張貴燾 譯

復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院

對于許多組織，人胚胎干細(xì)胞有著很好的潛能成為移植細(xì)胞最終選擇的資源,，為了使它們能夠應(yīng)用于臨床,，應(yīng)有相應(yīng)的細(xì)胞分化標(biāo)準(zhǔn)和安全的規(guī)范措施。細(xì)胞應(yīng)是能夠改善癥狀而無副作用,，免疫排斥反應(yīng)也應(yīng)被克服,。這些不同亞型分化細(xì)胞的免疫抗原是由其表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體分子決定的。這里我們提出了一些克服人胚胎干細(xì)胞移植后遭受免疫排斥的方法,。
最近從人胚泡(blastocyst-stage embryos)內(nèi)層細(xì)胞群培養(yǎng)的多能性人胚胎干細(xì)胞（HESCs）,，為公眾和科學(xué)界增添了把這些細(xì)胞用于移植治療的期望,，產(chǎn)生這種期望的原因有兩個：（1）在細(xì)胞培養(yǎng)時，這些細(xì)胞好象有無限繁殖的能力同時保持未分化狀態(tài)（2）能夠被誘導(dǎo)分化形成三個胚芽層的細(xì)胞,，這可通過體外轉(zhuǎn)移這些細(xì)胞至非粘附板,，可自發(fā)形成有分化結(jié)構(gòu)的胚狀體（embryoid bodies EBs）；或向有重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合癥（SCID）小鼠體內(nèi)注入細(xì)胞,，可演變?yōu)榛チ觯ㄅ哐考?xì)胞瘤包含幾種不同類型的組織）,。然而這些方法會造成幾種不同類型的細(xì)胞混在一起，而其中大部分是不能用于治療使用,。因此許多實驗室首要目標(biāo)是致力于控制它的分化和獲得純化的細(xì)胞類型,。已有資料顯示當(dāng)添加生長因子時能夠誘導(dǎo)HESCs分化和獲得豐富的特定細(xì)胞群，像神經(jīng)元,，滋養(yǎng)層,，內(nèi)皮細(xì)胞，心肌細(xì)胞,，造血祖細(xì)胞和肝細(xì)胞樣細(xì)胞的形成。
在臨床應(yīng)用方面,，HESCs衍生物相對于目前使用的成體移植細(xì)胞和胎兒源性細(xì)胞有其優(yōu)點,，這包括HESCs在培養(yǎng)條件下較易保持穩(wěn)定性和可在更大程度上對HESCs進(jìn)行遺傳操縱等。對小鼠胚胎干細(xì)胞的遺傳操縱和基因操縱極大影響著對其生物學(xué)性狀和疾病的分析,。HESCs遺傳操縱方法的出現(xiàn)---像通過化學(xué)試劑轉(zhuǎn)染,，電穿孔和病毒載體---應(yīng)該在細(xì)胞治療和人胚胎分析方面發(fā)揮重要的角色。
然而,，用HESCs的衍生物治療前有幾個重要問題是必須考慮的,，移植的細(xì)胞必須是純化的細(xì)胞，因為其它細(xì)胞會導(dǎo)致有害的反應(yīng)和腫瘤,。移植細(xì)胞可把有害物質(zhì)從細(xì)胞系或培養(yǎng)細(xì)胞傳遞給病人,，因此移植前必須篩出含有病原體的細(xì)胞和選用在培養(yǎng)中具有生長能力的細(xì)胞系。最后的擔(dān)心是由于移植細(xì)胞表達(dá)非己蛋白質(zhì),，移植HESCs衍生物可能會被病人的免疫系統(tǒng)破壞,。
這篇綜述集中探討HESCs及其衍生物的免疫源性。誘發(fā)免疫反應(yīng)的分子會在本篇中細(xì)胞間的機(jī)制闡述,，并根據(jù)當(dāng)前的知識對HESCs表達(dá)的分子進(jìn)行討論,；此外我們描述的對于減少或完全阻斷免疫反應(yīng)對移植HESCs衍生物是有一定價值的。

