楊卉,陳生弟,李彪,陸國強(qiáng)
（上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院神經(jīng)科,、帕金森病診療與研究中心,，上海 200025）
摘要：目的 克隆人野生型parkin基因并構(gòu)建真核表達(dá)載體pCDNA3.1-parkin，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞獲得高表達(dá)人野生型parkin基因的PC12細(xì)胞克隆,。方法 從胎腦組織中提取總RNA,，用RT-PCR方法獲得人野生型parkin基因的全長cDNA，插入pCR2.1-TA克隆載體中進(jìn)行序列測定,，測序正確后將其亞克隆至表達(dá)載體pCDNA3.1,，利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，經(jīng)G418篩選獲得抗性細(xì)胞克隆,，采用RT-PCR和Western Blot方法鑒定人野生型parkin基因在PC12細(xì)胞中的過表達(dá),。結(jié)果 經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析和DNA序列測定證實(shí)目的基因已插入重組質(zhì)粒，RT-PCR和Western Blot證明經(jīng)G418篩選得到的轉(zhuǎn)基因PC12細(xì)胞克隆中存在人野生型parkin基因的表達(dá),。結(jié)論 成功構(gòu)建了人野生型parkin基因的真核表達(dá)載體,，獲得了穩(wěn)定表達(dá)人野生型parkin基因的PC12細(xì)胞克隆，為進(jìn)一步研究parkin的生物學(xué)功能以及parkin在帕金森病發(fā)病機(jī)制中的作用奠定了良好的基礎(chǔ),。
關(guān)鍵詞：parkin基因,；質(zhì)粒；PC12細(xì)胞,；帕金森病
中圖分類號：Q 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：
Construction of eukaryotic expression vector containing human wild-type parkin gene and its expression in PC12 cells
YANG Hui, CHEN Sheng-di, LI Biao, LU Guo-qiang
(Department of Neurology, Clinical & Research Center for Parkinson Disease, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China)
Abstract: Objective To clone human wild-type parkin cDNA, construct its eukaryotic expression vector and obtain positive PC12 cell clones expressing human wild-type parkin gene stably. Methods The total RNA was extracted from aborted fetal brain. The full-length cDNA encoding human wild-type parkin gene was obtained using RT-PCR method and inserted into pCR2.1-TA cloning vector. After the sequencing was confirmed, the gene
基金項(xiàng)目：腦功能和腦重大疾病的基礎(chǔ)研究――帕金森病的發(fā)病機(jī)制和防治基礎(chǔ)資助項(xiàng)目（G1999054008）,；國家自然科學(xué)基金（39970263, 30171025）資助項(xiàng)目；上海市衛(wèi)生系統(tǒng)百名跨世紀(jì)優(yōu)秀學(xué)科帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃（97BR001）資助項(xiàng)目
通訊作者：陳生弟 作者簡介：楊卉（1975-）,，女,，在讀博士生，主要從事帕金森病發(fā)病機(jī)制的分子生物學(xué)研究
E-mail： [email protected] 聯(lián)系電話：021-64370045-665514 收稿日期：2003-09-01
was subcloned to pCDNA3.1 to construct recombinant eukaryotic expression vector pCDNA3.1-parkin. The recombinant plasmid was transfected into PC12 cells by lipofectamin method and positive cell clones were screened with G418. Overexpression of human wild-type parkin gene in the transfected cells was confirmed with RT-PCR and Western Blot. Results Enzyme digestion analysis and sequencing showed that the target gene was cloned into recombinant vector. Overexpression of human parkin gene in the transfected PC12 cells was identified with RT-PCR and Western Blot. Conclusion The eukaryotic expression plasmid containing human parkin gene was successfully constructed. The positive PC12 cell clones expressing human wild-type parkin gene stably were obtained, which may be a promising cell model for studying the biological function of the parkin gene and the role of parkin in the pathogenesis of Parkinson disease.
