唐治華1, 劉國卿2
（1．南京軍區(qū)軍事醫(yī)學研究所，江蘇南京210002,；2.中國藥科大學藥理學教研室,，江蘇 南京210009）
摘要： 目的 分離不含神經組織的高純度腦微血管片段并研究其GABA轉運體的亞型分布。方法 采用磁珠在體動脈灌注標記大鼠腦血管,，機械和膠原酶消化相結合解離腦組織技術,，經過篩去除大血管后，在磁場下分選出腦微血管片段,。應用RT-PCR技術分析神經元特異表達基因microtubule-associated protein(MAP-2a),、膠質細胞特異表達基因glatamine synthetase、血管內皮細胞特異表達基因CD31及4種已發(fā)現的GABA轉運體亞型基因的表達,，克隆微血管片段表達的GABA轉運體亞型基因并測序確證,。結果 分離的腦微血管片段沒有發(fā)現明顯的神經組織附著；也沒有檢測到神經元和膠質細胞特異表達的mRNA,。在該腦微血管片段檢測到1種低親和力的GABA轉運體BGT-1和1種高親和力的轉運體GAT-2,。結論 磁選獲得的腦微血管片段適用于血腦屏障上轉運體基因的檢測與克隆研究。大鼠血腦屏障上存在GAT-2和BGT-1兩種GABA轉運體亞型,。本研究沒有在血腦屏障發(fā)現其他已報道的GABA轉運體,，是否存在新的GABA轉運體，尚需進一步研究探討,。
關鍵詞：血腦屏障,，GABA，轉運體
中圖分類號：Q781 文獻標識碼：A
Locolization of GABA transporter subtypes at the blood-brain barrier
TANG Zhi-hua1, LIU Guo-qing2
(1.Nanjing Military Medical Institute, Nanjing 210002; 2.Chinese Pharmaceutical University,Nanjing 210009)
Abstract: Objective To isolate the brain microvessels without neural tissues and investigate the locolization of GABA transporter subtypes at blood-brain barrier. Methods The brain microvessels labelled by intracarotid infusion of magnetic beads were obtained by magnetic sorting,and their neural specific gene microtubule-associated protein 2a(MAP-2a), glial specific gene glatamine synthetase,microvascular endothelial cell specific gene CD31 and GABA transporter subtypes were analysed by RT-PCR.The gene of GABA transporter subtypes expressed in the brain microvessels were cloned and sequenced. Results In the isolated
brain microvessels the neural specific gene, glial specific gene were not detected,and microvascular endothelial
基金項目：國家自然科學基金項目(30171075) 通訊作者：唐治華 作者簡介：唐治華（1966-）,，男,，河南睢縣人,，副研究員，中國藥科大學在讀博士生,，主要從事藥理毒理學研究. E-mail：[email protected] 聯系電話：(025)4500460 收稿日期：2003-09-28
cell specific gene,GAT-2 and BGT-1 of GABA transporter were found . Conclusion The brain microvessels obtained by magnetic sorting were convenient for detecting and cloning specific gene at the blood-brain barrier.GAT-2,BGT-1 of GABA transporter subtypes were detected at blood-brain barrier and responsible for the GABA effluxing from the brain.
Key words: blood-brain barrier; GABA; transporter
γ-氨基丁酸（GABA）是哺乳動物腦內主要的抑制性神經遞質,。GABA轉運體能攝取突觸間隙及細胞外液的GABA，終止神經沖動傳遞,，與生理病理過程關系密切,。GABA轉運體屬Na+,Cl-依賴性神經遞質轉運體家族[1]。目前4種大鼠GABA轉運體亞型已被克隆,，根據其氨基酸序列和藥理學特性分為GAT1，GAT2,，GAT3和BGT-1,。GAT1和GAT3僅在神經系統表達 ，而GAT2和BGT-1還在肝,、腎等其他器官被檢測到,，GAT1，GAT2,，GAT3屬高親和力轉運體,，BGT-1屬低親和力轉運體[2]。