HESCs表達(dá)的MHC蛋白質(zhì)：
在大部分情況下,，無遺傳相關(guān)性的個體之間的組織或器官移植會產(chǎn)生免疫反應(yīng)以及隨之而來的免疫排斥,。反應(yīng)針對的是被宿主免疫系統(tǒng)認(rèn)為非己物質(zhì)的異種抗原。異種抗原的三種主要成分是主要組織相容性復(fù)合物（MHC）,，次要組織相容性復(fù)合物（mHC）和ABO血型抗原,。MHC的不匹配是移植排斥的關(guān)鍵原因,，相應(yīng)地HESCs表達(dá)的這些分子會在本篇深入的探討，而mHC和ABO抗原對組織排斥的影響相對較小,，故在這里不集中討論,。
MHC蛋白被劃分為兩類，即MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ,，相應(yīng)地被人白細(xì)胞抗原基因HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ所編碼,。HLA基因有三種，分別為HLA-A,，HLA-B,，HLA-C。它們的產(chǎn)物同β2-微球蛋白形成復(fù)合物和構(gòu)成細(xì)胞膜上MHC-Ⅰ分子的功能片段,。大多數(shù)人有三對HLA-Ⅱ基因（HLA-DP,，HLA-HQ，HLA-DR）,，可形成細(xì)胞膜上MHC-Ⅱ分子的功能片段,，同抗原肽有關(guān)。HLA基因有兩種機(jī)制阻礙人之間的器官移植：（1）在人染色體上HLA是最具多態(tài)性的基因,，有數(shù)百個等位基因（2）至少有六個等位基因同時以共顯性的方式表達(dá),，因此MHC等位基因的完全匹配在無遺傳相關(guān)性的人之間概率是極低的，尤其因為單個HLA基因位點不匹配的情況導(dǎo)致的免疫反應(yīng)的發(fā)生,。這里我們首先討論HESCs以及衍生物表達(dá)的MHC抗原,，然后探討這些分子在排斥反應(yīng)中可能的機(jī)制。
最近檢測到的HESCs表達(dá)的MHC蛋白證實了未分化的HESCs僅表達(dá)低水平的MHC-1,，而向EBs內(nèi)注入自發(fā)分化的細(xì)胞可增加2至4倍的表達(dá),，當(dāng)細(xì)胞被誘導(dǎo)演變?yōu)榛チ鰰r可見到更高水平的表達(dá)（8至10倍）；然而對其它體細(xì)胞的檢測中MHC的絕對表達(dá)量仍然是很低的,，如HeLa細(xì)胞,。這些結(jié)果某種程度上不同于報道的MESCs的抗原的表達(dá)，即未分化的細(xì)胞是MHC-Ⅰ的負(fù)性表達(dá)和成熟EBs僅表達(dá)低水平的MHC-Ⅰ分子,。
免疫反應(yīng)中通常釋放的細(xì)胞因子家族成員干擾素（IFNs）是MHC分子的誘導(dǎo)物,，對培養(yǎng)的HESCs補(bǔ)充IFN-γ可相應(yīng)提高M(jìn)HC-1的表達(dá)，而IFN-α和IFN-β卻沒有任何作用,。為進(jìn)一步驗證結(jié)果,，DNA微量分析顯示細(xì)胞內(nèi)有IFN-γ的mRNA的表達(dá)，而無IFN-α和IFN-β的mRNA的表達(dá),。值得注意的是在HESCs演變成畸胎瘤后,，所有的IFNs均有對MHC-Ⅰ分子的表達(dá)相似的刺激作用，在這個例子中其表達(dá)水平與檢測的體細(xì)胞相似。同分化的HESCs類似,，人胚胎癌細(xì)胞的衍生物也可被IFNs刺激誘導(dǎo),。相對于MHC-Ⅰ，即使加入IFNs,，在分化和未分化的HESCs都缺乏MHC-Ⅱ分子的表達(dá),。然而當(dāng)HESCs分化為造血細(xì)胞譜系時可能有MHC-Ⅱ的分子表達(dá)，因為這些分子是淋巴細(xì)胞的主要表達(dá)分子,。

