趙紅靜 譯
湖北荊州江漢石油學院生物系 （湖北荊州 434023）
T細胞庫被可再生的干細胞持續(xù)不斷地補充,。在成體中，骨髓干細胞為胸腺提供前體細胞,，并需要一系列通常由胸腺提供的人們尚未完全了解的信號來啟動發(fā)育程序,。由于未能在簡單的體外培養(yǎng)中重復這個發(fā)育過程，所以阻礙了人們對全部獨特信號特征了解的努力,。在這一期《免疫學》中,，Schmitt和Zuniga-Pflucker（注：該文可下載）描述了一個較為簡單的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，可將表達Notch配基delta-1的胎肝干細胞OP9細胞系發(fā)育為成熟的T細胞,。該發(fā)現(xiàn)可大大促進T細胞發(fā)育的研究,，并為在體外生成特定的T細胞群體提供一種方法。
淋巴細胞來源于已失去向紅系細胞或髓系細胞分化能力的多能造血干細胞(hematopoietic stem cells, HSC)的子代細胞,。該分化途徑中的第一步是生成能發(fā)育為T,、B淋巴細胞的共同淋巴細胞前體(common lymphoid precursor, CLP)。為了獲得完全發(fā)育成熟,，B,、T淋巴祖細胞必需能夠通過在特定分化階段調節(jié)抗原受體的表達的一個高度有序的過程進行有效的抗原受體基因重排(Rothenberg, 2000)。在成年小鼠中,，B細胞的分化主要發(fā)生在骨髓中(BM),，而T細胞的分化絕大多數(shù)限制于胸腺。盡管B細胞的不同分化階段已在體外獲得成功，但是,，迄今為止,，T細胞在體外的生成仍需要麻煩的胚胎胸腺組織培養(yǎng)物，或者可簡要代表胸腺三維結構的胸腺上皮細胞和基質細胞的重新堆積物,。此表明胸腺結構和基質細胞提供正常胸腺生成所必需的獨特信號(hare et al., 1999),。
發(fā)育中的T細胞隨成熟不同而在胸腺中遷移到特定區(qū)域(圖1)。在最近的研究中,，Lind等(2001)提出：未特化的CLP在皮質-髓質交界區(qū)進入胸腺,，在開始TCRβ重排時通過皮質向外遷移，并隨β選擇在囊下區(qū)增殖,。CD4+CD8+(DP)胸腺細胞被認為是在皮質上皮細胞上經(jīng)歷陽性選擇,，然而成熟的CD4+或CD8+(SP)胸腺細胞則是在它們橫穿進入髓質區(qū)的過程中經(jīng)歷陰性選擇。發(fā)育中的胸腺細胞的這種動態(tài)遷移表明截然不同的信號存在于胸腺內的微環(huán)境中(Anderson 和Jenjinson, 2001),，但對這種空間限制性的信號是何物仍不完全清楚,。最近的資料表明至少有某些這種信號是在Notch 信號途徑發(fā)出的。
Schmitt和Zuniga-Pflucker在這篇報告中描述：在培養(yǎng)系統(tǒng)中如提供1個Notch信號可在體外使T細胞進入成熟的程序,，否則促進B細胞發(fā)育,。近來Jaleco對該數(shù)據(jù)進行了補充(2001)，他們檢測了不同的Notch配基(Delta-1或Jagged-1)在調節(jié)人類造血祖細胞的分化中的作用,。Jaleco等通過有趣的數(shù)據(jù)顯示不同的Notch配基可能在T細胞系發(fā)育中起其獨特的效應,，但它們不能使任何T細胞成熟。這些報告共同強化了一個觀點,，這就是Notch信號在T細胞發(fā)育中調節(jié)關鍵的步驟,，并可能提供一般由完整的胸腺所提供有空間限制性信號。雖然Schmitt和Zuniga-Pflucker提出的資料決沒有對T細胞的發(fā)育做出定論,，但是他們描述了以前無法獲得的,，操作簡便的培養(yǎng)系統(tǒng)，毫無疑問將會推動未來對復雜的分化途徑中所需的特征性信號的研究,。
Notch方法總結
