趙紅靜 譯

湖北荊州江漢石油學(xué)院生物系 （湖北荊州 434023）

T細(xì)胞庫被可再生的干細(xì)胞持續(xù)不斷地補(bǔ)充,。在成體中,，骨髓干細(xì)胞為胸腺提供前體細(xì)胞,，并需要一系列通常由胸腺提供的人們尚未完全了解的信號來啟動(dòng)發(fā)育程序,。由于未能在簡單的體外培養(yǎng)中重復(fù)這個(gè)發(fā)育過程,，所以阻礙了人們對全部獨(dú)特信號特征了解的努力,。在這一期《免疫學(xué)》中,，Schmitt和Zuniga-Pflucker（注：該文可下載）描述了一個(gè)較為簡單的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，可將表達(dá)Notch配基delta-1的胎肝干細(xì)胞OP9細(xì)胞系發(fā)育為成熟的T細(xì)胞,。該發(fā)現(xiàn)可大大促進(jìn)T細(xì)胞發(fā)育的研究,，并為在體外生成特定的T細(xì)胞群體提供一種方法。

淋巴細(xì)胞來源于已失去向紅系細(xì)胞或髓系細(xì)胞分化能力的多能造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells, HSC)的子代細(xì)胞,。該分化途徑中的第一步是生成能發(fā)育為T,、B淋巴細(xì)胞的共同淋巴細(xì)胞前體(common lymphoid precursor, CLP)。為了獲得完全發(fā)育成熟,，B,、T淋巴祖細(xì)胞必需能夠通過在特定分化階段調(diào)節(jié)抗原受體的表達(dá)的一個(gè)高度有序的過程進(jìn)行有效的抗原受體基因重排(Rothenberg, 2000)。在成年小鼠中,，B細(xì)胞的分化主要發(fā)生在骨髓中(BM),，而T細(xì)胞的分化絕大多數(shù)限制于胸腺。盡管B細(xì)胞的不同分化階段已在體外獲得成功,，但是,，迄今為止，T細(xì)胞在體外的生成仍需要麻煩的胚胎胸腺組織培養(yǎng)物,，或者可簡要代表胸腺三維結(jié)構(gòu)的胸腺上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的重新堆積物,。此表明胸腺結(jié)構(gòu)和基質(zhì)細(xì)胞提供正常胸腺生成所必需的獨(dú)特信號(hare et al., 1999)。
發(fā)育中的T細(xì)胞隨成熟不同而在胸腺中遷移到特定區(qū)域(圖1),。在最近的研究中,，Lind等(2001)提出：未特化的CLP在皮質(zhì)-髓質(zhì)交界區(qū)進(jìn)入胸腺，在開始TCRβ重排時(shí)通過皮質(zhì)向外遷移,，并隨β選擇在囊下區(qū)增殖,。CD4+CD8+(DP)胸腺細(xì)胞被認(rèn)為是在皮質(zhì)上皮細(xì)胞上經(jīng)歷陽性選擇，然而成熟的CD4+或CD8+(SP)胸腺細(xì)胞則是在它們橫穿進(jìn)入髓質(zhì)區(qū)的過程中經(jīng)歷陰性選擇,。發(fā)育中的胸腺細(xì)胞的這種動(dòng)態(tài)遷移表明截然不同的信號存在于胸腺內(nèi)的微環(huán)境中(Anderson 和Jenjinson, 2001),，但對這種空間限制性的信號是何物仍不完全清楚。最近的資料表明至少有某些這種信號是在Notch 信號途徑發(fā)出的,。
Schmitt和Zuniga-Pflucker在這篇報(bào)告中描述：在培養(yǎng)系統(tǒng)中如提供1個(gè)Notch信號可在體外使T細(xì)胞進(jìn)入成熟的程序,，否則促進(jìn)B細(xì)胞發(fā)育。近來Jaleco對該數(shù)據(jù)進(jìn)行了補(bǔ)充(2001),，他們檢測了不同的Notch配基(Delta-1或Jagged-1)在調(diào)節(jié)人類造血祖細(xì)胞的分化中的作用,。Jaleco等通過有趣的數(shù)據(jù)顯示不同的Notch配基可能在T細(xì)胞系發(fā)育中起其獨(dú)特的效應(yīng),，但它們不能使任何T細(xì)胞成熟。這些報(bào)告共同強(qiáng)化了一個(gè)觀點(diǎn),，這就是Notch信號在T細(xì)胞發(fā)育中調(diào)節(jié)關(guān)鍵的步驟,，并可能提供一般由完整的胸腺所提供有空間限制性信號。雖然Schmitt和Zuniga-Pflucker提出的資料決沒有對T細(xì)胞的發(fā)育做出定論,，但是他們描述了以前無法獲得的,，操作簡便的培養(yǎng)系統(tǒng)，毫無疑問將會推動(dòng)未來對復(fù)雜的分化途徑中所需的特征性信號的研究,。

