的單蘗突變體  moc1  就屬于自發(fā)突變,。  

1.2  物理、化學誘變  

　　用物理,、化學方法可快速獲得較廣的突變譜及穩(wěn)定的遺傳變異,，可導(dǎo)致多位點的變異,，比較容易得到飽和突變體庫。且具隨機突變優(yōu)點,。突變率可達3％左右。  

　　應(yīng)用輻射產(chǎn)生水稻突變體的電離輻射主要是  X  射線,、γ  射線,、紫外線,、α  及  β  粒子,、質(zhì)子及中子等。一般水稻大部分以處理干種子為主,，也可處理幼穗分化的植株,。處理干種子時，輻射劑量一般在1.55×10-2～2.58×10-2  C•kg-1•min-1  左右,，通常劑量不超過160倫/分,。采用高劑量可以獲得高的突變率，但大部分導(dǎo)致植株不育或畸形,。物理輻射獲得突變體約3萬株,，如水稻脆稈  bc1  突變體、無趨光性  cpt1  突變體和無冠狀根  crl2  突變體  (Li  et  al.,，2003b,；Haga  et  al.,，2005；Inukai  et  al.,，2005),。  

　　化學誘變劑的種類很多，可分為4類：(1)堿基類似物及有關(guān)的化合物,，5-溴-尿嘧啶,、5-溴去氧尿核苷、2-氨基-嘌呤和8-乙氧基咖啡堿,；(2)抗生素,，重氮絲氨酸,、絲裂霉素  C  和鏈霉黑素,；(3)烷化劑，甲基磺酸乙酯(  EMS,，ethy1  methanesulfonate  ),、N-甲基-N-亞硝基脲(  MNU，methylnitrosourea  )烯亞胺,、亞硝基乙基尿烷和亞硝基乙基尿,；(4)其他種類的誘變劑，亞硝酸和吖啶,。  

　　MNU  和  EMS  化學誘變處理種子最為普遍,，誘變效應(yīng)與化學誘變劑的濃度、溫度,、處理持續(xù)時間等有關(guān),。如  MNU  法和  EMS  法分別用0.015％～0.2％  MNU  和1.0％  EMS  在厭氧條件下浸11～18小時，水洗30分鐘后,，即可催芽,。如水稻無冠狀根  crl1  突變體  (Inukai  et  al.，2005),。  

1.3  插入突變法  

1.3.1  T-DNA  插入法  T-DNA  是來自根癌農(nóng)桿菌  Ti  質(zhì)粒,，約20  kb，包含?；诎`堿生物合成和冠癭瘤生長的基因,，隨機地整合到植物染色體上。自  Hiei  等(1994)首次報道用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對水稻成功地實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化以來,，該方法在水稻遺傳轉(zhuǎn)化中得到廣泛應(yīng)用并不斷完善,，并被廣泛應(yīng)用于水稻  T-DNA  插入突變體庫的構(gòu)建。一旦獲得  T-DNA  突變,，便可以  T-DNA  作標簽直接分離基因  (Walden  et  al.,，1991),，如水稻  OsCP1  基因的克隆。T-DNA  在基因組中隨機插入后位置比較固定,，然而,，T-DNA  插入對特定的基因類別沒有明顯的偏向性  (Alonso  et  al.，2003),。  

1.3.2  轉(zhuǎn)座子法  轉(zhuǎn)座子(  transposon  )是染色體上一段可移動的  DNA  片段,，它可從染色體的一個位置跳到另一個位置。當轉(zhuǎn)座子跳躍而插入到某個功能基因時,，就會引起該基因的失活,，并誘導(dǎo)產(chǎn)生突變型，而當轉(zhuǎn)座子再次轉(zhuǎn)座或切離這一位點時,，失活基因的功能又可得到恢復(fù),。遺傳分析可確定某基因的突變是否由轉(zhuǎn)座子引起。用轉(zhuǎn)座子引起的突變的轉(zhuǎn)座子  DNA  為探針,，從突變株的基因組文庫中釣出含該轉(zhuǎn)座子的  DNA  片段,，并獲得含有部分突變株  DNA  序列的克隆，進而以該  DNA  為探針,，篩選野生型的基因組文庫,，最終得到完整的基因。  