Notch途徑是通過調節(jié)受體細胞和含配基細胞的胞間接觸來調節(jié)包括蠕蟲,、蠅類、哺乳動物在內的多種生物發(fā)育的一種進化保守信號機制,。Notch信號被認為是影響復雜器官系統(tǒng)發(fā)育的模式,，并可在進行性的發(fā)育階段被程序激活(Artavanis-Tsakonas等，1999),。已鑒定出4種哺乳動物Notch受體,，其與或屬于Delta-1或屬于Jagged/Serrate家族的至少有5種不同的配基家族相連接(圖2)。Notch受體是I型具有共享一獨特信號機制的跨膜蛋白,。與配基相連后,，在Notch胞內區(qū)誘導出蛋白水解縫,，以產(chǎn)生活化的受體形式(Notch IC)轉移入核，與隨處可遇的轉錄抑制子CBF1/RBP-Jκ(CBF1)相互作用,，激活轉錄,。Notch IC中的高度保守的RAM和錨蛋白域通過直接與CBF1相接而置換出轉錄抑制子，同時一特定的轉錄激活域(TAD)募集轉錄輔激活蛋白(Mumm and Kopan, 2000),。
Notch 信號調節(jié)T細胞發(fā)育
有相當多的證據(jù)表明通過Notch受體發(fā)出的信號調節(jié)T細胞發(fā)育的多個階段,。一個清晰的共識正在逐步達成：Notch 1提供促進CLPs分化成為T細胞系，并抑制B細胞分化的直接信號來調節(jié)T細胞發(fā)育的最早期階段(Izon et al., 2002; Radke et al., 2002). 胸腺中造血干細胞缺乏Notch1功能將阻斷T細胞分化并導致未熟B細胞積累,。相反，骨髓中造血干細胞過量表達Notch-Ic而獲得Notch1功能將阻斷B細胞的發(fā)育并導致T細胞系提交,。Notch途徑可能也在維持造血干細胞種群,、調節(jié)胸腺細胞發(fā)育成為γδ系而非αβ系、促進或抑制未熟的CD4+ 或CD8+ 胸腺細胞的成熟等方面起作用,。
對Notch如何信號影響如此多種功能的研究以達成共識的努力因為系統(tǒng)固有的冗余而加重,。4種哺乳動物Notch受體及配基在淋巴器官中以一種與它們的功能并無直接聯(lián)系的復雜的重疊方式表達。例如,，通過Notch1發(fā)出的信號影響胸腺中T系細胞的提交,，但是也有證據(jù)表明Notch1也表達于造血干細胞、胸腺細胞以及成熟的B細胞上(Anderson and Jenkinson, 2001; Bertrand et al., 2000). 此明顯的矛盾可用觀察資料解釋：Notch信號通過影響與配基連接或調整胞內信號的大量分子而主要起調節(jié)作用,。Notch受體對Delta或Jagged/Serrate家族中的配基響應的能力受到具3個不同分子的Fringe家族影響(Lunatic, Maniac, and Radical Fringe),。 有趣的是：胸腺細胞上過量表達Lunatic Fringe似乎抑制Notch信號，導致胸腺中B細胞的分化增加(Koch et al., 2001),。在胞內區(qū),，Notch信號可被包括Numb、Hairless,、Deltex在內的大量胞質或核蛋白調節(jié),。這些分子可調節(jié)Notch信號的強度、持續(xù)時間和性質(Radke et al., 2002).
最后,，有證據(jù)表明Notch信號可被其他信號途徑的活性所修正,。比如，通過Notch1和Notch2發(fā)出的信號可被M-CSF或GM-CSF的刺激產(chǎn)生不同的影響(Milner and Bigas, 1999). 這些觀測資料都表明Notch信號對特異發(fā)育階段或處不同微環(huán)境的細胞的影響是不同的,。所有這些因子可能同時對單個細胞起作用,，因而需要一個簡單的可分別檢測Notch信號系統(tǒng)的單個組分的體外實驗系統(tǒng)。
T細胞發(fā)育的新體外培養(yǎng)系統(tǒng)
Schmitt和Zuniga-Pflucker提出T細胞和B細胞分化的所需條件非常相似,。通過在基質細胞上表達Notch配基Delta-1, OP9-DL1在IL-7和Flt3-L的影響下能夠介導鼠科胎肝干細胞(sorted CD117-/Sca1hi/Lin-)分化為功能性成熟的CD8+細胞,。含未修飾的OP9基質細胞的相似的培養(yǎng)中在培養(yǎng)的早期階段產(chǎn)生NK細胞，然后專門產(chǎn)生B細胞,。