HESCs分化細(xì)胞的免疫識別：
伴隨著移植的發(fā)生,，HESCs的分化細(xì)胞表達(dá)的MHC導(dǎo)致異源性（alloreactive)T細(xì)胞對其產(chǎn)生排異反應(yīng)，這是因為每個人約有1％--10％的T淋巴細(xì)胞能夠把非己MHC分子作為外來抗原呈遞給自身MHC復(fù)合物,。然而排斥反應(yīng)的起始通常不僅要有MHC分子的表達(dá)而且需要其它類型細(xì)胞的共刺激和輔助信號,。例如，如果移植集落包含專門的抗原呈遞細(xì)胞（APCs),他們可以遷移到局域淋巴結(jié),，在那里可以刺激產(chǎn)生異源性的記憶性T淋巴細(xì)胞使其轉(zhuǎn)變?yōu)樾?yīng)T細(xì)胞,，然后效應(yīng)T細(xì)胞通過循環(huán)直接返回攻擊移植物。圍繞這個問題,，安全的策略應(yīng)是消耗移植集落中的APCs,，這會顯著減少免疫反應(yīng)的發(fā)生。CD4T細(xì)胞也可給記憶性CD8T提供輔助信號,，因此作為移植使用的HESCs衍生物即使缺乏APCs,，將仍然可能在CD4T細(xì)胞產(chǎn)生的輔助信號下被有排異反應(yīng)的CD8T細(xì)胞排斥。
移植反應(yīng)使HESCs分化細(xì)胞消失的其它可能機(jī)制是產(chǎn)生異種抗體和遲發(fā)性超敏反應(yīng)（DTH）,，異種抗體是由于移植物的多態(tài)性抗原呈遞給宿主APCs和然后再呈遞T細(xì)胞的自身MHC復(fù)合物所激發(fā)產(chǎn)生的。這種方式就是當(dāng)HESCs分化細(xì)胞的抗原結(jié)合T和B細(xì)胞表面受體,，隱蔽抗體將會結(jié)合異種抗原,，活化的補(bǔ)體系統(tǒng)對其破壞。相應(yīng)地,，在移植部位附近如果受體APCs攝入外來移植抗原,，呈遞給亞型輔助性T細(xì)胞，這些細(xì)胞釋放一系列細(xì)胞因子,，使巨噬細(xì)胞活化為漿細(xì)胞破壞組織,。由于DTH，移植的HESCs衍生物遭受嚴(yán)重的破壞,，因為這些細(xì)胞的抗原能夠致敏Th1細(xì)胞,。值得注意的是一種特殊的淋巴細(xì)胞亞型，即調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）能負(fù)性調(diào)節(jié)異種抗原的免疫反應(yīng),?？雌饋磉@些細(xì)胞在動物模型和人身上誘導(dǎo)對移植物的耐受是很有前景的，但不能肯定的是在HESCs衍生物中這些細(xì)胞能否使用。
在我們的研究中,，用自然殺傷淋巴細(xì)胞（NK）檢測了HESCs衍生物的耐受性,，探討這個問題是由于MHC-Ⅰ對NK細(xì)胞有抑制效應(yīng)。HESCs低量表達(dá)的這些分子卻有助于NK細(xì)胞的排斥反應(yīng),；然而我們發(fā)現(xiàn)HESCs無關(guān)的分化細(xì)胞和體外MHC-Ⅰ的表達(dá)水平,，NK不能殺死這些細(xì)胞。
為了確定NK細(xì)胞能否被HESCs表達(dá)的抑制信號所抑制,，我們檢測了細(xì)胞的非典型MHC-Ⅰ分子,，即HLA-G，胎盤細(xì)胞滋養(yǎng)層的胎兒面幾乎不表達(dá)HLA-G,，避免了母親的NK細(xì)胞傷害胎兒,。胎盤細(xì)胞表達(dá)的典型MHC-Ⅰ分子是很低的，我們發(fā)現(xiàn)在HESCs分化的前或后以及添加IFN,，HESCs都不表達(dá)MHC-Ⅰ,，不同程度的阻抑(lysis)配體可激活NK細(xì)胞，提示活化信號的缺失,，似乎可以相信HESCs不被NK殺死是因為缺乏識別信號,，而不是抑制。

