上周在美國冷泉港(Cold Spring Harbor)參加了單細(xì)胞分析會議(single cell analysis),, 這是一個非常令人激動的前沿學(xué)術(shù)會議,,深深的體會到了單細(xì)胞基因組學(xué)的時代已經(jīng)來臨。
Cold Spring Harbor的會議是公認(rèn)的高水準(zhǔn)的會議,,它有幾個特點(diǎn):首先,,所做的報告都是最新的研究,組織方特別強(qiáng)調(diào),希望介紹尚未發(fā)表的研究進(jìn)展,。我們知道,,當(dāng)一篇文章發(fā)表出來了的時候,這個研究一般在一年之前就已經(jīng)基本結(jié)束了,。鼓勵把正在進(jìn)行中的項目拿出來講,,保證的這個會議的前沿性。現(xiàn)場的報告都有清晰的錄像,,考慮到許多的talk是未發(fā)表的工作,,這些錄像只有參會者才有權(quán)利看到。其次,,會議有大量的討論時間,。包括兩次茶歇,wine and cheese party, banquet,還有晚上一直開放的酒吧,。給了與會者許多非正式交流的機(jī)會,。第三,收費(fèi)貴,,參加的基本都是PI,,受邀或者從提交的abstract挑選出的speaker都是這個領(lǐng)域里做的最好的人,我自己能被選中做presentation,,感到非常有幸,。
單細(xì)胞測序最早的文獻(xiàn),據(jù)我所知應(yīng)該是Harvard的George Church在6年前Nature
Biotechnology上發(fā)表的,。由于當(dāng)時測序的價格昂貴,,并沒有立刻開始廣泛應(yīng)用。隨著二代測序的普及,,單個基因組測序價格降到5000美元,,單細(xì)胞測序迎來了迅猛發(fā)展的時刻。2012年,,單細(xì)胞測序研究所發(fā)表的文獻(xiàn)包括,,華大基因兩篇Cell文章上介紹的對上百個腫瘤單細(xì)胞基因組測序的分析, 斯坦福大學(xué)Stephen Quake在Cell上發(fā)表的對單個精子的測序,, 哈佛的Sunny Xie實(shí)驗室發(fā)表的兩篇Science上的文章介紹一個新的單細(xì)胞測序技術(shù),, 還有Cold Spring Harbor的Jim Hicks在Nature上發(fā)表的對乳腺癌的單細(xì)胞CNV研究等。從文章的檔次上可以看出,,單細(xì)胞基因組學(xué)的勢頭相當(dāng)強(qiáng)勁,。
單細(xì)胞測序技術(shù)最常用的方法是MDA方法,這種方法的優(yōu)點(diǎn)是對基因組的覆蓋率高,,缺點(diǎn)是擴(kuò)增不均勻,,比較適用于做SNP和mutation相關(guān)的研究,。我實(shí)驗室用這個方法做的單細(xì)胞的覆蓋率在1X的深度下就達(dá)到了30%。 有意思的是這次會議中,,有一半的talk是關(guān)于微流控技術(shù)的,。原因是,微流控平臺是公認(rèn)的可以降低單細(xì)胞測序的噪聲,,使得基因組擴(kuò)展更加均勻,。同時微流控平臺也適合于分離單細(xì)胞。最近Fluidigm出了一個C1的單細(xì)胞擴(kuò)增儀器,,現(xiàn)場幾乎所有做單細(xì)胞的實(shí)驗室都表示出了購買的興趣,,足見微流控技術(shù)的吸引力。單細(xì)胞測序最容易出現(xiàn)的問題是污染,,一般建議是在專門的獨(dú)立的超凈間里進(jìn)行,,并且此超凈間不應(yīng)該做任何非單細(xì)胞的實(shí)驗。
目前單細(xì)胞研究的主要應(yīng)用領(lǐng)域包括腫瘤,,循環(huán)腫瘤細(xì)胞,,干細(xì)胞等。但有意思的是,,現(xiàn)場的好幾個報告都不約而同的做了同樣?xùn)|西,,看來大家的想法都非常相近??戳吮酒┪牡牟┯讶绻信d趣做單細(xì)胞基因組研究,請慎重,,很有可能你的想法別人已經(jīng)做到9成,,接近發(fā)表了,我非常歡迎感興趣的人和我討論或者合作,。
作者介紹:
賀建奎,,南方科技大學(xué)的副教授,研究領(lǐng)域:遺傳學(xué)與生物信息學(xué)中的基因組學(xué),。
單細(xì)胞基因組測序技術(shù)流程
單細(xì)胞基因組技術(shù)是06年之后開始火起來的,,已經(jīng)應(yīng)用到各個領(lǐng)域,植物細(xì)胞,、微生物和動物細(xì)胞尤其是人體細(xì)胞,。做這個東西有三個難點(diǎn):第一,是單細(xì)胞的獲??;第二,單細(xì)胞基因組的多重擴(kuò)增,;第三,,就是高通量測序以及組裝,。
