李鴻鈞,；馬雁冰（綜述）,；孫茂盛（審校）

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué),；醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所,；昆明650118　

摘要：膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）,、neurturin(NTN),、persephin(PSP)、artemin(ART)共同構(gòu)成TGF-β超家族的一個(gè)亞家族,。四者結(jié)構(gòu)相似,、功能相關(guān)，且氨基酸順序有較高的同源性。在體內(nèi),，它們都是以前體的形式分泌,，經(jīng)加工、修飾,，成熟的蛋白質(zhì)分子為二硫鍵連接形成的同源二聚體,。對(duì)中腦多巴胺能神經(jīng)元、頸上神經(jīng)節(jié)交感神經(jīng)元,、脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元等具有明顯的營(yíng)養(yǎng)與保護(hù)作用,。在信號(hào)傳導(dǎo)中，GDNF家族α受體（GDNF Family Recepter alpha,GFRα)與原癌基因c-ret編碼的產(chǎn)物蛋白R(shí)et共同形成GDNF家族成員的功能性復(fù)合受體,，介導(dǎo)GDNF家族成員的生理功能,。

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及營(yíng)養(yǎng)具有重要意義，并能促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的存活及預(yù)防由于損傷,、毒素及病理性改變所導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞退行性病變,。膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrphic factor,GDNF）、neurturin(NTN),、persephin(PSP),、artemin(ART)是一類結(jié)構(gòu)相似、功能相關(guān)的分泌型蛋白質(zhì),，其一級(jí)結(jié)構(gòu)都具有七個(gè)保守的,、相對(duì)位置相同的半胱氨酸殘基，并具有相似的空間結(jié)構(gòu),，核苷酸序列,、氨基酸順序也具有較高的同源性。它們是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor beta,TGF-β）超家族的遠(yuǎn)親,，共同構(gòu)成TGF-β超家族的一個(gè)亞家族,。另外，這一家族神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在生理功能,、受體,、信號(hào)傳導(dǎo)途徑等方面都具有相似性。目前已對(duì)這類細(xì)胞因子在基因克隆和定位,、蛋白分子特點(diǎn),、mRNA分布、生理功能,、受體和信號(hào)傳導(dǎo)途徑等諸多方面進(jìn)行了研究,。本文就以上這幾個(gè)方面對(duì)GDNF家族神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的研究進(jìn)展作一綜述。

1,、GDNF家族神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

1.1基本性質(zhì)及分子結(jié)構(gòu)

GDNF是1993年發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)因子,，它最選 是由Lin等從大鼠膠質(zhì)細(xì)胞系B49的無(wú)血清培養(yǎng)基中經(jīng)濃縮,、分離純化出來(lái)的，能激活體外培養(yǎng)的鼠胚腹側(cè)中腦多巴胺能神經(jīng)元攝取多巴胺,，促進(jìn)神經(jīng)元存活,。他們利用來(lái)源于B49細(xì)胞的多聚腺苷（polyA）RNA，建立cDNA文庫(kù),，經(jīng)篩選獲得大鼠的GDNF cDNA,。在此基礎(chǔ)上克隆到人的GDNF基因，序列分析發(fā)現(xiàn)GDNF基因全長(zhǎng)700bp,，編碼211個(gè)氨基酸前體蛋白,，前19個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，經(jīng)加工修飾成熟的GDNF含有134個(gè)氨基酸,，以二硫鍵連接成同源二聚體,，含有7個(gè)保守的半胱氨酸殘基,，這些半胱近殘基所處的空間位置與所有TGF-β超家族成員相同,。

1996年Kotzbauer等在篩選體外培養(yǎng)的重組生長(zhǎng)因子表達(dá)細(xì)胞系時(shí)，從中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了一種具有促進(jìn)神經(jīng)元存活的物質(zhì),，經(jīng)分離,、純化得到一種分子量為25KD的新的純化蛋白，稱為Neurturin(NTN),，隨后他們克隆到了小鼠及人的NTN基因,，人NTN基因（hNTN）cDNA包含一個(gè)開放閱讀框架（open reading frame，ORF）,，編碼197個(gè)氨基酸組成的前體 蛋白,，該蛋白N端19個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，其后為前體區(qū),，經(jīng)蛋白酶切割后,，成熟NTN蛋白由102年氨基酸組成，通過(guò)二硫鍵形成同源二聚體,，氨基酸順序與GDNF有42%的同源性,。hNTN基因含有兩個(gè)外顯子，一個(gè)內(nèi)含子,，定位于人染色體19p13.3區(qū),。