在OP9-DL1系統(tǒng)中,，干細胞被誘導程序性分化和胸腺里發(fā)生的相似,。在12天內，細胞數(shù)量擴增2000倍,，產(chǎn)生大量γδ和αβ胚系T細胞,。αβT細胞似乎啟動1個完全的發(fā)育程序，包括CD4和CD8分子表達的正常進程,。到第7天,，可見CD4-CD8-(DN)亞群，可由表達CD44,、CD25和TCRβ重排決定,。作者報道了接種了RAG-/-干細胞的培養(yǎng)物經(jīng)歷了預期的發(fā)育，在DN3階段停止,。上述培養(yǎng)系統(tǒng)將大力促進將來的研究,，檢測在發(fā)育過程和DN階段之間對細胞因子或細胞表面受體的特定需要。按照Wolfer et al. (2002)的資料,，該分析尤其有趣,，表明通過Notch1發(fā)出的信號是完整的TCRβ重排和通過至少DN2/DN3階段的正常胸腺細胞進程所必需的。
Schmitt and Zuniga-Pflucker也提出一些資料表明正常的,、有功能的成熟T細胞能從它們的OP9-DL1培養(yǎng)物中產(chǎn)生,。作者可以培養(yǎng)出少量的表達成熟的表面TCR的CD8+T細胞。因為在體外用plate-bound 抗-CD3刺激能誘導合成IFNγ,，所以這些TCRhiCD8+T細胞中至少有一些似乎已功能成熟,。與正常CD8+T細胞相比，這種激活如何作為控制因素并沒顯示出來,。另外,，作者也沒有通過在培養(yǎng)物中提供MHC-II來試圖產(chǎn)生成熟的CD4+T細胞。
并不清楚是否在OP9基質細胞上表達Delta-1就足夠誘導完整的正常T細胞發(fā)育程序,，包括功能性成熟的CD4+和CD8+T細胞的陽性和陰性選擇,。盡管如此，上述資料清晰描述了正常的T細胞特異性的發(fā)育程序至少可有效地開始和進行到CD4+CD8+DP階段,。Schmitt and Zuniga-Pflucker預測在OP9-DL1共培養(yǎng)物中T細胞在干細胞中的祖細胞幾率大約為1/17,，在OP9共培養(yǎng)物中B細胞為1/6。T祖細胞的這種高幾率表明所觀測到的T細胞群是由未授權的干細胞庫分化而來,，而不是少量污染的未熟T細胞的選擇性生長,。
對調節(jié)T細胞成熟的信號定義
Schmitt and Zuniga-Pflucker所提供的上述資料與Jaleco et al.報道的以前的研究相似，表明Delta-1而不是Jagged-1能抑制B 細胞提交,。Jaleco et al.使用了1個相似的利用不同基質細胞系(S17)和從人類索狀組織血液中分離出來的干細胞(CD34+)的培養(yǎng)系統(tǒng),。這2個研究均報道了含用Delta-1轉染的基質細胞的培養(yǎng)物中B細胞發(fā)育受到抑制。Jaleco et al. 生產(chǎn)出大量的(達66%)似乎是未熟的T/NK祖細胞,，表達CD7和胞內CD3和少量的(達4%)CD4+CD8T+ 細胞,。 Jaleco et al. 的驚人發(fā)現(xiàn)是在胸腺上皮細胞均能表達2種不同的Notch配基：Jagged-1和Delta-1,，但他們的表達量并不一樣。只有Delta-1能夠抑制B系細胞提交并且促進未熟的T細胞前體分化,。但是,，對這2種研究的比較又引起另外的重要的問題。例如,，確定為什么Jaleco 等不能培養(yǎng)出明顯數(shù)量的DP T細胞的原因是重要的,。無效的T細胞成熟可能是由于人類和鼠干細胞種群之間、添加的生長因子或基質細胞提供的獨特的陽性和陰性調節(jié)信號的差異所造成的,。Schmitt和Zuniga-Pflucker 試圖通過直接在他們的培養(yǎng)系統(tǒng)中比較OP9和S17基質細胞來確定該問題,。盡管未修飾的OP9和S17基質細胞在產(chǎn)生大量的B細胞方面看起來功能相同，但是,，OP9-DL1基質細胞與S17-DL1相比,，其產(chǎn)生DP T細胞的能力非常優(yōu)良。首次清楚的是在T細胞分化的哪階段兩基質細胞間存在著差異,。不能產(chǎn)生有意義數(shù)量的DP T細胞可能得歸因于T/NK結果的轉換或早期T祖細胞的無效成熟,。無論如何,，從該結果可得出重要的一點：T細胞的產(chǎn)生所需要條件比僅僅是Notch信號的存在與否要多,。
Notch信號在T細胞發(fā)育中起作用的意義