血腦屏障主要由緊密連接的腦毛細血管內皮細胞構成,，它不僅調控循環(huán)血液中的營養(yǎng)物質和藥物進入腦內,，而且可將神經遞質和神經活性甾體外排入循環(huán)血液。我們曾采用牛腦微血管和培養(yǎng)的牛腦微血管內皮細胞研究血腦屏障的GABA轉運,，發(fā)現血腦屏障上存在低親和力和高親和力2種GABA轉運體,；受4種GABA轉運體抑制劑抑制的強弱順序分別接近BGT-1和GAT-1，但又不完全相同,；血腦屏障上GABA的凈轉運方向是從腦到血 [3,4],。Kakee等[5,6]用腦外排指數法進一步證實了血腦屏障對GABA的外排轉運，并在永生化的小鼠腦毛細血管內皮細胞株(TM-BBB)證實存在BGT-1的mRNA和蛋白質的表達,。原代培養(yǎng)的內皮細胞或細胞株常在長期傳代過程中不同程度地喪失或改變了在體的生物學活性[7],，應用培養(yǎng)細胞研究血腦屏障的轉運體基因分布具有一定的局限性。血腦屏障上的GABA轉運體可能成為藥物作用的新靶點,，具有較高的理論意義和實用價值,。為此，我們采用磁珠分選的高純度腦微血管和RT-PCR技術研究血腦屏障上GABA轉運體,，以期進一步明確其亞型分布,。
1 材料與方法
1.1 動物 SD大鼠，體重250~300g,，雌雄不拘,，南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,。
1.2 磁珠 采用液相合成法制備鐵氧體磁珠，經分級分離得到200～500nm的球形磁珠[15],。磁珠懸于生理緩沖液中,，濃度為10mg/ml。
1.3 磁珠灌注及腦微血管分離[8] 硫噴妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉,。分離兩側頸內動脈并插管,，經插管注入肝素200IU/kg使全身肝素化。雙側插管內分別同時注入磁珠4ml/kg,。斷頭處死大鼠,，取出兩側大腦半球，剔除軟腦膜及白質,，剪碎,，懸于pH7.2的PBS緩沖液，與0.1mg/ml的膠原酶Ⅱ型等比例混合,，置37℃消化30min后,，吹打至無明顯團塊。將組織懸液通過100目的篩網,，收集的濾液置試管中,，在2000GS磁場下磁選5min，將貼壁的微血管片段用PBS緩沖液懸起,，重復磁選1次,。
1.4 大鼠腦微血管片段的分子生物學鑒定[ 9 ] 用Tripure試劑（Roche）分別抽提微血管片段和全腦組織的tRNA，作為RT-PCR反應的模板,。設計合成神經元特異表達基因微管相關蛋白2a（microtubule-associated protein 2a,，MAP-2a）的引物5ˊ- CTAGATCCACTAATGCCAGT -3ˊ和5ˊ-GTGATCCTCTTGTCCAC-3ˊ, 擴增片段為640bp；膠質細胞特異表達基因谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase）的引物5ˊ-CTAGATCCACTAATGCCAGT-3ˊ和5ˊ-TTAGCACACCAGTCTTGAAC-3ˊ,，擴增片段為500bp,；血管內皮細胞特異表達基因CD31的引物5ˊ-GCCTTGGTAGAGCACA-3ˊ和5ˊ-GCCTTGGCTTTCCTCA-3ˊ，擴增片段為1007bp,。采用上述模板,、引物和Access RT-PCR System(Promega)進行RT-PCR。反應條件為：42℃ 60min,，94℃ 5min 1個循環(huán),；94℃30s，退火1min,，72℃1min,，共30個循環(huán)；72℃延伸7min。MAP-2a,，谷氨酰胺合成酶和CD31的退火溫度分別為50℃,，50℃和41℃。采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物,。
1.5 RT-PCR分析血腦屏障上GABA轉運體的亞型分布 采用Clustalw軟件對大鼠GAT1,，GAT2，GAT3和BGT-1的cDNA全序列進行同源性分析,，取高度保守片段5’-ATCTTCTCCATCGTGGGCTTCAT-3’作為其共同的上游引物,，取相對特異性片段分別作為其下游引物，GAT1為5’-AATGCCACCCTGGGTGATG-3’,，GAT2為5’-為CCATGGATATGTGTACTTC-3’,，GAT3為CTCCCTCTGTCAGCATCACC，BGT-1為5’-AGAGCCAGGAGATCTTCAC-3’,。分別以抽提的腦微血管片段和全腦組織的tRNA為模板,，進行RT-PCR。反應體系50μl,包括：5×AMV/Tfl緩沖液10μl, AMV逆轉錄酶5U,，Tfl DNA多聚酶5U,10mmol/L dNTPs 1μl,25mmol/L MgSO41.5μl,正義引物和反義引物均為50pmol,tRNA 5μg,加DEPC處理水補至50μl。反應條件為：42℃ 60min,，94℃ 5min 1個循環(huán),；94℃30s，退火1min,，72℃1min,，共30個循環(huán)；72℃延伸7min,。GAT1,、GAT2、GAT3和BGT-1的退火溫度分別為52℃,，53℃,，47℃和50℃。采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物,。
