上周在美國(guó)冷泉港(Cold Spring Harbor)參加了單細(xì)胞分析會(huì)議(single cell analysis),， 這是一個(gè)非常令人激動(dòng)的前沿學(xué)術(shù)會(huì)議,，深深的體會(huì)到了單細(xì)胞基因組學(xué)的時(shí)代已經(jīng)來(lái)臨。
Cold Spring Harbor的會(huì)議是公認(rèn)的高水準(zhǔn)的會(huì)議,，它有幾個(gè)特點(diǎn)：首先,，所做的報(bào)告都是最新的研究，組織方特別強(qiáng)調(diào),，希望介紹尚未發(fā)表的研究進(jìn)展,。我們知道，當(dāng)一篇文章發(fā)表出來(lái)了的時(shí)候,，這個(gè)研究一般在一年之前就已經(jīng)基本結(jié)束了,。鼓勵(lì)把正在進(jìn)行中的項(xiàng)目拿出來(lái)講，保證的這個(gè)會(huì)議的前沿性?，F(xiàn)場(chǎng)的報(bào)告都有清晰的錄像,，考慮到許多的talk是未發(fā)表的工作，這些錄像只有參會(huì)者才有權(quán)利看到,。其次,，會(huì)議有大量的討論時(shí)間,。包括兩次茶歇，wine and cheese party, banquet,還有晚上一直開放的酒吧,。給了與會(huì)者許多非正式交流的機(jī)會(huì),。第三，收費(fèi)貴,，參加的基本都是PI,，受邀或者從提交的abstract挑選出的speaker都是這個(gè)領(lǐng)域里做的最好的人，我自己能被選中做presentation,，感到非常有幸。
單細(xì)胞測(cè)序最早的文獻(xiàn),，據(jù)我所知應(yīng)該是Harvard的George Church在6年前Nature
Biotechnology上發(fā)表的,。由于當(dāng)時(shí)測(cè)序的價(jià)格昂貴，并沒有立刻開始廣泛應(yīng)用,。隨著二代測(cè)序的普及,，單個(gè)基因組測(cè)序價(jià)格降到5000美元，單細(xì)胞測(cè)序迎來(lái)了迅猛發(fā)展的時(shí)刻,。2012年,，單細(xì)胞測(cè)序研究所發(fā)表的文獻(xiàn)包括，華大基因兩篇Cell文章上介紹的對(duì)上百個(gè)腫瘤單細(xì)胞基因組測(cè)序的分析,， 斯坦福大學(xué)Stephen Quake在Cell上發(fā)表的對(duì)單個(gè)精子的測(cè)序,， 哈佛的Sunny Xie實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的兩篇Science上的文章介紹一個(gè)新的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)， 還有Cold Spring Harbor的Jim Hicks在Nature上發(fā)表的對(duì)乳腺癌的單細(xì)胞CNV研究等,。從文章的檔次上可以看出,，單細(xì)胞基因組學(xué)的勢(shì)頭相當(dāng)強(qiáng)勁。
單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)最常用的方法是MDA方法,，這種方法的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)基因組的覆蓋率高,，缺點(diǎn)是擴(kuò)增不均勻，比較適用于做SNP和mutation相關(guān)的研究,。我實(shí)驗(yàn)室用這個(gè)方法做的單細(xì)胞的覆蓋率在1X的深度下就達(dá)到了30%,。 有意思的是這次會(huì)議中，有一半的talk是關(guān)于微流控技術(shù)的,。原因是,，微流控平臺(tái)是公認(rèn)的可以降低單細(xì)胞測(cè)序的噪聲，使得基因組擴(kuò)展更加均勻,。同時(shí)微流控平臺(tái)也適合于分離單細(xì)胞,。最近Fluidigm出了一個(gè)C1的單細(xì)胞擴(kuò)增儀器，現(xiàn)場(chǎng)幾乎所有做單細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)室都表示出了購(gòu)買的興趣,，足見微流控技術(shù)的吸引力,。單細(xì)胞測(cè)序最容易出現(xiàn)的問題是污染,，一般建議是在專門的獨(dú)立的超凈間里進(jìn)行，并且此超凈間不應(yīng)該做任何非單細(xì)胞的實(shí)驗(yàn),。
目前單細(xì)胞研究的主要應(yīng)用領(lǐng)域包括腫瘤,，循環(huán)腫瘤細(xì)胞，干細(xì)胞等,。但有意思的是,，現(xiàn)場(chǎng)的好幾個(gè)報(bào)告都不約而同的做了同樣?xùn)|西，看來(lái)大家的想法都非常相近,?？戳吮酒┪牡牟┯讶绻信d趣做單細(xì)胞基因組研究，請(qǐng)慎重,，很有可能你的想法別人已經(jīng)做到9成,，接近發(fā)表了，我非常歡迎感興趣的人和我討論或者合作,。
作者介紹：
賀建奎,，南方科技大學(xué)的副教授，研究領(lǐng)域：遺傳學(xué)與生物信息學(xué)中的基因組學(xué),。
單細(xì)胞基因組測(cè)序技術(shù)流程