　　根據(jù)轉(zhuǎn)座子的增殖方式,，可分轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)座子兩類,，相應(yīng)地可利用轉(zhuǎn)座子插入法(  Ac/Ds  系統(tǒng)插入)  和逆轉(zhuǎn)座子插入法  (逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子  Tos17)  建立水稻突變體庫。  

　　Ac/Ds  系統(tǒng)：Ac/Ds  系統(tǒng)是玉米中的一個轉(zhuǎn)座子家族,。Ac  因子單獨存在便可引起轉(zhuǎn)座突變，但變異不穩(wěn)定,，Ds  因子在有  Ac  因子或合成轉(zhuǎn)座酶的序列存在的條件下,，才會引起插入突變。Ac/Ds  因子以非復(fù)制的方式轉(zhuǎn)座即所謂“切粘”機制,；但也會在染色單體間發(fā)生基因轉(zhuǎn)換,，使轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)增多，如水稻花粉育性相關(guān)的  aid1  突變體  (Zhu  et  al.,，2004),。  

　　逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子  Tos17：逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的增殖和轉(zhuǎn)座子均以  RNA  為中介，通過  DNA-RNA-DNA  的方式進行,，涉及逆轉(zhuǎn)錄過程,，因而被稱為逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(  retrotransposon  )。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的主要特征是兩端具有長的同向末端重復(fù)序列(  long  terminal  repeat,，LTR  ),。LTR  主要攜帶有轉(zhuǎn)錄起始和終止信號及轉(zhuǎn)座所需的調(diào)控序列,，在正常條件下它們是失活的。由于逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子通常只引起穩(wěn)定的突變,，因此用常規(guī)的遺傳分析方法,，很難區(qū)分逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子引發(fā)的突變和其他因素引起的變異。盡管水稻逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)較多,，研究難度較大,，但日本學者  Hirochika  等(1996)建立了水稻逆轉(zhuǎn)座子  Tos17  突變體庫，Sato  等(1999)利用這些逆轉(zhuǎn)座子  Tos17  基因敲除體系分離了  OsH15  等水稻基因,。  

2  突變的機制  

　　突變的本質(zhì)就是  DNA  序列的改變,，包括單個堿基或大的片段發(fā)生突變、插入,、缺失或結(jié)構(gòu)重排,，從而導(dǎo)致遺傳信息的改變。突變的機制主要有以下幾種,。  

2.1  直接作用于  DNA  模板  

　　亞硝酸和烷化劑等化學誘變劑可直接作用于  DNA,，改變模板的性質(zhì)或干擾復(fù)制，使錯誤的堿基插入而產(chǎn)生突變,。如最常用的  EMS  化學誘變所導(dǎo)致的  DNA  突變,。  

2.2  堿基類似物誘變  

　　DNA  復(fù)制時滲透入并且與互補鏈上的堿基生成氫鍵而配對，從而抵抗  DNA  酶的3'-5'外切核酸酶活性的校對功能,。如5-溴-尿嘧啶,、5-溴去氧尿核苷、2-氨基-嘌呤,、8-乙氧基咖啡堿所導(dǎo)致的  DNA  突變,。  

2.3  移碼突變  

　　吖啶橙、原黃素和吖黃素等吖啶類染料分子均含有吖啶稠環(huán),。這種三環(huán)分子的大小與  DNA  的堿基對大小差不多,，可以嵌合到  DNA  的堿基對之間，于是原來相鄰的兩個堿基對分開一定的距離,，含有這種染料分子的  DNA  在復(fù)制時,，由于某種目前尚不知曉的原因，可以插入一個堿基,，偶爾也有兩個,。這樣就出現(xiàn)一個或幾個堿基對的插入突變。有時也有很低頻率的單堿基缺失突變,。所有這些突變,，都引起閱讀框的改變。  