最小程度的HESCs衍生物排斥反應(yīng)
對HESCs的分化細(xì)胞的免疫相關(guān)分子分析,，提示細(xì)胞可作為外來抗原被不同反應(yīng)T細(xì)胞識別,，導(dǎo)致發(fā)生免疫排斥反應(yīng)；然而,，細(xì)胞可能不表達(dá)共刺激因子和MHC-Ⅱ蛋白,，它們激活免疫反應(yīng)的強(qiáng)度較低。不考慮對HESCs分化細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)的程度,，這里有幾種可供選擇的減少它們免疫源性的方法,。

植入免疫特異部位：
同種異體移植后排斥反應(yīng)發(fā)生的幾率不僅要看MHC匹配的程度，而且要依賴于移植的部位,。不同的動物植入眼的前部,，腦和睪丸，它們的免疫反應(yīng)都是被嚴(yán)格限制的,，這些部位命名為免疫特異部位,。其部位的形成至少有三種機(jī)制：（1）這些部位都有非典型的淋巴細(xì)胞消耗，以及與身體其它部位的接觸被物理屏障隔開,，如血腦屏障,；（2）這些部位可產(chǎn)生免疫抑制因子，如β-轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）（3）表達(dá)Fas配體（FasL,，CD95L）,，誘導(dǎo)含CDFas（CD95）的淋巴細(xì)胞凋亡,。
這些部位能夠限制MHC并不匹配的HESCs的免疫反應(yīng)嗎？收集的資料顯示,，帕金森病人植入MHC并不匹配的多巴胺能神經(jīng)元后可延活數(shù)年并有效改善癥狀,，甚至缺少免疫抑制，因此在免疫特異部位植入分化的HESCs對于改善癥狀是有效的,。

細(xì)胞系匹配：
因為MHC異種抗原是被宿主T淋巴細(xì)胞破壞的主要目標(biāo),，移植前許多精力是花費在尋找HLA表型相同的器官。理論上HESCs細(xì)胞系應(yīng)該與病人的表型相同,；然而只有構(gòu)建一個非常大的HESCs免疫表型庫才可滿足大多數(shù)病人都相匹配的要求,。等位基因由3個單獨的MHC-Ⅰ基因片段組成,每個基因約有1000萬個單模標(biāo)本,可組成超過10億個多態(tài)復(fù)合體。顯然創(chuàng)建一個如此大規(guī)模的庫是不可能的,但創(chuàng)建一個合適規(guī)模的庫還是可行的,，選擇純合子的HLA可減少規(guī)模,，因為可忽略一些僅有很小排斥反應(yīng)的等位基因，純合子的HLA細(xì)胞系可通過單性繁殖獲得,。然而庫的規(guī)模還可進(jìn)一步減少,，因為當(dāng)細(xì)胞分化為非造血細(xì)胞時表達(dá)MHC-Ⅱ。