繼GDNF、NTN被成功發(fā)現(xiàn)之后,，人們?cè)噲D尋找GDNF家族的其它成員,，由于該家族成員之間核甘酸序列的高度同源性，Milbrandt等針對(duì)GDNF和NTN的高度同源區(qū)設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物,，經(jīng)過(guò)RT-PCR克隆到了小嫌的PSP基因（mPSP）,、mPSP cDNA編碼156個(gè)的前體蛋白,，N端為信號(hào)肽，其后為前體區(qū),，成熟PSP蛋白由96個(gè)氨基酸構(gòu)成,。隨后他們利用簡(jiǎn)并PCR方法及人cDNA文庫(kù)篩選，克隆到人PSP基因（hPSP）,，hPSP含有兩個(gè)外顯子,，一個(gè)內(nèi)含子，編碼156個(gè)氨基酸的前前體蛋白,，氨基酸順序與GDNF和NTN有40%的同源,。一級(jí)結(jié)構(gòu)也具有7個(gè)保守的半胱氨酸。

GDNF家族第四個(gè)成員Artemin(ART)是1998年12月由Robert等發(fā)現(xiàn)的,。他們以成熟NTN蛋白順序?yàn)闃?biāo)準(zhǔn),，通過(guò)高含量基因組順序（high throughput genome sequences,HTGS）數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)細(xì)菌人工染色體（bacterial artificial chromosome,BAC）克隆含有與GDNF、NTN及PSP相似蛤不相同的同源開放讀框（homologous open reading frame,，hORF）,，表達(dá)序列標(biāo)簽（homologous tag,EST）數(shù)據(jù)庫(kù)表明該hORF為一種表達(dá)基因，用PCR方法也擴(kuò)增到了跟該hORF相關(guān)的鼠基因組DNA,，并利用cDNA末端的隨機(jī)擴(kuò)增（random amplification of cDNA ends,RACE）技術(shù)從人及鼠的組織cDNA文庫(kù)擴(kuò)增到了全長(zhǎng)的cDNA順序,，經(jīng)分析全長(zhǎng)cDNA，表明hORF編碼的是一種新GDNF家族成員,，即Artemin(ART),。ART全基因組有3個(gè)外顯子，兩上內(nèi)含子,，定位約45%同源,，與GDNF同源懷約36%，ART蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)與GDNF,、NTN,、PSP相似，具相對(duì)位置相同的7個(gè)保守的半胱氨酸殘基,，全長(zhǎng)ART蛋白也是由信號(hào)肽,、前體區(qū)及成熟蛋白三部分組成，成熟蛋白含有113個(gè)氨基酸,。

1.2mRNA分布

GDNF mRNA在體內(nèi)分布廣泛,，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，成年和發(fā)育中的大鼠,，其紋狀體,、皮層、小腦,、海馬和脊髓中都有GDNF存在,；在成人的紋狀體,、皮層、海馬和脊髓中也檢測(cè)到GDNF mRNA,；另外,，新生大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外的組織如腎、肺,、心,、脾、肝,、血液,、坐骨神經(jīng)、睪丸,、卵巢,、皮膚、骨骼肌,、腎上腺都有GDNF mRNA表達(dá),。NTN與GDNF類似，在體內(nèi)mRNA也廣泛存在,。原位雜交顯示,，發(fā)育期及成年小鼠的大腦皮層、紋狀體,、腦干、垂體等部位都有NTN表達(dá),，便GDNF表達(dá)水平較高的脊髓未檢測(cè)到NTN mRNA,，另外，在非神經(jīng)系統(tǒng)如心臟,、血液,、肺、視網(wǎng)膜,、嗅粘膜,、輸尿管、卵巢和腸道平滑肌等部位NTN表達(dá)水平也較高,。GDNF和NTN在體內(nèi)廣泛分布,，提示它們對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)和非神經(jīng)組織的發(fā)育及生理功能的維持具有重要意義。