2.4  轉(zhuǎn)座成分的致突變作用  

　　生物體內(nèi)含有許多轉(zhuǎn)座成分,，它們一般長數(shù)百至數(shù)千  bp,，可以通過一種復(fù)雜的轉(zhuǎn)座機制將其一個復(fù)制拷貝插入到基因組的另一個位點,。如果這個位點處于一個基因內(nèi)部，這種大片段的插入常常造成基因失活,。  

2.5  紫外線等的致突變作用  

　　紫外線照射  DNA,，由于高能粒子的直接作用和自由基的間接作用，引起  DNA  分子的各種損傷,，嘧啶二聚體是其中一種重要的損傷,。這些損傷誘發(fā)了錯誤潛伏的  SOS  修復(fù)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致很高的突變率,。  

3  水稻突變體和基因分類及數(shù)量  

　　自20世紀70年代以來,，理化誘變法及插入突變法的應(yīng)用，大大地加快了突變體的創(chuàng)制步伐,，從而建立了一系列的突變體庫,。至2004年，韓國構(gòu)建了由3萬個水稻  T-DNA  插入突變體群體,，法國構(gòu)建了由6000多個水稻  T-DNA  插入突變體群體  (Sallaud  et  al.,，2004)，日本  Shimamoto  實驗室利用  Ac/Ds  轉(zhuǎn)座子標簽已創(chuàng)造6000多個水稻突變體,，Hirochiko  實驗室應(yīng)用逆轉(zhuǎn)座子Tos-17  也構(gòu)建了突變體群體,，還有澳大利亞、荷蘭和美國等不同國家的科學家也正致力于水稻插入突變體庫的構(gòu)建(朱克明  等,，2006),。我國的  T-DNA  插入突變?nèi)后w5萬個株系以上；物理輻射突變體約3萬株,；EMS  化學誘變突變體約2萬株(圖1),。加之，全球有12萬余份稻種資源,，我國有8萬余份,。這些豐富的突變或變異材料，為大規(guī)模發(fā)掘和分析基因的結(jié)構(gòu)和功能提供了必要的條件,。  

　　水稻突變體分類參照  Kurata  等(2005)的方法，分成營養(yǎng)器官,、生殖器官,、異時性、顏色,、種子,、抗性以及數(shù)量性狀  (QTLs)  7大類，22個亞類(表1),。在1698個分類的水稻突變體和基因中,，營養(yǎng)器官,、生殖器官、異時性,、顏色,、種子、抗性以及數(shù)量性狀的突變體/基因數(shù)分別占16.25％,、27.32％,、0.23％、7.83％,、13.89％,、16.96％和17.49％。  

4  水稻重要基因的克隆  

　　產(chǎn)生的突變體已用于鑒定調(diào)控水稻形態(tài)和生理性狀與基因的連鎖分析以及基因的定位與克隆,。1998年,，國際水稻遺傳協(xié)會報告了571個定位的突變體基因。2005年6月,，Gramene  網(wǎng)站報道了1488個水稻突變體,，Oryzabase  網(wǎng)站公布了約1698個水稻突變體和基因(含數(shù)量性狀基因)，中國水稻研究所開設(shè)的國家水稻數(shù)據(jù)中心  (China  Integrated  Rice  Data  Center,，CIRDC)  網(wǎng)站  (http://www.ricedata.cn)  也開始陸續(xù)公布“水稻突變體表型-基因克隆-分子育種”的相關(guān)數(shù)據(jù),。雖然全球已分離了3萬條水稻  cDNAs  和40萬條  ESTs，但大部分特殊性狀基因尚未分離,，許多水稻突變體材料尚未分類,。隨著水稻全基因組測序的完成和克隆技術(shù)的迅速發(fā)展，人們對有益基因定位,、克隆,、轉(zhuǎn)移和累加越來越關(guān)注。自1995年應(yīng)用圖位克隆技術(shù)在水稻中成功分離  Xa21  基因以來,，已克隆了約43個水稻突變體基因(表2),，其中包括我國克隆的  MOC1、BC1  和  ALK  等基因,。  