Keyword parkin gene; plasmid; PC12 cell; Parkinson disease
Parkin基因是1998年由Kitada等發(fā)現(xiàn)并命名的常染色體隱性遺傳性青少年型帕金森綜合征(AR-JP)的致病基因,，定位于6q25.2-27[1],。自克隆成功以來先后在多個國家的AR-JP家系中發(fā)現(xiàn)了parkin基因的幾十種不同突變。多項(xiàng)研究顯示早發(fā)性散發(fā)性帕金森病患者中也存在parkin的多種突變,；這提示parkin基因很可能在遺傳性帕金森病和原發(fā)性帕金森病的共同致病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用,。
目前，parkin的功能研究取得了初步進(jìn)展,，但其確切的生物學(xué)作用仍不清楚,。2000年Shimura等首先報(bào)道parkin蛋白是一種環(huán)形泛素蛋白連接酶，在泛素蛋白酶體通路中擔(dān)負(fù)特異性識別靶蛋白的重要職責(zé),，參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解過程,，在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的質(zhì)量控制過程中發(fā)揮重要作用[2]。至今已發(fā)現(xiàn)的5種parkin蛋白底物,，如CDCrel-1,，Synphilin-1，αSP22,，Pael-R和Cyclin E,，提示parkin可能參與突觸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程[3],。有些學(xué)者推測：帕金森病患者發(fā)生parkin基因突變,，致使parkin蛋白喪失泛素蛋白連接酶活性，可能造成細(xì)胞內(nèi)有害蛋白質(zhì)的異常堆積,，最終導(dǎo)致多巴胺能細(xì)胞死亡,；parkin蛋白可能具有細(xì)胞保護(hù)作用,，通過泛素蛋白酶體通路來抑制某種或某些類型的細(xì)胞死亡。
由此可見,，深入研究parkin基因的功能對于闡明遺傳性和原發(fā)性帕金森病的發(fā)病機(jī)制以及尋求新的帕金森病治療策略都有重要意義,。本研究從胎腦組織中克隆得到了人野生型parkin基因，成功構(gòu)建了parkin基因的真核表達(dá)載體,，并獲得穩(wěn)定表達(dá)人parkin基因的PC12細(xì)胞克隆,，為下一步研究parkin的生物學(xué)功能以及parkin在帕金森病發(fā)病機(jī)制中的作用奠定了良好的基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料 正常人腦組織標(biāo)本來源于流產(chǎn)胎兒腦組織,；質(zhì)粒pCDNA3.1和大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存,；PC12細(xì)胞購自中科院上海生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究所；pCR2.1 TA Vector,，OPTI-MEMâI,，Lipofectamin2000，Trizol和DMEM培養(yǎng)液均為Invitrogen公司產(chǎn)品,；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶,，Taq酶購自Promega公司；Advantage cDNA PCR Kit購自Clontech公司,；連接酶,、限制性內(nèi)切酶和DL2000 Marker購自Takara公司；膠純化試劑盒購自QIAGEN公司,；兔抗人parkin多克隆抗體和HRP標(biāo)記小鼠抗兔IgG為Cell Signaling公司產(chǎn)品,；兔抗鼠Actin多克隆抗體購自Santa Cruz公司；考馬氏亮藍(lán)法總蛋白檢測試劑盒購自南京建成生物公司,。
1.2 方法
1.2.1 RT-PCR擴(kuò)增人野生型parkin基因的全長cDNA 用Trizol試劑從胎腦組織中抽提總RNA,，取1μg RNA作為逆轉(zhuǎn)錄模板行RT反應(yīng)。采用具有糾錯功能的可擴(kuò)增長片段cDNA模板的Advantage cDNA Kit試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng),。上游引物：5’-cccagtgaccatgatagtgtttgt-3’,，下游引物：5’-ttcttctgcaatttggctgtagtt-3’；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min,；94℃變性1min,，62℃退火1min，72℃延伸2min,，循環(huán)35次,；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步鑒定,。
1.2.2 克隆載體pCR2.1-parkin的構(gòu)建和序列測定 TA克隆載體pCR2.1與膠回收純化的PCR產(chǎn)物按1：3（摩爾比）的比例在T4 DNA連接酶作用下進(jìn)行連接,，16℃反應(yīng)16h。取10µl連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌,，將轉(zhuǎn)化的菌液涂在X-gal處理過的含有氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)12h,，在長出藍(lán),、白克隆的LB平板上挑取白色克隆進(jìn)行少量擴(kuò)增、質(zhì)粒小抽,，用EcoRI單酶切初步鑒定陽性細(xì)菌克隆,，將酶切鑒定正確的細(xì)菌克隆送交上海申友公司測序。