而PSP與GDNF,、NTN不同,，經(jīng)RT-PCR發(fā)現(xiàn)，在成年及胚胎大鼠在部分組織中PSP表達(dá)量都很低,，原位雜交法也未檢測(cè)到mRNA存在,。ART的mRNA分布介于GDNF,、NTN與PSP之間。體外試驗(yàn)表明,，成人外周組織中垂體,、胎盤、氣管高水平表達(dá),，在胎兒中,，只有腎、肺高水平表達(dá),；成人及胎兒腦組織,，包括基本神經(jīng)節(jié)（下丘腦核、豆?fàn)詈?、黑質(zhì)）及丘腦表達(dá)水平都很低,，提示ART可能作用于皮層下運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)；脊髓及背根本神經(jīng)表達(dá)量也低,，進(jìn)一步經(jīng)過(guò)第14天的大鼠胚胎（E14）研究表明,，在神經(jīng)根（不包括背根神經(jīng)節(jié)）及腸系動(dòng)脈周圍表達(dá)，提示ART對(duì)于外周神經(jīng)系統(tǒng)的作用可能有兩種方法：對(duì)于背根神經(jīng)節(jié)發(fā)育中的神經(jīng)元以旁分泌方式起作用,；對(duì)腸系膜上動(dòng)脈等自主神經(jīng)支配組織起到靶源性因子的作用,。

2、GDNF家族神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生理功能

2.1對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的作用　GDNF,、NTN,、PSP均能促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠胚胎中腦多巴受能神經(jīng)元的存活，并促進(jìn)對(duì)多巴胺高親和力攝取,。雖然在大鼠胚胎中腦膜側(cè)未檢測(cè)到ART表達(dá),，但經(jīng)體外培養(yǎng)的多巴能神經(jīng)元試驗(yàn)表明，ART也能促進(jìn)多巴受能神經(jīng)元的存活,。離體實(shí)驗(yàn)表明,，GDNF、NTN,、PSP及ART四種因子對(duì)胚胎中腦多巴胺能神經(jīng)元的促進(jìn)存省作用功效相當(dāng),。同時(shí)GDNF還能促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元形態(tài)分化，使神經(jīng)元胞體增大,、軸突延長(zhǎng),。在黑質(zhì)一紋狀體系統(tǒng)中，GDNF與NTN均能促進(jìn)多巴胺神經(jīng)元的存活,，但二者的生理功能仍有區(qū)別,，Akerud等的研究表明，在出生后的個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，NTN 在腹側(cè)中腦表達(dá)逐漸下降而在紋狀體中表達(dá)增加,，而GDNF的表達(dá)正好與之相反,；體、內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究表明,，NTN只具選擇性地促進(jìn)多巴胺神經(jīng)元存活效應(yīng),，而GDNF除廣泛的促進(jìn)存活效應(yīng)外，還能促進(jìn)神經(jīng)元軸突纖維的生長(zhǎng),。

另一方面,，GDNF家族神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子還能預(yù)防體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的退行性病變，經(jīng)大鼠試驗(yàn)研究表明：大鼠紋體狀體內(nèi)注射6羥基多巴胺（6-OHDA）造成黑質(zhì)及紋狀體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元退行性病變,，如果預(yù)先向大鼠黑質(zhì)內(nèi)注射GDNF,、NTN或PSP，均可對(duì)抗6-OHDA造成的損傷,，阻止多巴胺能神經(jīng)元的死亡,。可能是GDNF等作用于多巴胺能神經(jīng)元的上受體GFRα1和GFRα2,，通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,，刺激立及早期基因編碼產(chǎn)生有生物活性的因子，起到穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+等作用,，從而阻止6-OHDA引起的多巴胺能神經(jīng)元的損傷,，這些結(jié)果表明：GDNF家族神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在體內(nèi)能預(yù)防多巴胺能神經(jīng)元的退行性病變，這一點(diǎn)對(duì)于治療多巴胺代謝紊亂性疾病如帕金森氏病等方面,，具有重要的臨床意義,。