單細(xì)胞基因組技術(shù)是06年之后開始火起來(lái)的,，已經(jīng)應(yīng)用到各個(gè)領(lǐng)域，植物細(xì)胞,、微生物和動(dòng)物細(xì)胞尤其是人體細(xì)胞,。做這個(gè)東西有三個(gè)難點(diǎn)：第一，是單細(xì)胞的獲??；第二，單細(xì)胞基因組的多重?cái)U(kuò)增,；第三,，就是高通量測(cè)序以及組裝。
第一,，單細(xì)胞的分揀
1. 梯度稀釋：類似于微生物的純培養(yǎng)手段,，既繁瑣也容易污染。
2.顯微操控：在顯微鏡小用類似于注射器的裝置分離單細(xì)胞,，可操作性不好,；
3. 流式細(xì)胞分揀：流式細(xì)胞分揀可以分離大量的同類型的細(xì)胞，也是在MDA技術(shù)出現(xiàn)之前最普遍使用的方法,，現(xiàn)在也有很多實(shí)驗(yàn)室再使用,。缺點(diǎn)仍然是對(duì)實(shí)驗(yàn)室凈化要求極高，而且并不能實(shí)現(xiàn)完全意義上的單細(xì)胞測(cè)序,。
4. 微流控芯片：就是博主所提到的最火的,，這個(gè)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于細(xì)胞分揀和單細(xì)胞的多重?cái)U(kuò)增可以在一張芯片上完成,，而且依據(jù)芯片的設(shè)計(jì)，可以同時(shí)做多個(gè)細(xì)胞的擴(kuò)增,，就是傳說(shuō)中的芯片實(shí)驗(yàn)室（Lab on a Chip）,，擴(kuò)增完成之后，收集擴(kuò)增產(chǎn)物,，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增質(zhì)量就可以做相應(yīng)的測(cè)序準(zhǔn)備了,，剩下測(cè)序和組裝的跟宏基因組測(cè)序類似。
第二,，單細(xì)胞基因組的多重?cái)U(kuò)增
目前單細(xì)胞基因組測(cè)序的關(guān)鍵點(diǎn)在于足夠的單細(xì)胞DNA的獲得,，主要通過多重置換擴(kuò)增反應(yīng)（ MDA）完成。在微生物細(xì)胞中細(xì)菌中幾個(gè)飛克 (10-15g)的DNA能擴(kuò)增得到微克(10-6g)的高分子量DNA (Zhang et al, 2006),，擴(kuò)增得到的DNA 適合DNA文庫(kù)的構(gòu)建,，MDA生成的DNA也可直接作為模板進(jìn)行測(cè)序。
Stanford的Stephen Quake實(shí)驗(yàn)室去年發(fā)表了一篇Cell文章（Wang et al 2012）, 是測(cè)人類精子的單細(xì)胞基因組的,，“這項(xiàng)研究第一次繪制了個(gè)體重組圖譜,，也首次發(fā)現(xiàn)了來(lái)自同一個(gè)人的不同精子的不同突變率”,。利用的平臺(tái)是微流控芯片+MDA擴(kuò)增+ Illumina HiSeq高通量測(cè)序的方法,；Harvard的謝曉亮實(shí)驗(yàn)室發(fā)表了一篇Science（Lu et al 2012）該研究“首次實(shí)現(xiàn)了高覆蓋度的單個(gè)精子全基因組測(cè)序，構(gòu)建了迄今為止重組定位精度最高的個(gè)人遺傳圖譜,，這一技術(shù)方法在男性不育癥研究和腫瘤早期診斷及個(gè)體化治療等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景”,。利用的是微流控芯片MALBAC擴(kuò)增技術(shù)+ Illumina HiSeq高通量測(cè)序。這里面的不同就是擴(kuò)增技術(shù),，MDA號(hào)稱能擴(kuò)增90%的基因組,，但據(jù)謝曉亮報(bào)道的新的MALBAC技術(shù)似乎更優(yōu)于MDA技術(shù)。但是MDA技術(shù)比較成熟,，Qiagen有比較成熟的試劑盒售賣,，不知道MALBAC技術(shù)有沒有商業(yè)化的試劑盒。
完成了這兩部之后,，就是測(cè)序了,，現(xiàn)在測(cè)序技術(shù)日新月異，一日千里,。成本也確實(shí)降低了不少,，在近幾年可能會(huì)火起來(lái)。同時(shí)該技術(shù)還廣泛應(yīng)用于微生物領(lǐng)域,。
單細(xì)胞基因組測(cè)序的價(jià)值
高通量測(cè)序技術(shù)飛快向前發(fā)展,，測(cè)序價(jià)格更是由第一個(gè)人類基因組測(cè)序成本的30億美元下降到5000-10,000美元，然而在遺傳信息用于醫(yī)療診斷和疾病治療的過程中,，科研人員仍面臨一個(gè)問題,，那就是如何通過一個(gè)細(xì)胞樣本測(cè)通基因組序列,。之前的測(cè)序都是忽略細(xì)胞間的差異，而對(duì)同一組織的大量細(xì)胞的測(cè)序往往會(huì)生成多重數(shù)據(jù),，這不利于追蹤細(xì)胞病變過程和細(xì)胞間狀態(tài)差異,。面對(duì)這一科學(xué)困境，以單細(xì)胞為樣本的測(cè)序技術(shù)可對(duì)細(xì)胞內(nèi)30億對(duì)堿基測(cè)序從而拓展了這一領(lǐng)域內(nèi)的研究,。[單細(xì)胞測(cè)序挑戰(zhàn)基因組測(cè)序的平均法則]（生物谷Bioon.com）
