Nature Methods雜志是Nature出版社旗下的著名期刊之一,，也是方法學(xué)領(lǐng)域的權(quán)威刊物，主要刊載具有創(chuàng)新性的技術(shù)進展,，在去年之前,，大陸學(xué)者在此刊物上發(fā)表的技術(shù)文章僅有3篇。近期來自北京大學(xué)生科院,，加州大學(xué)洛杉磯分校的研究人員在這一著名期刊上發(fā)表了題為“TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish”的文章,，獲得了備受關(guān)注的技術(shù)：TALEN的新進展，這也是近年來北京大學(xué)的首篇Nature Methods文章,。
文章的通訊作者是北京大學(xué)生科院張博（Bo Zhang）教授,，以及加州大學(xué)洛杉磯分校的林碩(Shuo Lin)教授,，其中張博教授獲得過不少斑馬魚研究方面的重要成果，曾成功突變了7個斑馬魚內(nèi)源基因,，其中大部分基因的突變效率大于30%,，有3個基因的突變效率更是接近100%，并且近年以通訊作者也在Nat. Biotechnol,，PNAS等高水平雜志發(fā)表論文多篇,，獲國家自然科學(xué)獎二等獎與中國高校科學(xué)技術(shù)獎一等獎,。
斑馬魚（Danio rerio）是進行發(fā)育生物學(xué)研究的理想模式脊椎動物,。不少重要的科學(xué)發(fā)現(xiàn)就來自于這種小動物，張博教授研究組主要以其功能基因組研究手段為切入點,，進行基因功能以及表達調(diào)控機制的研究,。此次這項研究則主要聚焦于目前一種備受關(guān)注的技術(shù)在斑馬魚同源重組中的精確基因組修改。
這種技術(shù)就是TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease) ,，這是一種人工改造的限制性內(nèi)切酶,，是將TALE的DNA結(jié)合域與限制性內(nèi)切酶 (FokⅠ) 的DNA切割域融合而得到。由于TALE的DNA結(jié)合域中的重復(fù)氨基酸序列模塊可以與單堿基發(fā)生特異性結(jié)合,，因此理論上可以任意選擇靶DNA序列進行改造,，是一種非常有效的基因組改造工具酶。
由于TALEN在細胞中與基因組的靶位點結(jié)合,，形成二聚體發(fā)揮內(nèi)切酶活性,，導(dǎo)致左右TALEN的spacer區(qū)域發(fā)生雙鏈DNA斷裂（DSB，Double-Strand Breaks）,，從而誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機制,。細胞可以通過非同源性末端接合機制（NHEJ, Non-homologous End Joining）修復(fù)DNA。NHEJ修復(fù)機制并不精確,，極易發(fā)生錯誤（缺失/插入）,，從而造成移碼突變，因此可以達到基因敲除的目的,。
2012年Science十大科學(xué)突破中提到了這種技術(shù),，指出這種方法相比ZFNs和 morpholinos具有幾個優(yōu)勢：它們更便宜、更有效,，尤其是以一種開發(fā)活性形式應(yīng)用時,。ZFNs只能靶向特異序列，而TALENs有潛力對任何的DNA序列起作用,。Morpholinos的效應(yīng)是短暫的,，而TALENs可造成永久性的改變。
以斑馬魚為研究對象,，在最新這項研究中,，研究人員提出TALENs在斑馬魚同源重組的靶向基因敲除能實現(xiàn)精密基因組改造,。他們將TALEN的mRNAs，以及一種帶有長同源臂（靶向酪氨酸羥化酶）的供體載體共同注射到斑馬魚卵細胞中,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種有效的基因修改能通過生殖系傳遞,。此外研究人員還通過靶向另外兩種基因，證實了這一點,。
這不僅提出了一種基因工程的新方法,，而且?guī)в衐sDNA供體的斑馬魚同源重組，也拓展了這種模式動物的應(yīng)用前景,。（生物谷Bioon.com）
doi:10.1038/nmeth.2374
PMC:
PMID:
TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish
Yao Zu,Xiangjun Tong,Zhanxiang Wang,Da Liu,Ruochuan Pan, Zhe Li,Yingying Hu,Zhou Luo,Peng Huang,Qian Wu,Zuoyan Zhu, Bo Zhang & Shuo Lin
We report gene targeting via homologous recombination in zebrafish. We co-injected fertilized eggs with transcription activator–like effector nuclease mRNAs and a donor vector with long homologous arms targeting the tyrosine hydroxylase (th) locus, and we observed effective gene modification that was transmitted through the germ line. We also successfully targeted two additional genes. Homologous recombination in zebrafish with a dsDNA donor expands the utility of this model organism.