Notch方法總結(jié)
Notch途徑是通過調(diào)節(jié)受體細(xì)胞和含配基細(xì)胞的胞間接觸來調(diào)節(jié)包括蠕蟲,、蠅類、哺乳動(dòng)物在內(nèi)的多種生物發(fā)育的一種進(jìn)化保守信號機(jī)制,。Notch信號被認(rèn)為是影響復(fù)雜器官系統(tǒng)發(fā)育的模式,，并可在進(jìn)行性的發(fā)育階段被程序激活(Artavanis-Tsakonas等，1999),。已鑒定出4種哺乳動(dòng)物Notch受體，其與或?qū)儆贒elta-1或?qū)儆贘agged/Serrate家族的至少有5種不同的配基家族相連接(圖2),。Notch受體是I型具有共享一獨(dú)特信號機(jī)制的跨膜蛋白,。與配基相連后，在Notch胞內(nèi)區(qū)誘導(dǎo)出蛋白水解縫,，以產(chǎn)生活化的受體形式(Notch IC)轉(zhuǎn)移入核,，與隨處可遇的轉(zhuǎn)錄抑制子CBF1/RBP-Jκ(CBF1)相互作用，激活轉(zhuǎn)錄,。Notch IC中的高度保守的RAM和錨蛋白域通過直接與CBF1相接而置換出轉(zhuǎn)錄抑制子,，同時(shí)一特定的轉(zhuǎn)錄激活域(TAD)募集轉(zhuǎn)錄輔激活蛋白(Mumm and Kopan, 2000)。

Notch 信號調(diào)節(jié)T細(xì)胞發(fā)育
有相當(dāng)多的證據(jù)表明通過Notch受體發(fā)出的信號調(diào)節(jié)T細(xì)胞發(fā)育的多個(gè)階段,。一個(gè)清晰的共識正在逐步達(dá)成：Notch 1提供促進(jìn)CLPs分化成為T細(xì)胞系,，并抑制B細(xì)胞分化的直接信號來調(diào)節(jié)T細(xì)胞發(fā)育的最早期階段(Izon et al., 2002; Radke et al., 2002). 胸腺中造血干細(xì)胞缺乏Notch1功能將阻斷T細(xì)胞分化并導(dǎo)致未熟B細(xì)胞積累。相反,，骨髓中造血干細(xì)胞過量表達(dá)Notch-Ic而獲得Notch1功能將阻斷B細(xì)胞的發(fā)育并導(dǎo)致T細(xì)胞系提交,。Notch途徑可能也在維持造血干細(xì)胞種群、調(diào)節(jié)胸腺細(xì)胞發(fā)育成為γδ系而非αβ系,、促進(jìn)或抑制未熟的CD4+ 或CD8+ 胸腺細(xì)胞的成熟等方面起作用,。
對Notch如何信號影響如此多種功能的研究以達(dá)成共識的努力因?yàn)橄到y(tǒng)固有的冗余而加重。4種哺乳動(dòng)物Notch受體及配基在淋巴器官中以一種與它們的功能并無直接聯(lián)系的復(fù)雜的重疊方式表達(dá),。例如,，通過Notch1發(fā)出的信號影響胸腺中T系細(xì)胞的提交，但是也有證據(jù)表明Notch1也表達(dá)于造血干細(xì)胞,、胸腺細(xì)胞以及成熟的B細(xì)胞上(Anderson and Jenkinson, 2001; Bertrand et al., 2000). 此明顯的矛盾可用觀察資料解釋：Notch信號通過影響與配基連接或調(diào)整胞內(nèi)信號的大量分子而主要起調(diào)節(jié)作用,。Notch受體對Delta或Jagged/Serrate家族中的配基響應(yīng)的能力受到具3個(gè)不同分子的Fringe家族影響(Lunatic, Maniac, and Radical Fringe),。 有趣的是：胸腺細(xì)胞上過量表達(dá)Lunatic Fringe似乎抑制Notch信號，導(dǎo)致胸腺中B細(xì)胞的分化增加(Koch et al., 2001),。在胞內(nèi)區(qū),，Notch信號可被包括Numb、Hairless,、Deltex在內(nèi)的大量胞質(zhì)或核蛋白調(diào)節(jié),。這些分子可調(diào)節(jié)Notch信號的強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間和性質(zhì)(Radke et al., 2002).
最后,，有證據(jù)表明Notch信號可被其他信號途徑的活性所修正,。比如，通過Notch1和Notch2發(fā)出的信號可被M-CSF或GM-CSF的刺激產(chǎn)生不同的影響(Milner and Bigas, 1999). 這些觀測資料都表明Notch信號對特異發(fā)育階段或處不同微環(huán)境的細(xì)胞的影響是不同的,。所有這些因子可能同時(shí)對單個(gè)細(xì)胞起作用,，因而需要一個(gè)簡單的可分別檢測Notch信號系統(tǒng)的單個(gè)組分的體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。