同基因HESCs細(xì)胞系的產(chǎn)生：
特定的同基因HESCs細(xì)胞系的傳代培養(yǎng)可解決每一個病人的排斥問題,，把HESCs體細(xì)胞核移植至摘除核的卵母細(xì)胞可得到,，HESCs系可在胚泡階段獲得。這種方法除了線粒體DNA是由卵母細(xì)胞提供的外,，可使細(xì)胞系的遺傳性狀與供體細(xì)胞核一致,。最近，從貓和鼠身上的核移植胚胎成功的培養(yǎng)出胚胎干細(xì)胞,，雖然相似的試驗還未在人身上獲得成功,。
理論上，如果對體細(xì)胞進(jìn)行程序重調(diào),，體細(xì)胞核植入HESCs也能夠產(chǎn)生同基因的胚胎干細(xì)胞系,。最近，MESCs同體細(xì)胞融合后證實重新構(gòu)造雜核細(xì)胞通常能保留其多能性,，但包含一條異常染色體；胚胎干細(xì)胞核的重新遷移或失活必須達(dá)到這樣的標(biāo)準(zhǔn),，即新建細(xì)胞系的體細(xì)胞核應(yīng)是遺傳物質(zhì)的貢獻(xiàn)者,。即使同基因細(xì)胞系可從體細(xì)胞核植入卵母細(xì)胞或從細(xì)胞融合獲得，仍然不清楚由于線粒體多態(tài)性導(dǎo)致的mHC不同會不會激發(fā)免疫排斥反應(yīng),。Lanza認(rèn)為在牛身上mHC的不同不會導(dǎo)致移植排斥,，類似的結(jié)果也可能在人身上看到。即便排斥反應(yīng)被線粒體抗原所激發(fā),，其程度可能要比MHC不相匹配所導(dǎo)致的免疫排斥要小的多,。
可供體細(xì)胞核移植的一種方法，HESCs細(xì)胞系可從人parthenotes獲得，孤雌生殖是未受精的卵母細(xì)胞活化并且開始分裂的過程,，最近從類人猿卵母細(xì)胞通過孤雌生殖培養(yǎng)出的多能干細(xì)胞增加了這種技術(shù)應(yīng)用于人的希望,。從免疫學(xué)的觀點來看，這些細(xì)胞是非常有用的,，因為它們完全同供體的卵母細(xì)胞相容,，這意味著如果能從女性病人通過孤雌生殖獲得多能干細(xì)胞，分化細(xì)胞的移植將不冒任何移植排斥的風(fēng)險,。而且這些細(xì)胞具有大多數(shù)的同源性,，它們也可成為HLA庫很好的供體，因為比起通常的異質(zhì)結(jié)合胚胎干細(xì)胞系,，它們擁有更大程度的匹配,。由于HLA基因在六號染色體上有相關(guān)聯(lián)的區(qū)域，孤雌生殖細(xì)胞系在治療遺傳性家族相關(guān)性疾病也有很大的優(yōu)勢,。在減數(shù)分裂期間,，如果HLA基因沒有發(fā)生重組，雖然病人的mHC有百分之五十的不同,，但仍有一半的HLA與其子孫相符合,。總而言之,，最終解決分化HESCs的排斥將是通過體細(xì)胞核移植或卵母細(xì)胞的孤雌生殖產(chǎn)生同基因細(xì)胞系,。然而核移植技術(shù)的效率極低，尤其在靈長類,；同時在倫理道德方面有著激烈的爭論,。相比之下，孤雌生殖的問題就少的多,，因為它的胚胎在懷孕期間會正常停止而進(jìn)行孤雌生殖的HESCs的分化細(xì)胞仍可對其調(diào)控,。

嵌合性造血細(xì)胞的誘導(dǎo)耐受：
在某些情況下，如果宿主攜帶有數(shù)種特異造血細(xì)胞系,，即嵌合造血細(xì)胞,，MHC表型的相符并不是必要的。它的形成可通過把供體的骨髓細(xì)胞注入病人造成不同造血干細(xì)胞的共存,。因此,，居于胸腺的供體APCs有助于T細(xì)胞自我識別的負(fù)性選擇，使移植器官時冒有限的風(fēng)險,。 這種方法對于HESCs分化物有著特殊的診療意義,，這些細(xì)胞可產(chǎn)生兩種造血細(xì)胞和其他類型的細(xì)胞，然而不同分化狀態(tài)的細(xì)胞間卻可形成耐受,。此外,，為防止移植物抗宿主免疫反應(yīng)疾?。╣raft versus host disease GVHD）的發(fā)生，源于胚胎干細(xì)胞的造血祖細(xì)胞不能包含成熟T細(xì)胞,。但通常這種方法需要用照射或細(xì)胞細(xì)胞毒性藥物達(dá)到脊髓抑制的目的,，所以嵌合造血細(xì)胞的主要的適用范圍將是需要脊髓抑制治療的病人。
Frandrich的最近一項研究,，增加了從植入前胚胎培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞對供體特異耐受的可能性,，如骨髓細(xì)胞。他發(fā)現(xiàn)在小鼠靜脈注入MHC完全不匹配的未分化細(xì)胞,，沒有任何其他的人為條件下,，鼠胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞系（RESC）能形成穩(wěn)定的嵌和細(xì)胞系。驚奇的是細(xì)胞分化為單核細(xì)胞和B細(xì)胞后可以接受具有同樣血統(tǒng)小鼠的心臟移植,，而不是不同血統(tǒng),。作者認(rèn)為細(xì)胞注入體內(nèi)后并不立即發(fā)生排斥是因為它們不表達(dá)MHC-Ⅱ和共刺激因子，宿主T淋巴細(xì)胞并沒有被激活,。由于它們表達(dá)FasL,，移植細(xì)胞可被宿主淋巴細(xì)胞保護(hù)。 HESCs能否以同樣的方式獲得免疫耐受呢,？由于可能形成畸胎瘤,，注入未分化的HESCs存在高度危險，而RESC還沒有發(fā)現(xiàn)這種情況,。我們也沒有跡象表明HESCs能像RESC那樣在體內(nèi)將會分化和執(zhí)行胸腺APCs細(xì)胞的功能,，即對宿主產(chǎn)生特異免疫耐受。因此,，關(guān)于HESCs這方面的潛能還不清楚,。