1.2.3 真核表達(dá)載體pCDNA3.1-parkin的構(gòu)建和鑒定 測序正確的質(zhì)粒pCR2.1-parkin用限制酶HindIII和XbaI進(jìn)行雙酶切反應(yīng),，純化回收約1.4Kb大小的目的片段；質(zhì)粒pCDNA3.1也進(jìn)行HindIII和XbaI雙酶切,，純化回收大片段,。用T4 DNA連接酶連接目的片段和線性化的空質(zhì)粒pCDNA3.1，16℃反應(yīng)16h,。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌,，將轉(zhuǎn)化的菌液涂在含有氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)12h，挑取陽性克隆進(jìn)行少量擴(kuò)增,、質(zhì)粒小抽,，以HindIII和XbaI雙酶切鑒定陽性細(xì)菌克隆。
1.2.4 重組質(zhì)粒pCDNA3.1-parkin在PC12細(xì)胞中的表達(dá) PC12細(xì)胞采用含10%胎牛血清,、100IU/ml青霉素和100IU/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液,，置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前將PC12細(xì)胞按照5×105/孔的密度鋪于六6孔板（Falcon）中,，待細(xì)胞生長達(dá)80%融合度時(shí)吸出培養(yǎng)液,，用磷酸緩沖液（PBS）清洗2次，加入OPTI-MEMâI培養(yǎng)液500µl,，將1µg DNA和250µlOPTI-MEMâI混合,，3µl Lipofectamine2000和250µlOPTI-MEMâI混合，5 min后將兩液混合,，室溫靜止25 min后加入培養(yǎng)孔,，37℃轉(zhuǎn)染5 h后更換為正常PC12培液，37℃的5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72h,，然后用96孔有限稀釋法進(jìn)行G418(500µg/ml)抗性細(xì)胞克隆的篩選,。
1.2.5 RT-PCR和Western Blot鑒定人parkin基因在PC12細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá) 待具有G418抗性的PC12細(xì)胞克隆長滿6孔板時(shí)，抽提細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),，鑒定人parkin基因的表達(dá),，引物序列與反應(yīng)條件同上。同時(shí),，抽提細(xì)胞總蛋白質(zhì),，用考馬氏亮藍(lán)法測定樣品蛋白濃度，取10µg總蛋白行10%SDS-PAGE蛋白電泳（100V,，20min,；然后150V,，2h）；蛋白轉(zhuǎn)膜(80mA,，2h)后進(jìn)行Western Blot檢測,，反應(yīng)條件：①PVDF膜浸于封閉液中，4℃過夜,；②加入兔抗人parkin多克隆抗體(1:1000)或兔抗鼠Actin多克隆抗體（1：200）,，室溫振蕩孵育4h；清洗后加入HRP標(biāo)記的小鼠抗兔IgG（1:2,000）,，室溫振蕩孵育1h,；③采用化學(xué)發(fā)光法檢測，9ml去離子水中加入ECL(enhanced chemicoilluminenscenecs)溶液A和溶液B各0.5ml,，充分混勻后加在膜上,，暗室曝光X線底片10min。
2 結(jié)果
2.1 特異性條帶的獲得 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離后得到一條約1.4kb的特異條帶,，符合parkin cDNA的大小,。
2.2 重組克隆載體pCR2.1-parkin的酶切鑒定及測序分析 質(zhì)粒pCR2.1的多克隆位點(diǎn)區(qū)（MCS）有兩個EcoRI限制酶位點(diǎn)；重組克隆載體pCR2.1-parkin經(jīng)EcoRI單酶切后得到一條1.4kb的目的條帶和一條約3.9kb的線性化質(zhì)粒pCR2.1的條帶,。單酶切鑒定正確的pCR2.1-parkin細(xì)菌克隆進(jìn)行測序,，測序結(jié)果與Gene bank登錄序列(AB009973)進(jìn)行Blast序列比對，結(jié)果顯示除第768位堿基由“C”變?yōu)?ldquo;T”（即第223位氨基酸由“脯氨酸”變?yōu)?ldquo;絲氨酸”）以外,，其余堿基序列完全一致（Fig 2）,。經(jīng)考證發(fā)現(xiàn)大多數(shù)健康人的parkin基因第768位堿基為“T”（即第223位氨基酸為“絲氨酸”），它是野生型堿基類型,，并非突變型,，證明本研究已正確克隆了人野生型parkin基因的cDNA序列。
Fig 2 Blast sequence analysis of human parkin gene.Query：The sequence of human wild-type parkin gene in Gene bank (AB009973);Sbjct： The sequencing result of the recombinant plasmid pCR2.1-parkin
Query: 752 ctctgacaaggaaacaccagtagctttgcacctgatcgcaacaaatagtcggaacatcac 811
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Sbjct: 738 ctctgacaaggaaacatcagtagctttgcacctgatcgcaacaaatagtcggaacatcac 797
Query: 812 ttgcattacgtgcacagacgtcaggagccccgtcctggttttccagtgcaactcccgcca 871
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Sbjct: 798 ttgcattacgtgcacagacgtcaggagccccgtcctggttttccagtgcaactcccgcca 857