T細(xì)胞發(fā)育的新體外培養(yǎng)系統(tǒng)
Schmitt和Zuniga-Pflucker提出T細(xì)胞和B細(xì)胞分化的所需條件非常相似,。通過在基質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)Notch配基Delta-1, OP9-DL1在IL-7和Flt3-L的影響下能夠介導(dǎo)鼠科胎肝干細(xì)胞(sorted CD117-/Sca1hi/Lin-)分化為功能性成熟的CD8+細(xì)胞,。含未修飾的OP9基質(zhì)細(xì)胞的相似的培養(yǎng)中在培養(yǎng)的早期階段產(chǎn)生NK細(xì)胞，然后專門產(chǎn)生B細(xì)胞,。
在OP9-DL1系統(tǒng)中,，干細(xì)胞被誘導(dǎo)程序性分化和胸腺里發(fā)生的相似。在12天內(nèi),，細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增2000倍,，產(chǎn)生大量γδ和αβ胚系T細(xì)胞。αβT細(xì)胞似乎啟動(dòng)1個(gè)完全的發(fā)育程序,，包括CD4和CD8分子表達(dá)的正常進(jìn)程,。到第7天，可見CD4-CD8-(DN)亞群,，可由表達(dá)CD44,、CD25和TCRβ重排決定。作者報(bào)道了接種了RAG-/-干細(xì)胞的培養(yǎng)物經(jīng)歷了預(yù)期的發(fā)育,，在DN3階段停止,。上述培養(yǎng)系統(tǒng)將大力促進(jìn)將來的研究，檢測在發(fā)育過程和DN階段之間對細(xì)胞因子或細(xì)胞表面受體的特定需要,。按照Wolfer et al. (2002)的資料,，該分析尤其有趣，表明通過Notch1發(fā)出的信號是完整的TCRβ重排和通過至少DN2/DN3階段的正常胸腺細(xì)胞進(jìn)程所必需的,。
Schmitt and Zuniga-Pflucker也提出一些資料表明正常的,、有功能的成熟T細(xì)胞能從它們的OP9-DL1培養(yǎng)物中產(chǎn)生。作者可以培養(yǎng)出少量的表達(dá)成熟的表面TCR的CD8+T細(xì)胞,。因?yàn)樵隗w外用plate-bound 抗-CD3刺激能誘導(dǎo)合成IFNγ,，所以這些TCRhiCD8+T細(xì)胞中至少有一些似乎已功能成熟,。與正常CD8+T細(xì)胞相比，這種激活如何作為控制因素并沒顯示出來,。另外,，作者也沒有通過在培養(yǎng)物中提供MHC-II來試圖產(chǎn)生成熟的CD4+T細(xì)胞。
并不清楚是否在OP9基質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)Delta-1就足夠誘導(dǎo)完整的正常T細(xì)胞發(fā)育程序,，包括功能性成熟的CD4+和CD8+T細(xì)胞的陽性和陰性選擇,。盡管如此，上述資料清晰描述了正常的T細(xì)胞特異性的發(fā)育程序至少可有效地開始和進(jìn)行到CD4+CD8+DP階段,。Schmitt and Zuniga-Pflucker預(yù)測在OP9-DL1共培養(yǎng)物中T細(xì)胞在干細(xì)胞中的祖細(xì)胞幾率大約為1/17,，在OP9共培養(yǎng)物中B細(xì)胞為1/6。T祖細(xì)胞的這種高幾率表明所觀測到的T細(xì)胞群是由未授權(quán)的干細(xì)胞庫分化而來,，而不是少量污染的未熟T細(xì)胞的選擇性生長,。