從上述資料引起一些關于Notch信號在不同的T細胞發(fā)育階段所起作用的重要問題。例如,，與接觸性胸腺結構相關的Notch受體和配基如何在胸腺內生成過程中在胸腺內空間表達,？也許是全部的胸腺產(chǎn)出細胞或相對數(shù)量的不同的T細胞亞系可能由胸腺內不同的Notch配基的可得性所決定。未提交的干細胞或發(fā)育中的T細胞可能會競爭與Notch配基的連接,，或者差異性地誘導調節(jié)Notch 信號的分子表達,。
隨著胸腺細胞遷移進入胸腺內的特定區(qū)域，Notch配基的空間組成也可能通過調節(jié)Notch信號的持續(xù)時期來調節(jié)胸腺細胞的成熟,。并不清楚在Schmitt和Zuniga-Pflucker所報道的系統(tǒng)中,，發(fā)育中的T細胞在培養(yǎng)期能否接近Delta-1。有證據(jù)表明Notch信號在正常胸腺細胞發(fā)育過程中被改變了(Deftos et al., 2000),，而與此相沖突的報告則爭辯說在DP階段過量的Notch信號可能在DP階段外抑制可促進成熟(Izon et al., 2002),。Schmitt和Zuniga-Pflucker所描述的培養(yǎng)系統(tǒng)將使得將來在不同胸腺細胞發(fā)育階段通過添加或清除不同的Notch配基來精確定位這些問題。
治療意義
過繼性的T細胞免疫療法(Adoptive T cell immunotherapy)是應用在以抗腫瘤為目的的一外專業(yè)術語,，方法為重新輸入從病人體內分離出來的并在體外以抗原加上IL-2擴增的特異性的CD8+T細胞(Greenberg and Riddle, 1999),。Schmitt和Zuniga-Pflucker所描述的干細胞產(chǎn)生T細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)能不能用來產(chǎn)生預期的抗腫瘤特異性的T細胞或者是為免疫缺陷病人生產(chǎn)各種T細胞種群？某些T細胞缺陷病人如Di George綜合癥是因為胸腺基質細胞發(fā)育缺陷,，而且有正常造血干細胞的病人可從上皮胸腺移植中受益,。將轉染了Delta-1的基質細胞與外周血干細胞共培養(yǎng)能產(chǎn)生移植用的T細胞庫嗎？為達到最好的免疫保護,，基質細胞必需與患者的HLA相配以便合適的HLA等位基因的陽性選擇選擇出最有用的T細胞組分來保護宿主,，誘導完全的免疫耐受以防止自身反應性和自身免疫疾病,。我們并不知道CD4和CD8陽性選擇是否確實在這些"簡單"的培養(yǎng)物中產(chǎn)生，也不知道是否對完整的陰性選擇有影響,。多半胸腺結構是為清除危險的抗-自身-反應性的克隆,，為控制免疫應答的調節(jié)T細胞的發(fā)育的促進而特異設計的。在我們對此了解更多以前,，使用體外系統(tǒng)來重建T細胞區(qū)似乎是危險的療法,。
此種新系統(tǒng)能否用于目標更確切的方法以產(chǎn)生具有所希望的抗腫瘤特異性的新的效應T細胞?為回答這個問題，我們需要(1)腫瘤靶表位方面的知識,，比如說HLA-A2/melanA,，(2)含Delta-1的基質細胞系，可攜帶A2基因和MHC I提呈缺陷,，如TAP缺陷的結果,，以及(3)與靶表位相關的改變了的肽配基，與HLA-A2接合,，為與腫瘤抗原有高親和力的CD8+ T細胞的陽性選擇服務,。患者的干細胞與加入肽段的這樣的基質細胞共培養(yǎng)將導致CD8+T對A2/肽復合物的選擇性成熟(因為在基質細胞上只提呈這些配基),。成熟的CD8+T細胞可在腫瘤抗原外加IL-2上擴增以便重新注入患者體內,。這種方法可能比產(chǎn)生多種T細胞庫危險性小，并可避開腫瘤患者可能沒有或僅有低親和力的T細胞的問題,。但是,，我們并不清楚T細胞總組成在這些培養(yǎng)物中是否符合選擇規(guī)律。
使用表達Notch配基的基質細胞系的這種新方法可以使培養(yǎng)物中的T細胞提交和發(fā)育,，為分化程序中詳細的實驗分析立即提供極好的細胞庫,。臨床應用在期待中。（注：插圖見原文）
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Immunity, Vol. 17, 689-692, December, 2002 原文下載
