上周在美國冷泉港(Cold Spring Harbor)參加了單細(xì)胞分析會議(single cell analysis),， 這是一個非常令人激動的前沿學(xué)術(shù)會議,，深深的體會到了單細(xì)胞基因組學(xué)的時代已經(jīng)來臨。
Cold Spring Harbor的會議是公認(rèn)的高水準(zhǔn)的會議,，它有幾個特點(diǎn)：首先,，所做的報告都是最新的研究，組織方特別強(qiáng)調(diào)，希望介紹尚未發(fā)表的研究進(jìn)展,。我們知道,，當(dāng)一篇文章發(fā)表出來了的時候，這個研究一般在一年之前就已經(jīng)基本結(jié)束了,。鼓勵把正在進(jìn)行中的項目拿出來講,，保證的這個會議的前沿性。現(xiàn)場的報告都有清晰的錄像,，考慮到許多的talk是未發(fā)表的工作,，這些錄像只有參會者才有權(quán)利看到。其次,，會議有大量的討論時間,。包括兩次茶歇，wine and cheese party, banquet,還有晚上一直開放的酒吧,。給了與會者許多非正式交流的機(jī)會,。第三，收費(fèi)貴,，參加的基本都是PI,，受邀或者從提交的abstract挑選出的speaker都是這個領(lǐng)域里做的最好的人，我自己能被選中做presentation,，感到非常有幸,。
單細(xì)胞測序最早的文獻(xiàn)，據(jù)我所知應(yīng)該是Harvard的George Church在6年前Nature
Biotechnology上發(fā)表的,。由于當(dāng)時測序的價格昂貴,，并沒有立刻開始廣泛應(yīng)用。隨著二代測序的普及,，單個基因組測序價格降到5000美元,，單細(xì)胞測序迎來了迅猛發(fā)展的時刻。2012年,，單細(xì)胞測序研究所發(fā)表的文獻(xiàn)包括,，華大基因兩篇Cell文章上介紹的對上百個腫瘤單細(xì)胞基因組測序的分析， 斯坦福大學(xué)Stephen Quake在Cell上發(fā)表的對單個精子的測序,， 哈佛的Sunny Xie實(shí)驗室發(fā)表的兩篇Science上的文章介紹一個新的單細(xì)胞測序技術(shù),， 還有Cold Spring Harbor的Jim Hicks在Nature上發(fā)表的對乳腺癌的單細(xì)胞CNV研究等。從文章的檔次上可以看出,，單細(xì)胞基因組學(xué)的勢頭相當(dāng)強(qiáng)勁,。
單細(xì)胞測序技術(shù)最常用的方法是MDA方法，這種方法的優(yōu)點(diǎn)是對基因組的覆蓋率高,，缺點(diǎn)是擴(kuò)增不均勻,，比較適用于做SNP和mutation相關(guān)的研究,。我實(shí)驗室用這個方法做的單細(xì)胞的覆蓋率在1X的深度下就達(dá)到了30%。 有意思的是這次會議中,，有一半的talk是關(guān)于微流控技術(shù)的,。原因是，微流控平臺是公認(rèn)的可以降低單細(xì)胞測序的噪聲,，使得基因組擴(kuò)展更加均勻,。同時微流控平臺也適合于分離單細(xì)胞。最近Fluidigm出了一個C1的單細(xì)胞擴(kuò)增儀器,，現(xiàn)場幾乎所有做單細(xì)胞的實(shí)驗室都表示出了購買的興趣,，足見微流控技術(shù)的吸引力。單細(xì)胞測序最容易出現(xiàn)的問題是污染,，一般建議是在專門的獨(dú)立的超凈間里進(jìn)行,，并且此超凈間不應(yīng)該做任何非單細(xì)胞的實(shí)驗。
目前單細(xì)胞研究的主要應(yīng)用領(lǐng)域包括腫瘤,，循環(huán)腫瘤細(xì)胞,，干細(xì)胞等。但有意思的是,，現(xiàn)場的好幾個報告都不約而同的做了同樣?xùn)|西,，看來大家的想法都非常相近?？戳吮酒┪牡牟┯讶绻信d趣做單細(xì)胞基因組研究，請慎重,，很有可能你的想法別人已經(jīng)做到9成,，接近發(fā)表了，我非常歡迎感興趣的人和我討論或者合作,。
作者介紹：
賀建奎,，南方科技大學(xué)的副教授，研究領(lǐng)域：遺傳學(xué)與生物信息學(xué)中的基因組學(xué),。
單細(xì)胞基因組測序技術(shù)流程
單細(xì)胞基因組技術(shù)是06年之后開始火起來的,，已經(jīng)應(yīng)用到各個領(lǐng)域，植物細(xì)胞,、微生物和動物細(xì)胞尤其是人體細(xì)胞,。做這個東西有三個難點(diǎn)：第一，是單細(xì)胞的獲??；第二，單細(xì)胞基因組的多重擴(kuò)增,；第三,，就是高通量測序以及組裝,。