對調(diào)節(jié)T細(xì)胞成熟的信號定義
Schmitt and Zuniga-Pflucker所提供的上述資料與Jaleco et al.報(bào)道的以前的研究相似，表明Delta-1而不是Jagged-1能抑制B 細(xì)胞提交,。Jaleco et al.使用了1個(gè)相似的利用不同基質(zhì)細(xì)胞系(S17)和從人類索狀組織血液中分離出來的干細(xì)胞(CD34+)的培養(yǎng)系統(tǒng),。這2個(gè)研究均報(bào)道了含用Delta-1轉(zhuǎn)染的基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)物中B細(xì)胞發(fā)育受到抑制。Jaleco et al. 生產(chǎn)出大量的(達(dá)66%)似乎是未熟的T/NK祖細(xì)胞,，表達(dá)CD7和胞內(nèi)CD3和少量的(達(dá)4%)CD4+CD8T+ 細(xì)胞,。 Jaleco et al. 的驚人發(fā)現(xiàn)是在胸腺上皮細(xì)胞均能表達(dá)2種不同的Notch配基：Jagged-1和Delta-1，但他們的表達(dá)量并不一樣,。只有Delta-1能夠抑制B系細(xì)胞提交并且促進(jìn)未熟的T細(xì)胞前體分化。但是,，對這2種研究的比較又引起另外的重要的問題,。例如，確定為什么Jaleco 等不能培養(yǎng)出明顯數(shù)量的DP T細(xì)胞的原因是重要的,。無效的T細(xì)胞成熟可能是由于人類和鼠干細(xì)胞種群之間,、添加的生長因子或基質(zhì)細(xì)胞提供的獨(dú)特的陽性和陰性調(diào)節(jié)信號的差異所造成的。Schmitt和Zuniga-Pflucker 試圖通過直接在他們的培養(yǎng)系統(tǒng)中比較OP9和S17基質(zhì)細(xì)胞來確定該問題,。盡管未修飾的OP9和S17基質(zhì)細(xì)胞在產(chǎn)生大量的B細(xì)胞方面看起來功能相同,，但是，OP9-DL1基質(zhì)細(xì)胞與S17-DL1相比,，其產(chǎn)生DP T細(xì)胞的能力非常優(yōu)良,。首次清楚的是在T細(xì)胞分化的哪階段兩基質(zhì)細(xì)胞間存在著差異。不能產(chǎn)生有意義數(shù)量的DP T細(xì)胞可能得歸因于T/NK結(jié)果的轉(zhuǎn)換或早期T祖細(xì)胞的無效成熟,。無論如何,，從該結(jié)果可得出重要的一點(diǎn)：T細(xì)胞的產(chǎn)生所需要條件比僅僅是Notch信號的存在與否要多。

Notch信號在T細(xì)胞發(fā)育中起作用的意義
從上述資料引起一些關(guān)于Notch信號在不同的T細(xì)胞發(fā)育階段所起作用的重要問題,。例如,，與接觸性胸腺結(jié)構(gòu)相關(guān)的Notch受體和配基如何在胸腺內(nèi)生成過程中在胸腺內(nèi)空間表達(dá),？也許是全部的胸腺產(chǎn)出細(xì)胞或相對數(shù)量的不同的T細(xì)胞亞系可能由胸腺內(nèi)不同的Notch配基的可得性所決定。未提交的干細(xì)胞或發(fā)育中的T細(xì)胞可能會競爭與Notch配基的連接,，或者差異性地誘導(dǎo)調(diào)節(jié)Notch 信號的分子表達(dá),。
隨著胸腺細(xì)胞遷移進(jìn)入胸腺內(nèi)的特定區(qū)域，Notch配基的空間組成也可能通過調(diào)節(jié)Notch信號的持續(xù)時(shí)期來調(diào)節(jié)胸腺細(xì)胞的成熟,。并不清楚在Schmitt和Zuniga-Pflucker所報(bào)道的系統(tǒng)中,，發(fā)育中的T細(xì)胞在培養(yǎng)期能否接近Delta-1。有證據(jù)表明Notch信號在正常胸腺細(xì)胞發(fā)育過程中被改變了(Deftos et al., 2000),，而與此相沖突的報(bào)告則爭辯說在DP階段過量的Notch信號可能在DP階段外抑制可促進(jìn)成熟(Izon et al., 2002),。Schmitt和Zuniga-Pflucker所描述的培養(yǎng)系統(tǒng)將使得將來在不同胸腺細(xì)胞發(fā)育階段通過添加或清除不同的Notch配基來精確定位這些問題。