2.3 重組表達(dá)載體pCDNA3.1-parkin的構(gòu)建和酶切鑒定 重組質(zhì)粒用限制酶HindIII/XbaI雙酶切,，電泳結(jié)果顯示約1.4kb處有一特異條帶,，證明目的基因已正確插入質(zhì)粒pCDNA3.1，得到了真核表達(dá)載體pCDNA3.1-parkin（Fig 3）,。
2.4 RT-PCR鑒定人parkin基因在PC12細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá) 重組質(zhì)粒pCDNA3.1-parkin轉(zhuǎn)染后經(jīng)G418(500µg/ml)篩選得到G418抗性細(xì)胞克隆,，抽提細(xì)胞總RNA行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用特異性擴(kuò)增人源性parkin基因的上,、下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng),，得到了人parkin基因的目的條帶(1.4kb)，提示G418抗性細(xì)胞克隆中存在人parkin基因,?？召|(zhì)粒pCDNA3.1轉(zhuǎn)染后獲得的G418抗性細(xì)胞克隆經(jīng)RT-PCR后無特異性條帶生成（Fig 4）。
2.5 Western Blot鑒定人parkin基因在PC12細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá) 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCDNA3.1-parkin的PC12細(xì)胞克隆經(jīng)Western Blot證實(shí)約52KkD處有高表達(dá)的parkin蛋白條帶,，提示人parkin基因已經(jīng)在PC12細(xì)胞中獲得了穩(wěn)定表達(dá),；轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的PC12細(xì)胞克隆和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的PC12細(xì)胞中僅有低水平內(nèi)源性parkin蛋白表達(dá)（Fig 5）,。
3. 討論
Parkin基因是繼α-synuclein后第二個被克隆的家族性帕金森病的致病基因，編碼一種分子量(Mr)約為52000,具有獨(dú)特的泛素樣結(jié)構(gòu)域和雙環(huán)指樣結(jié)構(gòu)域的高度保守蛋白質(zhì),，即parkin蛋白,。像其他擁有環(huán)指樣結(jié)構(gòu)的許多蛋白質(zhì)一樣，parkin蛋白被證實(shí)是一種環(huán)形泛素蛋白連接酶,，參與細(xì)胞內(nèi)突變,、損傷和錯誤折疊蛋白質(zhì)的清除過程。研究發(fā)現(xiàn)AR-JP患者所有腦區(qū)均無parkin蛋白分布,，parkin基因突變使parkin蛋白喪失了泛素蛋白連接酶活性[4],。目前，parkin功能缺失阻斷泛素蛋白酶體通路后如何損傷多巴胺能神經(jīng)元的機(jī)制尚不清楚,。近期研究顯示離體培養(yǎng)神經(jīng)元中parkin突變表達(dá)能增強(qiáng)氧化應(yīng)激和增加一氧化氮生成[5],。海藻酸誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y凋亡時(shí)parkin蛋白在caspase酶介導(dǎo)下被水解清除,，說明parkin功能下調(diào)可能在凋亡途徑中發(fā)揮作用[6],。突觸囊泡相關(guān)蛋白CDCrel-1是一種parkin蛋白底物，在神經(jīng)系統(tǒng)優(yōu)勢表達(dá),，可抑制突觸囊泡分泌,；CDCrel-1異常積聚可能會抑制多巴胺分泌引起多巴胺能細(xì)胞氧化損傷[7]。由此可見,，parkin基因可能通過參與多種細(xì)胞過程（如凋亡,，神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，氧化應(yīng)激,，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等）中相關(guān)蛋白質(zhì)的降解過程發(fā)揮重要功能,；parkin功能缺失可能引起細(xì)胞內(nèi)這些有害蛋白質(zhì)異常堆積，最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元變性死亡,。令人欣喜的是,，最近有三項(xiàng)研究報(bào)告證實(shí)parkin基因的過表達(dá)具有多重保護(hù)作用，能保護(hù)神經(jīng)元免遭α-synuclein毒性,，蛋白酶體抑制劑,，Pael-R積聚以及海藻酸誘導(dǎo)的興奮性毒性所造成的多種形式的損傷，這為將來通過降解細(xì)胞內(nèi)有害蛋白質(zhì)沉積防治帕金森病提供了直接而有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)[8~10],。進(jìn)一步研究parkin基因功能有助于闡明帕金森病的發(fā)病機(jī)制和發(fā)現(xiàn)新的帕金森病治療思路,。