4.1  水稻白葉枯病抗性基因  Xa21  

　　1992年,，美國康奈爾大學和國際水稻研究所聯(lián)合，Ronald  等以供體親本非洲野生稻品種  Oryza  longistaminata  與受體親本  IR24  構(gòu)建而成的含有  Xa21  基因的近等基因系為材料,，將  Xa21  基因定位于第11染色體上,。1995年，中國科學院遺傳研究所與美國加州大學戴維斯分校的科學家合作,，成功地采用圖位克隆方法獲得了水稻的白葉枯病抗性基因  Xa21,。Xa21  是一個兼具亮氨酸富集重復(fù)序列  (LRR)  和絲氨酸蘇氨酸激酶  (STK)  的植物抗性基因  (Song  et  al.，1995)。  Xa21  的  LRR  受體結(jié)構(gòu)域與  CF-9  的同源性暗示它也是—個胞外受體,，可能直接與產(chǎn)生的多肽相互作用,。Xa21  的  STK  區(qū)域與番茄  Pto  產(chǎn)物同源，可能具有相似的作用,。在動物細胞中,，配體與受體酪氨酸激酶的胞外結(jié)構(gòu)結(jié)合誘導(dǎo)受體的同型二聚反應(yīng)，自動激發(fā)磷酸化反應(yīng),。Xa21  作為一個受體類似的激酶在病原菌識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用機制可能相似,。  

4.2  水稻分蘗控制基因  MOC1  

　　分蘗是影響單產(chǎn)的重要農(nóng)藝性狀之一，是單子葉植物在生長發(fā)育過程中形成的一種特殊的分枝特性,，對超高產(chǎn)育種和“量化理想株型”的構(gòu)建具有重要意義,。我們在粳稻品種  H89025  中發(fā)現(xiàn)的天然  moc1  突變體，完全喪失了分蘗能力,，只有一個主莖稈,。受單個核基因的隱性基因控制，MOC1  位于第6染色體上,。  moc1  突變體在  ORF1  編碼區(qū)內(nèi)插入了一個1.9  kb  的逆轉(zhuǎn)座子序列,，轉(zhuǎn)錄中斷而造成蛋白質(zhì)的翻譯提前終止。MOC1  編碼  GRAS  家族的轉(zhuǎn)錄因子,，決定腋生分生組織起始和生長,。水稻幼苗基部不伸長節(jié)間的解剖研究表明，野生型水稻有分蘗芽的形成,，而  moc1  突變體則沒有,，說明單稈表型是由于分蘗芽形成的缺陷造成的  (Li  et  al.，2003a),。  

4.3  水稻脆稈控制基因  BC1  

　　水稻脆稈秈稻  bc1  突變體,，由中國水稻研究所從輻射中獲得，表現(xiàn)脆嫩,，易折斷,，比野生型有較少的纖維素和較多的木質(zhì)素，單糖含量也受影響,。bc1  突變體的莖,、葉脆嫩性狀受單隱性基因控制，BC1  位于第3染色體上,。序列分析表明,，在  bc1-1  突變體中，發(fā)現(xiàn)一個單堿基  (T)  插入在第425密碼子中  (TTC→TTTC),，產(chǎn)生  a+1  的移碼突變。bc1-101  等位基因突變是由于第一個外顯子236和237密碼子處有4個堿基的缺失(AGGTGC→AC)。這個缺失引起了移碼突變,，從而導(dǎo)致在292密碼子處產(chǎn)生終止密碼子,。BC1  調(diào)控細胞壁的加厚和植株的機械強度，編碼一個類  COBRA  蛋白基因,。RNA  原位雜交的結(jié)果表明  BC1  基因主要在維管束和厚壁組織表達,。bc1  突變體的發(fā)掘和克隆不僅剖析了細胞壁的形成和植株機械強度的分子機理，而且還可能有利于選育谷草兼用型水稻品種  (Li  et  al.,，2003b),。  

