唐治華1, 劉國卿2
（1．南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所,，江蘇南京210002；2.中國藥科大學(xué)藥理學(xué)教研室,，江蘇 南京210009）
摘要： 目的 分離不含神經(jīng)組織的高純度腦微血管片段并研究其GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體的亞型分布,。方法 采用磁珠在體動(dòng)脈灌注標(biāo)記大鼠腦血管，機(jī)械和膠原酶消化相結(jié)合解離腦組織技術(shù),，經(jīng)過篩去除大血管后,，在磁場下分選出腦微血管片段。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分析神經(jīng)元特異表達(dá)基因microtubule-associated protein(MAP-2a),、膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)基因glatamine synthetase、血管內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)基因CD31及4種已發(fā)現(xiàn)的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體亞型基因的表達(dá),，克隆微血管片段表達(dá)的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體亞型基因并測序確證,。結(jié)果 分離的腦微血管片段沒有發(fā)現(xiàn)明顯的神經(jīng)組織附著；也沒有檢測到神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)的mRNA,。在該腦微血管片段檢測到1種低親和力的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體BGT-1和1種高親和力的轉(zhuǎn)運(yùn)體GAT-2,。結(jié)論 磁選獲得的腦微血管片段適用于血腦屏障上轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的檢測與克隆研究,。大鼠血腦屏障上存在GAT-2和BGT-1兩種GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體亞型。本研究沒有在血腦屏障發(fā)現(xiàn)其他已報(bào)道的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體,，是否存在新的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體,，尚需進(jìn)一步研究探討。
關(guān)鍵詞：血腦屏障,，GABA,，轉(zhuǎn)運(yùn)體
中圖分類號：Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A
Locolization of GABA transporter subtypes at the blood-brain barrier
TANG Zhi-hua1, LIU Guo-qing2
(1.Nanjing Military Medical Institute, Nanjing 210002; 2.Chinese Pharmaceutical University,Nanjing 210009)
Abstract: Objective To isolate the brain microvessels without neural tissues and investigate the locolization of GABA transporter subtypes at blood-brain barrier. Methods The brain microvessels labelled by intracarotid infusion of magnetic beads were obtained by magnetic sorting,and their neural specific gene microtubule-associated protein 2a(MAP-2a), glial specific gene glatamine synthetase,microvascular endothelial cell specific gene CD31 and GABA transporter subtypes were analysed by RT-PCR.The gene of GABA transporter subtypes expressed in the brain microvessels were cloned and sequenced. Results In the isolated
brain microvessels the neural specific gene, glial specific gene were not detected,and microvascular endothelial
基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30171075) 通訊作者：唐治華 作者簡介：唐治華（1966-），男,，河南睢縣人,，副研究員，中國藥科大學(xué)在讀博士生,，主要從事藥理毒理學(xué)研究. E-mail：[email protected] 聯(lián)系電話：(025)4500460 收稿日期：2003-09-28
cell specific gene,GAT-2 and BGT-1 of GABA transporter were found . Conclusion The brain microvessels obtained by magnetic sorting were convenient for detecting and cloning specific gene at the blood-brain barrier.GAT-2,BGT-1 of GABA transporter subtypes were detected at blood-brain barrier and responsible for the GABA effluxing from the brain.