本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的重組質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶酶切圖譜與預(yù)期結(jié)果相符，獲得了約1.4kb大小的目的條帶,。將目的基因測序結(jié)果與Gene bank中登錄序列進(jìn)行比對,，我們發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果除第768位堿基由“C”變?yōu)?ldquo;T”（即第223位氨基酸由“脯氨酸”變?yōu)?ldquo;絲氨酸”）以外，其余堿基序列完全一致,。早在1998年公布發(fā)現(xiàn)parkin基因的論文中,，Kitada等就曾指出,所有受試個體（包括患者和正常對照者）的parkin DNA序列與已登錄的cDNA序列相比,，第768位堿基不是“C” 而是 “T”，即第223位氨基酸不是“脯氨酸”而是“絲氨酸” [1],。此后,，該研究小組發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的日本人,土耳其人和高加索人parkin基因的第223位氨基酸是 “絲氨酸”，證實(shí) 第223位“絲氨酸”是野生型,。因此,，本實(shí)驗(yàn)中克隆的人野生型parkin cDNA序列是完全正確的。我們在實(shí)驗(yàn)中采用特異性擴(kuò)增人源性parkin基因的上,、下游引物通過RT-PCR反應(yīng)鑒定外源性人parkin基因在轉(zhuǎn)基因PC12細(xì)胞中的表達(dá),，證實(shí)了具有G418抗性的轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCDNA3.1-parkin的PC12細(xì)胞克隆中有人parkin基因的mRNA水平的表達(dá)；同時(shí),，我們對這些轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行了Western Blot檢測,，發(fā)現(xiàn)約52kD處有高表達(dá)的parkin蛋白條帶，說明這些細(xì)胞中有人parkin蛋白的高水平表達(dá),。本實(shí)驗(yàn)中我們成功獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人野生型parkin基因的PC12細(xì)胞克隆,，這為我們進(jìn)一步研究parkin基因功能和parkin基因在帕金森病發(fā)病機(jī)制中的作用以及parkin蛋白可能的神經(jīng)保護(hù)作用打下了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn):
[1] Kitada T, Asakawa S, Hattori N, et al. Mutation in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism[J]. Nature, 1998, 392: 605-608.
[2] Shimura H, Hattori N, Kubo S, et al. Familial Parkinson disease gene product, parkin, is a ubiquitin-protein ligase[J]. Nat Genet, 2000, 25: 302-305.
[3] Feany MB, Pallanck LJ. Parkin: a multipurpose neuroprotective agent[J]. Neuron, 2003, 38: 13-16.
[4] Shimura H, Hattori N, Kubo S, et al. Immunohischemical and subcellular localization of Parkin: absence of protein in AR-JP[J]. Ann Neurol, 1999, 45: 668-672.
[5] Hyun DH, Lee M, Hattori N, et al. Effect of wild-type or mutant Parkin on oxidative damage, nitric oxide, antioxidant defenses, and the proteasome[J]. J Biol Chem, 2002, 277: 28572-28577.
[6] Kahns S, Lykkebo S, Jakobsen LD, et al. Caspase-mediated parkin cleavage in apoptotic cell death[J]. J Biol Chem, 2002, 277: 15303-15308.
[7] Zhang Y, Gao J, Chung KK, et al. Parkin function as an E2-deprndent ubiquitin-protein ligase and promotes the degradation of the synaptic vesicle-associated protein, CDCrel-1[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 21: 13354-13359.
[8] Petrucelli L, O'Farrell C, Lockhart PJ, et al. Parkin protects against the toxicity associated with mutant alpha-synuclein: proteasome dysfunction selectively affects catecholaminergic neurons[J]. Neuron, 2002, 36: 1007-1019.
[9] Yang Y, Nishimura I, Imai Y, et al. Parkin suppresses dopaminergic neuron-selective neurotoxicity induced by Pael-R in Drosophila[J]. Neuron, 2003, 37: 911-924.
[10] Staropoli JF, McDermott C, Martinat C, et al. Parkin is a component of an SCF-like ubiquitin ligase complex and protects postmitotic neurons from kainate excitotoxicity[J]. Neuron, 2003, 37: 735-749.
