上周在美國冷泉港(Cold Spring Harbor)參加了單細胞分析會議(single cell analysis),， 這是一個非常令人激動的前沿學(xué)術(shù)會議，深深的體會到了單細胞基因組學(xué)的時代已經(jīng)來臨,。
Cold Spring Harbor的會議是公認的高水準的會議,，它有幾個特點：首先，所做的報告都是最新的研究,，組織方特別強調(diào),，希望介紹尚未發(fā)表的研究進展。我們知道,，當(dāng)一篇文章發(fā)表出來了的時候,，這個研究一般在一年之前就已經(jīng)基本結(jié)束了,。鼓勵把正在進行中的項目拿出來講，保證的這個會議的前沿性?，F(xiàn)場的報告都有清晰的錄像,，考慮到許多的talk是未發(fā)表的工作，這些錄像只有參會者才有權(quán)利看到,。其次,，會議有大量的討論時間。包括兩次茶歇,，wine and cheese party, banquet,還有晚上一直開放的酒吧,。給了與會者許多非正式交流的機會。第三,，收費貴,，參加的基本都是PI，受邀或者從提交的abstract挑選出的speaker都是這個領(lǐng)域里做的最好的人,，我自己能被選中做presentation,，感到非常有幸。
單細胞測序最早的文獻,，據(jù)我所知應(yīng)該是Harvard的George Church在6年前Nature
Biotechnology上發(fā)表的,。由于當(dāng)時測序的價格昂貴，并沒有立刻開始廣泛應(yīng)用,。隨著二代測序的普及,，單個基因組測序價格降到5000美元，單細胞測序迎來了迅猛發(fā)展的時刻,。2012年,，單細胞測序研究所發(fā)表的文獻包括，華大基因兩篇Cell文章上介紹的對上百個腫瘤單細胞基因組測序的分析,， 斯坦福大學(xué)Stephen Quake在Cell上發(fā)表的對單個精子的測序,， 哈佛的Sunny Xie實驗室發(fā)表的兩篇Science上的文章介紹一個新的單細胞測序技術(shù)， 還有Cold Spring Harbor的Jim Hicks在Nature上發(fā)表的對乳腺癌的單細胞CNV研究等,。從文章的檔次上可以看出，單細胞基因組學(xué)的勢頭相當(dāng)強勁,。
單細胞測序技術(shù)最常用的方法是MDA方法,，這種方法的優(yōu)點是對基因組的覆蓋率高，缺點是擴增不均勻,，比較適用于做SNP和mutation相關(guān)的研究,。我實驗室用這個方法做的單細胞的覆蓋率在1X的深度下就達到了30%。 有意思的是這次會議中,，有一半的talk是關(guān)于微流控技術(shù)的,。原因是，微流控平臺是公認的可以降低單細胞測序的噪聲，使得基因組擴展更加均勻,。同時微流控平臺也適合于分離單細胞,。最近Fluidigm出了一個C1的單細胞擴增儀器，現(xiàn)場幾乎所有做單細胞的實驗室都表示出了購買的興趣,，足見微流控技術(shù)的吸引力,。單細胞測序最容易出現(xiàn)的問題是污染，一般建議是在專門的獨立的超凈間里進行,，并且此超凈間不應(yīng)該做任何非單細胞的實驗,。
目前單細胞研究的主要應(yīng)用領(lǐng)域包括腫瘤，循環(huán)腫瘤細胞,，干細胞等,。但有意思的是，現(xiàn)場的好幾個報告都不約而同的做了同樣?xùn)|西,，看來大家的想法都非常相近,。看了本篇博文的博友如果有興趣做單細胞基因組研究,，請慎重,，很有可能你的想法別人已經(jīng)做到9成，接近發(fā)表了,，我非常歡迎感興趣的人和我討論或者合作,。
作者介紹：
賀建奎，南方科技大學(xué)的副教授,，研究領(lǐng)域：遺傳學(xué)與生物信息學(xué)中的基因組學(xué),。
單細胞基因組測序技術(shù)流程