2.2對(duì)外周神經(jīng)系統(tǒng)的作用　GDNF、NTN,、ART在體外均能促進(jìn)多種發(fā)育中的外周神經(jīng)元包括交感神經(jīng)元,、副交感神經(jīng)元及感覺神經(jīng)元的存活。首先,，對(duì)頸上神經(jīng)節(jié)交感神經(jīng)元具有營(yíng)養(yǎng)與支持作用；其次,，也能促進(jìn)多種神經(jīng)元如背根神經(jīng)節(jié),、三叉神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元存活，在這兩群感覺神經(jīng)元中,，ART促進(jìn)存活的神經(jīng)元數(shù)量比GDNF,、NTN多；另外,，對(duì)鼻根神經(jīng)節(jié),、內(nèi)臟感覺神經(jīng)元三者的促進(jìn)存活能力相當(dāng)。而PSP對(duì)于外周神經(jīng)系統(tǒng)不起作用,。

2.3對(duì)運(yùn)動(dòng)的作用　GDNF,、NTN,、PSPS能促進(jìn)運(yùn)動(dòng)多巴胺的存活。通過(guò)腰段脊髓切面乳劑放射自顯影技術(shù)顯示,，NF到神經(jīng)元胞體,；坐骨經(jīng)濟(jì)注射逆向轉(zhuǎn)運(yùn)研究也表明，在體內(nèi)GDNF,、NTN,、PSPS能被逆賂運(yùn)輸?shù)郊顾柽\(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞體。以上這些結(jié)果說(shuō)明,，GDNF家族成員對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有作用,。以上些結(jié)果說(shuō)明，GDNF家族成員對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有作用,。另一方面,，也有研究表明DNF、NTN,、PSPS能阻止體內(nèi)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退行性病變,，對(duì)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元起保護(hù)作用。

3,、GDNF家族的信號(hào)傳導(dǎo)

GDNF家族神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)是通過(guò)復(fù)合受體途徑實(shí)現(xiàn)的,，復(fù)合受體由兩部分組成，第一部分是糖基化的磷脂酰肌醇（glycosyl-phosphatidyl inositol,，GPI）錨定到細(xì)胞表面的蛋白分子,，稱為GDNF家族受體α（GDNF Family Recepter alpha，GFRα）,；另一部分為原癌基因c-ret編碼的產(chǎn)物蛋白R(shí)et,，它是一種受體酪氨酸激酶。前者特異性地結(jié)合GDNF家族成員,，促使Ret磷酸化,，磷酸化的Ret激活其下游的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等,，導(dǎo)致一系列胞內(nèi)途徑的激活,，從而發(fā)揮GDNF家族神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生理功能。

3.1GDNF家族受體α（GFRα）　目前的研究表明GFRα至少有四種,，即GFRα1,、GFRα2、GFRα3,、GFRα4,、GFRα是與GDNF家族神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子結(jié)合的部分，并且其結(jié)合能力是特異的、可逆的,，用特異水解GPI連接位點(diǎn)的磷酯酰肌醇磷酯酶C（phosphoinositide-specific phospholipase C,，PIPLC）處理培養(yǎng)的大鼠胚胎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元或培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞如NBL-S，則GDNF,、NTN,、ART的營(yíng)養(yǎng)作用即被阻斷。利用可溶性的Fc融合受體GFRα1～GFRα3研究發(fā)現(xiàn),，GFRα1-Fc能與GDNF,、NTN結(jié)合，且二者親和力相當(dāng),，但不能一PSP,、ART結(jié)合；GFRα2-Fc結(jié)合NTN,，不結(jié)合GDNF ART,；GFRα3-Fc僅與ART結(jié)合，而不結(jié)合GDNF家族其他任何成員,。上述結(jié)果表明GFRα是GDNF家族復(fù)合受體的α亞基,，其作用主要是參與GDNF家族神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的結(jié)合，不同的因子與不同的受體結(jié)合,，其親和力不同,。GDNF主要結(jié)合GFRα1，NTN主要結(jié)合GFRα2,，同時(shí)GDNF,、NTN與受體的結(jié)合有部分交叉，GFRα3僅能與ART結(jié)合,，ART也可以與GFRα1少量結(jié)合,，PSP只能結(jié)合GFRα4，與其他三者無(wú)交叉,。