Key words: blood-brain barrier; GABA; transporter
γ-氨基丁酸（GABA）是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),。GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體能攝取突觸間隙及細(xì)胞外液的GABA，終止神經(jīng)沖動(dòng)傳遞,，與生理病理過程關(guān)系密切,。GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體屬Na+,Cl-依賴性神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體家族[1]。目前4種大鼠GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體亞型已被克隆,，根據(jù)其氨基酸序列和藥理學(xué)特性分為GAT1,，GAT2，GAT3和BGT-1,。GAT1和GAT3僅在神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá) ,，而GAT2和BGT-1還在肝、腎等其他器官被檢測到,，GAT1,，GAT2，GAT3屬高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)體,，BGT-1屬低親和力轉(zhuǎn)運(yùn)體[2],。
血腦屏障主要由緊密連接的腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，它不僅調(diào)控循環(huán)血液中的營養(yǎng)物質(zhì)和藥物進(jìn)入腦內(nèi),，而且可將神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)活性甾體外排入循環(huán)血液,。我們曾采用牛腦微血管和培養(yǎng)的牛腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞研究血腦屏障的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)，發(fā)現(xiàn)血腦屏障上存在低親和力和高親和力2種GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體,；受4種GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑抑制的強(qiáng)弱順序分別接近BGT-1和GAT-1,，但又不完全相同；血腦屏障上GABA的凈轉(zhuǎn)運(yùn)方向是從腦到血 [3,4],。Kakee等[5,6]用腦外排指數(shù)法進(jìn)一步證實(shí)了血腦屏障對GABA的外排轉(zhuǎn)運(yùn),，并在永生化的小鼠腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞株(TM-BBB)證實(shí)存在BGT-1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。原代培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞株常在長期傳代過程中不同程度地喪失或改變了在體的生物學(xué)活性[7],，應(yīng)用培養(yǎng)細(xì)胞研究血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)體基因分布具有一定的局限性,。血腦屏障上的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體可能成為藥物作用的新靶點(diǎn),，具有較高的理論意義和實(shí)用價(jià)值。為此,，我們采用磁珠分選的高純度腦微血管和RT-PCR技術(shù)研究血腦屏障上GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體,，以期進(jìn)一步明確其亞型分布。
1 材料與方法
1.1 動(dòng)物 SD大鼠,，體重250~300g,，雌雄不拘，南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,。
1.2 磁珠 采用液相合成法制備鐵氧體磁珠,，經(jīng)分級分離得到200～500nm的球形磁珠[15]。磁珠懸于生理緩沖液中,，濃度為10mg/ml,。
1.3 磁珠灌注及腦微血管分離[8] 硫噴妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉。分離兩側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈并插管,，經(jīng)插管注入肝素200IU/kg使全身肝素化,。雙側(cè)插管內(nèi)分別同時(shí)注入磁珠4ml/kg。斷頭處死大鼠,，取出兩側(cè)大腦半球,，剔除軟腦膜及白質(zhì)，剪碎,，懸于pH7.2的PBS緩沖液,，與0.1mg/ml的膠原酶Ⅱ型等比例混合，置37℃消化30min后,，吹打至無明顯團(tuán)塊,。將組織懸液通過100目的篩網(wǎng)，收集的濾液置試管中,，在2000GS磁場下磁選5min,，將貼壁的微血管片段用PBS緩沖液懸起，重復(fù)磁選1次,。