制造一種通用的細(xì)胞：
構(gòu)建一種能夠移植入每一個人的通用細(xì)胞系是再生醫(yī)學(xué)的首要目標(biāo)。一種方法是減少MHC分子的表達(dá),，例如敲除MHC-Ⅰ分子呈遞所必需的β2-微球蛋白基因,。HESCs不表達(dá)MHC-Ⅱ，除非HESCs朝向造血細(xì)胞分化了,，否則這樣的細(xì)胞系是沒有MHC分子的表達(dá),，因此可以減少異源性T細(xì)胞的免疫源性。然而值得注意的是把敲除MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ基因的小鼠的移植組織植入同種異體的宿主仍然可能發(fā)生排斥,，其機(jī)制可能是通過T淋巴細(xì)胞依賴機(jī)制,。明顯在這些情況下，殘余MHC的表達(dá)足夠誘發(fā)異源性T細(xì)胞的增殖,，而且低水平的MHC表達(dá)也能誘導(dǎo)NK細(xì)胞殺傷。因為分化的HESCs不表達(dá)阻抑NK的配體,，敲除β2-微球蛋白基因的細(xì)胞不能致敏NK介導(dǎo)的殺傷,。然而,，T細(xì)胞對于分化HESCs的反應(yīng)仍然不清楚。
相應(yīng)地,，通過利用免疫特異部位的自然選擇機(jī)制也能構(gòu)造通用的HESCs細(xì)胞,，免疫特異部位的一種標(biāo)志FasL，它的表達(dá)可以誘導(dǎo)表達(dá)Fas的T細(xì)胞凋亡,。最近采用異位FasL的表達(dá)保護(hù)移植物的方法產(chǎn)生了有爭議的結(jié)果,。如在移植部位附近有Fas的表達(dá)，移植的心臟或胰腺表達(dá)FasL會加速其排斥,；而在肝,，腎，肺,，血管和胸FasL的表達(dá)會降低同種異體移植的免疫反應(yīng),，因此FasL的表達(dá)保護(hù)HESCs遭到排斥，一個主要的并發(fā)癥是移植細(xì)胞表達(dá)Fas,，會使有FasL的細(xì)胞遭受破壞,。

結(jié)論：
相對于只有很少的可利用的移植器官，HESCs被認(rèn)為有望成為再生醫(yī)學(xué)最終選擇的細(xì)胞資源,。為了了解其潛能,，檢測這些細(xì)胞與病人不向匹配時發(fā)生的免疫反應(yīng)是十分必要的。激活排斥反應(yīng)最主要的是MHC分子,，HESCs是低水平表達(dá)MHC-Ⅰ分子,，在分化和用IFN誘導(dǎo)時表達(dá)水平上調(diào)。由于免疫系統(tǒng)對非己的識別造成對HESCs衍生物的排斥,，使這些細(xì)胞對于臨床的應(yīng)用構(gòu)成障礙,。為了解決排斥反應(yīng)，可植入限制免疫排斥的免疫特異部位或構(gòu)建HLA表型的HESCs細(xì)胞系庫,。通過體細(xì)胞核移植或孤雌生殖產(chǎn)生同基因細(xì)胞系也是好辦法,，但在廣泛應(yīng)用前許多技術(shù)或倫理問題必須解決。其它的方法還包括對造血祖細(xì)胞誘導(dǎo)其免疫耐受和用遺傳操縱的方法構(gòu)建一種通用的細(xì)胞系,。