3.2Ret-復(fù)合受體的信號(hào)傳導(dǎo)成分　原癌基因c-ret編碼的產(chǎn)物Ret蛋白是一種受體酪氨酸激酶,，它與GFRα共同構(gòu)成GNDF家族神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的功能性復(fù)合受體。由于GFRα是GPI連接的胞外蛋白,，缺乏跨膜區(qū)及膜內(nèi)區(qū),，單獨(dú)無(wú)法信號(hào)傳導(dǎo)。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與GFRα特異結(jié)合之后,，尚需一種跨膜蛋白的介導(dǎo)，信號(hào)才能進(jìn)一步傳入細(xì)胞內(nèi),，這種跨膜蛋白即Ret蛋白,，它與GFRα協(xié)同作用，共同參與GDNF家族營(yíng)養(yǎng)因子的信號(hào)傳導(dǎo)。Ret mRNA和蛋白在中樞,、外周神經(jīng)系統(tǒng)及腎臟高表達(dá),，ret基因的突變與人類的某些遺傳病有關(guān)，如家族性的腎上腺甲狀腺瘤,、多發(fā)性的內(nèi)分泌腺瘤2A型,、2B型及先天性巨吉腸癥。ret基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致一系列嚴(yán)重表型缺陷,，包括腎發(fā)育不全,、完全缺失腸道神經(jīng)組織，這些缺陷與GDNF缺失突變引起的缺陷相似,，提示Ret與GDNF功能的發(fā)揮相關(guān),。

成纖維細(xì)胞株NGF-38能表達(dá)Ret與GFRα，用PIPLC處理NGR-38細(xì)胞后,，GDNF不能與之結(jié)合及誘導(dǎo)Ret磷酸化,，但在介質(zhì)中加入可溶性的GFRα1后，這些功能恢復(fù),；同樣能表達(dá)Ret的TGW-I-nu細(xì)胞系與NTN作用后,，Ret酪氨酸磷酸化水平升高，用PIPLC處理,，則NTN作用后Ret磷酸化水平明顯下降,，加入可溶性的GFRα2后，又明顯升高,；在NBLS細(xì)胞系中,，利用ART實(shí)驗(yàn)也得到同樣的結(jié)果?？梢奊FRα與Ret對(duì)于DDNF家族神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)都是必不可少的,，免疫沉淀及Western Blot進(jìn)一步表明，GFRα與Ret在細(xì)胞表面形成一個(gè)功能性的受體復(fù)合物,，前者特異性的結(jié)合GDNF家族成員,，后者進(jìn)行跨膜信息轉(zhuǎn)導(dǎo)。現(xiàn)在已經(jīng)知道GDNF家族神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子結(jié)合GFRα后,，導(dǎo)致Ret酪氨酸激酶磷酸化,，磷酸化的Ret引起下游激酶：MAPK、PI-3激酶（phosphati-dylinositol 3-kinase,PI-3）等的激活,，從而將信息傳遞到細(xì)胞內(nèi),，發(fā)揮GDNF家族成員的生理功能。

綜上所述,，膠南細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員GDNF,、NTN,、PSPS和ART多種神經(jīng)元，如中腦多巴胺能神經(jīng)元,、頸上神經(jīng)節(jié)交感神經(jīng)元,、脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元等具有明顯的營(yíng)養(yǎng)與保護(hù)作用。這對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)疾病,，如帕金森氏病,、脊髓側(cè)索硬化癥等的治療可能具有一定療效。另外GDNF家族對(duì)于非神經(jīng)GFRα和Ret共同形成GDNF家族成員的功能性復(fù)合受體,，介導(dǎo)GDNF家族成員的生理功能,。隨著人類基因組計(jì)劃的研究進(jìn)展，遺傳信息數(shù)據(jù)的不斷豐富,，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的其他成員還將被發(fā)現(xiàn),，這將有助于人們加快對(duì)神經(jīng)元起營(yíng)養(yǎng)及保護(hù)作用的潛在的影響因素的認(rèn)識(shí)，從而為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療及藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ),。

國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè) 2002年第2期第23卷