第一,單細(xì)胞的分揀
1. 梯度稀釋:類似于微生物的純培養(yǎng)手段,,既繁瑣也容易污染,。
2.顯微操控:在顯微鏡小用類似于注射器的裝置分離單細(xì)胞,可操作性不好,;
3. 流式細(xì)胞分揀:流式細(xì)胞分揀可以分離大量的同類型的細(xì)胞,,也是在MDA技術(shù)出現(xiàn)之前最普遍使用的方法,現(xiàn)在也有很多實(shí)驗室再使用,。缺點(diǎn)仍然是對實(shí)驗室凈化要求極高,,而且并不能實(shí)現(xiàn)完全意義上的單細(xì)胞測序。
4. 微流控芯片:就是博主所提到的最火的,,這個技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于細(xì)胞分揀和單細(xì)胞的多重擴(kuò)增可以在一張芯片上完成,,而且依據(jù)芯片的設(shè)計,可以同時做多個細(xì)胞的擴(kuò)增,,就是傳說中的芯片實(shí)驗室(Lab on a Chip),,擴(kuò)增完成之后,收集擴(kuò)增產(chǎn)物,,檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增質(zhì)量就可以做相應(yīng)的測序準(zhǔn)備了,,剩下測序和組裝的跟宏基因組測序類似。
第二,,單細(xì)胞基因組的多重擴(kuò)增
目前單細(xì)胞基因組測序的關(guān)鍵點(diǎn)在于足夠的單細(xì)胞DNA的獲得,,主要通過多重置換擴(kuò)增反應(yīng)( MDA)完成。在微生物細(xì)胞中細(xì)菌中幾個飛克 (10-15g)的DNA能擴(kuò)增得到微克(10-6g)的高分子量DNA (Zhang et al, 2006),,擴(kuò)增得到的DNA 適合DNA文庫的構(gòu)建,,MDA生成的DNA也可直接作為模板進(jìn)行測序。
Stanford的Stephen Quake實(shí)驗室去年發(fā)表了一篇Cell文章(Wang et al 2012), 是測人類精子的單細(xì)胞基因組的,,“這項研究第一次繪制了個體重組圖譜,,也首次發(fā)現(xiàn)了來自同一個人的不同精子的不同突變率”。利用的平臺是微流控芯片+MDA擴(kuò)增+ Illumina HiSeq高通量測序的方法,;Harvard的謝曉亮實(shí)驗室發(fā)表了一篇Science(Lu et al 2012)該研究“首次實(shí)現(xiàn)了高覆蓋度的單個精子全基因組測序,,構(gòu)建了迄今為止重組定位精度最高的個人遺傳圖譜,這一技術(shù)方法在男性不育癥研究和腫瘤早期診斷及個體化治療等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景”,。利用的是微流控芯片MALBAC擴(kuò)增技術(shù)+ Illumina HiSeq高通量測序,。這里面的不同就是擴(kuò)增技術(shù),MDA號稱能擴(kuò)增90%的基因組,,但據(jù)謝曉亮報道的新的MALBAC技術(shù)似乎更優(yōu)于MDA技術(shù),。但是MDA技術(shù)比較成熟,Qiagen有比較成熟的試劑盒售賣,,不知道MALBAC技術(shù)有沒有商業(yè)化的試劑盒,。
完成了這兩部之后,,就是測序了,現(xiàn)在測序技術(shù)日新月異,,一日千里,。成本也確實(shí)降低了不少,在近幾年可能會火起來,。同時該技術(shù)還廣泛應(yīng)用于微生物領(lǐng)域,。
單細(xì)胞基因組測序的價值
高通量測序技術(shù)飛快向前發(fā)展,測序價格更是由第一個人類基因組測序成本的30億美元下降到5000-10,000美元,,然而在遺傳信息用于醫(yī)療診斷和疾病治療的過程中,,科研人員仍面臨一個問題,那就是如何通過一個細(xì)胞樣本測通基因組序列,。之前的測序都是忽略細(xì)胞間的差異,,而對同一組織的大量細(xì)胞的測序往往會生成多重數(shù)據(jù),這不利于追蹤細(xì)胞病變過程和細(xì)胞間狀態(tài)差異,。面對這一科學(xué)困境,,以單細(xì)胞為樣本的測序技術(shù)可對細(xì)胞內(nèi)30億對堿基測序從而拓展了這一領(lǐng)域內(nèi)的研究。[單細(xì)胞測序挑戰(zhàn)基因組測序的平均法則](生物谷Bioon.com)