單細胞基因組技術(shù)是06年之后開始火起來的，已經(jīng)應(yīng)用到各個領(lǐng)域,，植物細胞,、微生物和動物細胞尤其是人體細胞。做這個東西有三個難點：第一,，是單細胞的獲?。坏诙?，單細胞基因組的多重擴增,；第三，就是高通量測序以及組裝,。
第一,，單細胞的分揀
1. 梯度稀釋：類似于微生物的純培養(yǎng)手段，既繁瑣也容易污染,。
2.顯微操控：在顯微鏡小用類似于注射器的裝置分離單細胞,，可操作性不好,；
3. 流式細胞分揀：流式細胞分揀可以分離大量的同類型的細胞，也是在MDA技術(shù)出現(xiàn)之前最普遍使用的方法,，現(xiàn)在也有很多實驗室再使用,。缺點仍然是對實驗室凈化要求極高，而且并不能實現(xiàn)完全意義上的單細胞測序,。
4. 微流控芯片：就是博主所提到的最火的,，這個技術(shù)的優(yōu)點在于細胞分揀和單細胞的多重擴增可以在一張芯片上完成，而且依據(jù)芯片的設(shè)計,，可以同時做多個細胞的擴增,，就是傳說中的芯片實驗室（Lab on a Chip），擴增完成之后,，收集擴增產(chǎn)物,，檢測擴增產(chǎn)物的擴增質(zhì)量就可以做相應(yīng)的測序準備了，剩下測序和組裝的跟宏基因組測序類似,。
第二,，單細胞基因組的多重擴增
目前單細胞基因組測序的關(guān)鍵點在于足夠的單細胞DNA的獲得，主要通過多重置換擴增反應(yīng)（ MDA）完成,。在微生物細胞中細菌中幾個飛克 (10-15g)的DNA能擴增得到微克(10-6g)的高分子量DNA (Zhang et al, 2006),，擴增得到的DNA 適合DNA文庫的構(gòu)建，MDA生成的DNA也可直接作為模板進行測序,。
Stanford的Stephen Quake實驗室去年發(fā)表了一篇Cell文章（Wang et al 2012）, 是測人類精子的單細胞基因組的,，“這項研究第一次繪制了個體重組圖譜，也首次發(fā)現(xiàn)了來自同一個人的不同精子的不同突變率”,。利用的平臺是微流控芯片+MDA擴增+ Illumina HiSeq高通量測序的方法,；Harvard的謝曉亮實驗室發(fā)表了一篇Science（Lu et al 2012）該研究“首次實現(xiàn)了高覆蓋度的單個精子全基因組測序，構(gòu)建了迄今為止重組定位精度最高的個人遺傳圖譜,，這一技術(shù)方法在男性不育癥研究和腫瘤早期診斷及個體化治療等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景”,。利用的是微流控芯片MALBAC擴增技術(shù)+ Illumina HiSeq高通量測序。這里面的不同就是擴增技術(shù),，MDA號稱能擴增90%的基因組,，但據(jù)謝曉亮報道的新的MALBAC技術(shù)似乎更優(yōu)于MDA技術(shù)。但是MDA技術(shù)比較成熟,，Qiagen有比較成熟的試劑盒售賣,，不知道MALBAC技術(shù)有沒有商業(yè)化的試劑盒。
完成了這兩部之后,，就是測序了，現(xiàn)在測序技術(shù)日新月異,，一日千里,。成本也確實降低了不少,，在近幾年可能會火起來。同時該技術(shù)還廣泛應(yīng)用于微生物領(lǐng)域,。
單細胞基因組測序的價值
高通量測序技術(shù)飛快向前發(fā)展,，測序價格更是由第一個人類基因組測序成本的30億美元下降到5000-10,000美元，然而在遺傳信息用于醫(yī)療診斷和疾病治療的過程中,，科研人員仍面臨一個問題,，那就是如何通過一個細胞樣本測通基因組序列。之前的測序都是忽略細胞間的差異,，而對同一組織的大量細胞的測序往往會生成多重數(shù)據(jù),，這不利于追蹤細胞病變過程和細胞間狀態(tài)差異。面對這一科學(xué)困境,，以單細胞為樣本的測序技術(shù)可對細胞內(nèi)30億對堿基測序從而拓展了這一領(lǐng)域內(nèi)的研究,。[單細胞測序挑戰(zhàn)基因組測序的平均法則]（生物谷Bioon.com）