4.4  水稻半矮稈基因SD1  

　　水稻株高是一個與高產(chǎn)育種密切相關(guān)的重要農(nóng)藝性狀。目前,，矮稈突變體已注冊到  d-61  和  sd-8,。在所有已知的株高突變體中，絕大多數(shù)與  GA  (gibberellin)  和  BR  (brassinosteroid)  激素有關(guān),，特別是與  GA  合成有關(guān),。如  D35、SD1  和  D18  基因編碼  GA  生物合成,、D1,、GID2、  pkl  和  SLR1  參與  GA  信號轉(zhuǎn)導(dǎo),。OsBR6ox,、D2、D11  和  BRD1  編碼  BR  生物合成,、D61  和  Osbril  基因參與  BR  信號轉(zhuǎn)導(dǎo),。2002年，  Sasaki  等克隆了  SD1  基因,，第一次綠色革命基因,。SD1  等位基因含383個堿基缺失，引起了移碼突變,，而產(chǎn)生終止密碼子,。SD1  編碼  GA20  氧化酶(分3步從  GA53→A44→A19→A20)。GA20ox-2  基因在葉片和莖中表達,，產(chǎn)生較短的葉片和較矮的植株,。  

4.5  水稻抽穗期基因  Hd1  

　　Hd1  是第一個克隆的水稻數(shù)量性狀基因。利用圖位克隆方法對重要的數(shù)量性狀基因進行克隆,，實質(zhì)上就是對多個數(shù)量性狀基因中起主效作用的1個或幾個進行精細定位,，然后采取與質(zhì)量性狀一樣的克隆方法。Yano  等(2000)利用日本晴和  Kasalath  衍生的群體,，共檢測到15個  QTL,；再通過構(gòu)建近等基因系，圖位克隆了  Hd1、Hd6,、Hd3a  和  Ehd1  系列基因4個,。Hd1  含2個外顯子，編碼一個395個氨基酸的蛋白,，是擬南芥帶有鋅指結(jié)構(gòu)域的  CO  家族中的一員,。Hd1  在日本晴與  Kasalath  等位基因之間有許多結(jié)構(gòu)上的不同,，Kasalath  等位基因第2個外顯子有一個2  bp  的缺失,，產(chǎn)生一個提前的終止子，Kasalath  的  Hd1  蛋白就缺少了  C  末段區(qū)域而短于日本晴蛋白,。Hd1  可能具有雙重功能,，在短日照促進抽穗和在長日照抑制抽穗,。由于鋅指結(jié)構(gòu)的存在，Hd1  會與轉(zhuǎn)錄活性有關(guān),，但由于  Hd1  本身的轉(zhuǎn)錄并不受日照長短的影響,，推測轉(zhuǎn)錄受它影響的基因的表達受光周期變化的控制。  

4.6  水稻糊化溫度控制基因  ALK  

　　糊化溫度是僅次于直鏈淀粉含量的評價水稻稻米蒸煮品質(zhì)的重要指標,。許多文獻報道,，該性狀受一主效基因控制，因此對水稻糊化溫度基因的克隆,，有助于水稻品質(zhì)的分子改良,。中國水稻研究所的科研人員采用圖位克隆法已成功分離到水稻糊化溫度基因  ALK，序列分析表明其編碼可溶性淀粉合酶Ⅱ,。進一步比較不同品種間該基因的  DNA  序列以及堿消法分析結(jié)果,，推測出  ALK  基因編碼區(qū)內(nèi)的堿基替換可能引起了支鏈淀粉晶體層結(jié)構(gòu)的改變，從而導(dǎo)致糊化溫度的變化,?；蚩寺〉玫搅斯δ芑パa實驗的證實，從而為淀粉合成基因的表達調(diào)控提供了理想的材料,，為淀粉合成代謝機理的闡明打下了基礎(chǔ)(高振宇  等,，2003)。  