1.4 大鼠腦微血管片段的分子生物學(xué)鑒定[ 9 ] 用Tripure試劑（Roche）分別抽提微血管片段和全腦組織的tRNA,，作為RT-PCR反應(yīng)的模板。設(shè)計(jì)合成神經(jīng)元特異表達(dá)基因微管相關(guān)蛋白2a（microtubule-associated protein 2a,，MAP-2a）的引物5ˊ- CTAGATCCACTAATGCCAGT -3ˊ和5ˊ-GTGATCCTCTTGTCCAC-3ˊ, 擴(kuò)增片段為640bp,；膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)基因谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase）的引物5ˊ-CTAGATCCACTAATGCCAGT-3ˊ和5ˊ-TTAGCACACCAGTCTTGAAC-3ˊ，擴(kuò)增片段為500bp,；血管內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)基因CD31的引物5ˊ-GCCTTGGTAGAGCACA-3ˊ和5ˊ-GCCTTGGCTTTCCTCA-3ˊ,，擴(kuò)增片段為1007bp。采用上述模板、引物和Access RT-PCR System(Promega)進(jìn)行RT-PCR,。反應(yīng)條件為：42℃ 60min，94℃ 5min 1個(gè)循環(huán),；94℃30s,，退火1min，72℃1min,，共30個(gè)循環(huán),；72℃延伸7min。MAP-2a,，谷氨酰胺合成酶和CD31的退火溫度分別為50℃,，50℃和41℃。采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物,。
1.5 RT-PCR分析血腦屏障上GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體的亞型分布 采用Clustalw軟件對大鼠GAT1,，GAT2，GAT3和BGT-1的cDNA全序列進(jìn)行同源性分析,，取高度保守片段5’-ATCTTCTCCATCGTGGGCTTCAT-3’作為其共同的上游引物,，取相對特異性片段分別作為其下游引物，GAT1為5’-AATGCCACCCTGGGTGATG-3’,，GAT2為5’-為CCATGGATATGTGTACTTC-3’,，GAT3為CTCCCTCTGTCAGCATCACC，BGT-1為5’-AGAGCCAGGAGATCTTCAC-3’,。分別以抽提的腦微血管片段和全腦組織的tRNA為模板,，進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)體系50μl,包括：5×AMV/Tfl緩沖液10μl, AMV逆轉(zhuǎn)錄酶5U,，Tfl DNA多聚酶5U,10mmol/L dNTPs 1μl,25mmol/L MgSO41.5μl,正義引物和反義引物均為50pmol,tRNA 5μg,加DEPC處理水補(bǔ)至50μl,。反應(yīng)條件為：42℃ 60min，94℃ 5min 1個(gè)循環(huán),；94℃30s,，退火1min，72℃1min,，共30個(gè)循環(huán),；72℃延伸7min。GAT1,、GAT2,、GAT3和BGT-1的退火溫度分別為52℃，53℃,，47℃和50℃,。采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。
1.6 PCR產(chǎn)物的分離純化,、克隆和測序 用無菌刀片切取含微血管片段GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體特異DNA片段條帶的凝膠,，采用Wizard PCR Preps DNA Purification System(Promega)回收純化DNA片段,，以pGEM—T Vector System Ⅱ(Promega)克隆DNA片段。挑取白色菌落,，送上海申友生物技術(shù)公司測序,。
2結(jié)果
2.1 大鼠腦微血管片段的分子生物學(xué)鑒定 分離純化的大鼠腦微血管片段在相差顯微鏡下為直徑7μm左右的微血管片段，呈樹狀逐級分支,，無神經(jīng)組織附著,。MAP-2a，glutamine synthetase和CD31基因的RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.2％的瓊脂糖凝膠電泳,，溴化已錠染色分析,，全腦組織中MAP-2a，glutamine synthetase和CD31均在相應(yīng)位置出現(xiàn)陽性條帶,，分離純化的腦微血管僅CD31陽性（Fig 1）,。以上操作重復(fù)2次，電泳結(jié)果均與第一次完全一致,。
2.2 大鼠腦微血管片段的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體基因亞型分布 分別采用4種GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體對應(yīng)的特異引物和共同的上游引物,，以純化大鼠腦微血管和腦組織的tRNA為模板，進(jìn)行RT-PCR,。RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.2％的瓊脂糖凝膠電泳,，溴化已錠染色分析，全腦組織GAT1, GAT2, GAT3, BGT-1均在相應(yīng)位置出現(xiàn)陽性條帶,，分離純化的腦微血管中僅GAT2, BGT-1陽性（）,。
對腦微血管片段的GAT2和BGT-1的陽性條帶進(jìn)行克隆、測序,，分別得到491bp和414bp的兩段核苷酸序列,。同源性分析結(jié)果表明，它們分別與大鼠GAT2(GenBank M95762),，BGT-1(GenBank L42300) cDNA全序列的對應(yīng)部分高度同源,，同源性均為99%。
3 討論