1.6 PCR產物的分離純化,、克隆和測序 用無菌刀片切取含微血管片段GABA轉運體特異DNA片段條帶的凝膠，采用Wizard PCR Preps DNA Purification System(Promega)回收純化DNA片段,，以pGEM—T Vector System Ⅱ(Promega)克隆DNA片段,。挑取白色菌落，送上海申友生物技術公司測序,。
2結果
2.1 大鼠腦微血管片段的分子生物學鑒定 分離純化的大鼠腦微血管片段在相差顯微鏡下為直徑7μm左右的微血管片段,，呈樹狀逐級分支，無神經組織附著。MAP-2a,，glutamine synthetase和CD31基因的RT-PCR反應產物經1.2％的瓊脂糖凝膠電泳,，溴化已錠染色分析，全腦組織中MAP-2a,，glutamine synthetase和CD31均在相應位置出現陽性條帶,，分離純化的腦微血管僅CD31陽性（Fig 1）。以上操作重復2次,，電泳結果均與第一次完全一致,。
2.2 大鼠腦微血管片段的GABA轉運體基因亞型分布 分別采用4種GABA轉運體對應的特異引物和共同的上游引物，以純化大鼠腦微血管和腦組織的tRNA為模板,，進行RT-PCR,。RT-PCR反應產物經1.2％的瓊脂糖凝膠電泳，溴化已錠染色分析,，全腦組織GAT1, GAT2, GAT3, BGT-1均在相應位置出現陽性條帶,，分離純化的腦微血管中僅GAT2, BGT-1陽性（）。
對腦微血管片段的GAT2和BGT-1的陽性條帶進行克隆,、測序,，分別得到491bp和414bp的兩段核苷酸序列。同源性分析結果表明,，它們分別與大鼠GAT2(GenBank M95762),，BGT-1(GenBank L42300) cDNA全序列的對應部分高度同源，同源性均為99%,。
3 討論
利用磁選分離的原理,，我們采用直徑小于紅細胞的球形磁性材料于體內頸動脈灌注標記腦血管，機械和膠原酶消化相結合解離腦組織,，最大限度地保持了游離出的微血管內皮細胞的完整性,。經過篩去除大血管后，在磁場下分選得到了腦微血管片段,。形態(tài)學觀察表明該微血管片段沒有明顯的神經組織附著,；也沒有檢測到神經元和膠質細胞特異表達的mRNA，排除了完整神經元和膠質細胞成分的存在,。
血腦屏障的主要功能是限制循環(huán)血液中的疏水性物質非特異性地進入腦組織液,，同時保留腦內的神經遞質。目前認為其另一重要作用是作為腦的解毒系統外排內源性代謝產物,。近年的研究證實,，血腦屏障上存在多種神經遞質轉運體如去甲腎上腺素，5-羥色胺[10],，谷氨酸[11]和GABA轉運體等,，它們不同程度地參與了神經遞質的外排轉運和滅活。但這些轉運體在神經遞質滅活中的作用和其真正意義有待探討。
本研究結果證實有1種低親和力的GABA轉運體BGT-1和1種高親和力的轉運體GAT-2共同存在于大鼠腦微血管,，而在永生化小鼠腦毛細血管內皮細胞株僅發(fā)現BGT-1的分布[6],。與我們的前期研究結果相對照[3]，BGT-1可能就是存在于腦微血管內皮細胞腔面的低親和力轉運體,，擔負GABA的內排轉運,。Ohtsuki等[12]僅在培養(yǎng)內皮細胞發(fā)現BGT-1一種GABA轉運體，故認為血腦屏障對GABA的外排轉運是由BGT-1所介導,。GAT-2可能存在于腦面,，參與了血腦屏障GABA的部分外排轉運。這樣,，GABA的凈轉運方向就是從腦到血,，該推斷與前期研究結果相符合。但GAT-2對GABA外排轉運的強度和數量取決于其在血腦屏障上分布的區(qū)域和密度,。
腦內GABA轉運體的主要功能是快速重攝取突觸間隙的GABA以終止其突觸傳遞,。血腦屏障對GABA的凈轉運方向是由腦到血，這已被不同實驗室所證實[4,，6],。血腦屏障對GABA的外排轉運功能與腦內GABA轉運存在一定差異。GAT-2可能參與腦脊液GABA水平的調節(jié),，進而間接調節(jié)GABA能傳導,； GAT-2介導的GABA轉運也可能在滲透壓調節(jié)中發(fā)揮一定作用[12]。小分子有機質?；撬幔╰aurine）,甜菜堿（betaine）和肌醇是腦內重要的滲透介質[13]。在高張狀態(tài)下,，如taurine,betaine在腦內濃度升高,，外排轉運是滲透壓調控的主要方式。Betaine,taurine 及hypotaurine對GAT2均具有較高的親和性,，血腦屏障上的GAT2對GABA和小分子有機質的外排轉運作用可能是調節(jié)腦滲透壓的重要方式,。血腦屏障上的GABA轉運體可能不參與正常情況下突觸間隙GABA的快速滅活。進一步研究GAT-2在血腦屏障上的分布特點有助于闡明其在血腦屏障GABA轉運中的作用,。
本實驗結果表明,，磁選獲得的腦微血管片段適用于血腦屏障上轉運體基因的檢測與克隆研究。大鼠血腦屏障上存在GAT-2,BGT-1兩種GABA轉運體亞型,。本研究沒有在血腦屏障發(fā)現其他已報道的GABA轉運體,，是否還存在其他的GABA轉運體，尚需進一步研究探討,。
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