治療意義
過繼性的T細(xì)胞免疫療法(Adoptive T cell immunotherapy)是應(yīng)用在以抗腫瘤為目的的一外專業(yè)術(shù)語,，方法為重新輸入從病人體內(nèi)分離出來的并在體外以抗原加上IL-2擴(kuò)增的特異性的CD8+T細(xì)胞(Greenberg and Riddle, 1999),。Schmitt和Zuniga-Pflucker所描述的干細(xì)胞產(chǎn)生T細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)能不能用來產(chǎn)生預(yù)期的抗腫瘤特異性的T細(xì)胞或者是為免疫缺陷病人生產(chǎn)各種T細(xì)胞種群？某些T細(xì)胞缺陷病人如Di George綜合癥是因?yàn)樾叵倩|(zhì)細(xì)胞發(fā)育缺陷,，而且有正常造血干細(xì)胞的病人可從上皮胸腺移植中受益,。將轉(zhuǎn)染了Delta-1的基質(zhì)細(xì)胞與外周血干細(xì)胞共培養(yǎng)能產(chǎn)生移植用的T細(xì)胞庫嗎？為達(dá)到最好的免疫保護(hù),，基質(zhì)細(xì)胞必需與患者的HLA相配以便合適的HLA等位基因的陽性選擇選擇出最有用的T細(xì)胞組分來保護(hù)宿主,，誘導(dǎo)完全的免疫耐受以防止自身反應(yīng)性和自身免疫疾病。我們并不知道CD4和CD8陽性選擇是否確實(shí)在這些"簡單"的培養(yǎng)物中產(chǎn)生,，也不知道是否對完整的陰性選擇有影響,。多半胸腺結(jié)構(gòu)是為清除危險(xiǎn)的抗-自身-反應(yīng)性的克隆，為控制免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)T細(xì)胞的發(fā)育的促進(jìn)而特異設(shè)計(jì)的,。在我們對此了解更多以前,，使用體外系統(tǒng)來重建T細(xì)胞區(qū)似乎是危險(xiǎn)的療法。
此種新系統(tǒng)能否用于目標(biāo)更確切的方法以產(chǎn)生具有所希望的抗腫瘤特異性的新的效應(yīng)T細(xì)胞?為回答這個(gè)問題,，我們需要(1)腫瘤靶表位方面的知識,，比如說HLA-A2/melanA，(2)含Delta-1的基質(zhì)細(xì)胞系,，可攜帶A2基因和MHC I提呈缺陷,，如TAP缺陷的結(jié)果，以及(3)與靶表位相關(guān)的改變了的肽配基,，與HLA-A2接合,，為與腫瘤抗原有高親和力的CD8+ T細(xì)胞的陽性選擇服務(wù)?；颊叩母杉?xì)胞與加入肽段的這樣的基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)將導(dǎo)致CD8+T對A2/肽復(fù)合物的選擇性成熟(因?yàn)樵诨|(zhì)細(xì)胞上只提呈這些配基),。成熟的CD8+T細(xì)胞可在腫瘤抗原外加IL-2上擴(kuò)增以便重新注入患者體內(nèi)。這種方法可能比產(chǎn)生多種T細(xì)胞庫危險(xiǎn)性小，并可避開腫瘤患者可能沒有或僅有低親和力的T細(xì)胞的問題,。但是,，我們并不清楚T細(xì)胞總組成在這些培養(yǎng)物中是否符合選擇規(guī)律。
使用表達(dá)Notch配基的基質(zhì)細(xì)胞系的這種新方法可以使培養(yǎng)物中的T細(xì)胞提交和發(fā)育,，為分化程序中詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)分析立即提供極好的細(xì)胞庫,。臨床應(yīng)用在期待中。（注：插圖見原文）

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Immunity, Vol. 17, 689-692, December, 2002 原文下載