利用磁選分離的原理,，我們采用直徑小于紅細(xì)胞的球形磁性材料于體內(nèi)頸動(dòng)脈灌注標(biāo)記腦血管,，機(jī)械和膠原酶消化相結(jié)合解離腦組織，最大限度地保持了游離出的微血管內(nèi)皮細(xì)胞的完整性,。經(jīng)過篩去除大血管后,，在磁場下分選得到了腦微血管片段。形態(tài)學(xué)觀察表明該微血管片段沒有明顯的神經(jīng)組織附著,；也沒有檢測到神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)的mRNA,，排除了完整神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞成分的存在。
血腦屏障的主要功能是限制循環(huán)血液中的疏水性物質(zhì)非特異性地進(jìn)入腦組織液，同時(shí)保留腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì),。目前認(rèn)為其另一重要作用是作為腦的解毒系統(tǒng)外排內(nèi)源性代謝產(chǎn)物,。近年的研究證實(shí)，血腦屏障上存在多種神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體如去甲腎上腺素,，5-羥色胺[10],，谷氨酸[11]和GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體等，它們不同程度地參與了神經(jīng)遞質(zhì)的外排轉(zhuǎn)運(yùn)和滅活,。但這些轉(zhuǎn)運(yùn)體在神經(jīng)遞質(zhì)滅活中的作用和其真正意義有待探討。
本研究結(jié)果證實(shí)有1種低親和力的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體BGT-1和1種高親和力的轉(zhuǎn)運(yùn)體GAT-2共同存在于大鼠腦微血管,，而在永生化小鼠腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞株僅發(fā)現(xiàn)BGT-1的分布[6],。與我們的前期研究結(jié)果相對照[3]，BGT-1可能就是存在于腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞腔面的低親和力轉(zhuǎn)運(yùn)體,，擔(dān)負(fù)GABA的內(nèi)排轉(zhuǎn)運(yùn),。Ohtsuki等[12]僅在培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)BGT-1一種GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體，故認(rèn)為血腦屏障對GABA的外排轉(zhuǎn)運(yùn)是由BGT-1所介導(dǎo),。GAT-2可能存在于腦面,，參與了血腦屏障GABA的部分外排轉(zhuǎn)運(yùn)。這樣,，GABA的凈轉(zhuǎn)運(yùn)方向就是從腦到血,，該推斷與前期研究結(jié)果相符合。但GAT-2對GABA外排轉(zhuǎn)運(yùn)的強(qiáng)度和數(shù)量取決于其在血腦屏障上分布的區(qū)域和密度,。
腦內(nèi)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體的主要功能是快速重?cái)z取突觸間隙的GABA以終止其突觸傳遞,。血腦屏障對GABA的凈轉(zhuǎn)運(yùn)方向是由腦到血，這已被不同實(shí)驗(yàn)室所證實(shí)[4,，6],。血腦屏障對GABA的外排轉(zhuǎn)運(yùn)功能與腦內(nèi)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)存在一定差異。GAT-2可能參與腦脊液GABA水平的調(diào)節(jié),，進(jìn)而間接調(diào)節(jié)GABA能傳導(dǎo),； GAT-2介導(dǎo)的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)也可能在滲透壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮一定作用[12]。小分子有機(jī)質(zhì)?；撬幔╰aurine）,甜菜堿（betaine）和肌醇是腦內(nèi)重要的滲透介質(zhì)[13],。在高張狀態(tài)下，如taurine,betaine在腦內(nèi)濃度升高,，外排轉(zhuǎn)運(yùn)是滲透壓調(diào)控的主要方式,。Betaine,taurine 及hypotaurine對GAT2均具有較高的親和性，血腦屏障上的GAT2對GABA和小分子有機(jī)質(zhì)的外排轉(zhuǎn)運(yùn)作用可能是調(diào)節(jié)腦滲透壓的重要方式,。血腦屏障上的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體可能不參與正常情況下突觸間隙GABA的快速滅活,。進(jìn)一步研究GAT-2在血腦屏障上的分布特點(diǎn)有助于闡明其在血腦屏障GABA轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，磁選獲得的腦微血管片段適用于血腦屏障上轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的檢測與克隆研究,。大鼠血腦屏障上存在GAT-2,BGT-1兩種GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體亞型,。本研究沒有在血腦屏障發(fā)現(xiàn)其他已報(bào)道的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體，是否還存在其他的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體,，尚需進(jìn)一步研究探討,。
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