第一，單細(xì)胞的分揀
1. 梯度稀釋：類似于微生物的純培養(yǎng)手段,，既繁瑣也容易污染,。
2.顯微操控：在顯微鏡小用類似于注射器的裝置分離單細(xì)胞，可操作性不好,；
3. 流式細(xì)胞分揀：流式細(xì)胞分揀可以分離大量的同類型的細(xì)胞,，也是在MDA技術(shù)出現(xiàn)之前最普遍使用的方法，現(xiàn)在也有很多實(shí)驗室再使用,。缺點(diǎn)仍然是對實(shí)驗室凈化要求極高,，而且并不能實(shí)現(xiàn)完全意義上的單細(xì)胞測序。
4. 微流控芯片：就是博主所提到的最火的,，這個技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于細(xì)胞分揀和單細(xì)胞的多重擴(kuò)增可以在一張芯片上完成,，而且依據(jù)芯片的設(shè)計，可以同時做多個細(xì)胞的擴(kuò)增,，就是傳說中的芯片實(shí)驗室（Lab on a Chip）,，擴(kuò)增完成之后，收集擴(kuò)增產(chǎn)物,，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增質(zhì)量就可以做相應(yīng)的測序準(zhǔn)備了,，剩下測序和組裝的跟宏基因組測序類似。
第二,，單細(xì)胞基因組的多重擴(kuò)增
目前單細(xì)胞基因組測序的關(guān)鍵點(diǎn)在于足夠的單細(xì)胞DNA的獲得,，主要通過多重置換擴(kuò)增反應(yīng)（ MDA）完成。在微生物細(xì)胞中細(xì)菌中幾個飛克 (10-15g)的DNA能擴(kuò)增得到微克(10-6g)的高分子量DNA (Zhang et al, 2006),，擴(kuò)增得到的DNA 適合DNA文庫的構(gòu)建,，MDA生成的DNA也可直接作為模板進(jìn)行測序。
Stanford的Stephen Quake實(shí)驗室去年發(fā)表了一篇Cell文章（Wang et al 2012）, 是測人類精子的單細(xì)胞基因組的,，“這項研究第一次繪制了個體重組圖譜,，也首次發(fā)現(xiàn)了來自同一個人的不同精子的不同突變率”。利用的平臺是微流控芯片+MDA擴(kuò)增+ Illumina HiSeq高通量測序的方法,；Harvard的謝曉亮實(shí)驗室發(fā)表了一篇Science（Lu et al 2012）該研究“首次實(shí)現(xiàn)了高覆蓋度的單個精子全基因組測序,，構(gòu)建了迄今為止重組定位精度最高的個人遺傳圖譜，這一技術(shù)方法在男性不育癥研究和腫瘤早期診斷及個體化治療等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景”,。利用的是微流控芯片MALBAC擴(kuò)增技術(shù)+ Illumina HiSeq高通量測序,。這里面的不同就是擴(kuò)增技術(shù)，MDA號稱能擴(kuò)增90%的基因組,，但據(jù)謝曉亮報道的新的MALBAC技術(shù)似乎更優(yōu)于MDA技術(shù),。但是MDA技術(shù)比較成熟，Qiagen有比較成熟的試劑盒售賣,，不知道MALBAC技術(shù)有沒有商業(yè)化的試劑盒,。
完成了這兩部之后,，就是測序了，現(xiàn)在測序技術(shù)日新月異,，一日千里,。成本也確實(shí)降低了不少，在近幾年可能會火起來,。同時該技術(shù)還廣泛應(yīng)用于微生物領(lǐng)域,。
單細(xì)胞基因組測序的價值
高通量測序技術(shù)飛快向前發(fā)展，測序價格更是由第一個人類基因組測序成本的30億美元下降到5000-10,000美元,，然而在遺傳信息用于醫(yī)療診斷和疾病治療的過程中,，科研人員仍面臨一個問題，那就是如何通過一個細(xì)胞樣本測通基因組序列,。之前的測序都是忽略細(xì)胞間的差異,，而對同一組織的大量細(xì)胞的測序往往會生成多重數(shù)據(jù)，這不利于追蹤細(xì)胞病變過程和細(xì)胞間狀態(tài)差異,。面對這一科學(xué)困境,，以單細(xì)胞為樣本的測序技術(shù)可對細(xì)胞內(nèi)30億對堿基測序從而拓展了這一領(lǐng)域內(nèi)的研究。[單細(xì)胞測序挑戰(zhàn)基因組測序的平均法則]（生物谷Bioon.com）