5  展望  

　　水稻全基因組測序完成將大大促進水稻重要性狀基因的分離和特征化,。創(chuàng)制和建立水稻飽和突變體庫并建立突變體研究體系,，進而定位和克隆不同發(fā)育和生理途徑的基因及獲取高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì),、多抗,、高效和環(huán)境友好型新品種(系)將是下一步的研究重點。  

　　(1)  創(chuàng)制和建立水稻飽和突變體庫  

　　利用突變體庫研究5萬個水稻基因的功能就要建立飽和突變體庫,。按照  Krysan  等(1999)建立飽和插入突變體庫的公式  P=1-(1-f)n,，要獲得  P  為99％的概率,，平均基因大小為4  kb  推算，則需要  n  為約50萬個突變體庫的容量,，但從目前的報道來看還相差很大,。然而，從擬南芥插入突變體庫的構(gòu)建及其研究所取得的進展,，可以預(yù)見隨著水稻飽和突變體庫的建立，會有更多的水稻基因被克隆鑒定,，特別是控制重要農(nóng)藝性狀的基因,，這將會對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生巨大影響。  

　　(2)  建立突變體研究體系  

　　收集和定位不同發(fā)育和生理途徑的基因?qū)⒂欣诮沂具@些基因的網(wǎng)絡(luò)效應(yīng),。由于植株的生長反應(yīng)和形態(tài)突變體對研究水稻發(fā)育起著重要作用,，單個基因的特征化不足于完成這類研究。只有用基因組和生物信息學等系統(tǒng)工作,，建立一個所有基因敲除的突變體研究體系,、突變體和變異材料的芯片分析及一個生物信息學處理大量數(shù)據(jù)的理想的分析系統(tǒng)，才能共同促進功能基因組學研究,。  

　　(3)  重要基因的克隆  

　　超高產(chǎn)相關(guān)基因和抗逆基因的克隆是研究的重點,，特別是與少蘗、大穗,、粒重,、高產(chǎn)及高光效等超高產(chǎn)相關(guān)的突變體或基因；發(fā)掘和克隆水稻植株化感作用,、氮/磷肥高效利用等種質(zhì)和基因,，以期減少除草劑、農(nóng)藥和化肥等化學制劑的使用,，保護生態(tài)環(huán)境,，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展；環(huán)境鈍感的優(yōu)質(zhì)突變體/基因以及特優(yōu)米基因和第三代功能米基因的鑒定和克隆,。  

　　(4)  為分子育種提供物質(zhì)基礎(chǔ)  

　　傳統(tǒng)水稻育種的成功主要依賴于一系列優(yōu)異基因(矮稈基因,、抗病和細胞核雄性不育基因)的發(fā)掘和利用，突變體的發(fā)掘和功能基因組發(fā)現(xiàn)的新基因也將大大促進水稻新品種的選育,，特別是品種之間的序列與表型差異將為分子育種提供一個前所未有的機會,。3～4萬個水稻基因的功能注釋完成以后，對植物界有普遍意義,。目前,，已利用遺傳工程將單個或多個目的基因?qū)胨驹耘嗥贩N，改良作物某些性狀,。隨著分子育種技術(shù)的發(fā)展,，人們將利用已克隆的水稻基因,，結(jié)合高效轉(zhuǎn)化、分子標記輔助選擇與常規(guī)育種技術(shù),，建立分子設(shè)計育種的技術(shù)平臺,，選育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì),、多抗,、高效和環(huán)境友好型新品種(系)。