生物谷報道：單克隆抗體在世界醫(yī)藥市場異軍突起,，已成為世界生物工程制藥業(yè)的支柱產品之一,。隨著日漸增多的新型單抗治療劑進入市場，單克隆抗體的第二輪開發(fā)也正在成為國際生物醫(yī)藥領域的熱點,，預計今后幾年單克隆抗體將發(fā)展成為一大類獨立醫(yī)藥產品,。未來，鼠源性單克隆抗體將逐漸被人源化抗體所替代,，其主要原因是：鼠源性單克隆抗體與人補體成分結合能力低,，CDC作用相應較弱，對腫瘤細胞的殺傷能力較弱,；它與NK等免疫細胞表面Fc受體親和力弱,，介導的ADCC作用較弱；鼠源抗體在人血循環(huán)中的半衰期短,，它發(fā)揮ADCC與CDC作用的時間較短；鼠單克隆抗體具有免疫原性,，宿主易產生抗抗體引起過敏反應,。

    1．鼠抗體人源化的構建方法

    鼠抗體的人源化改造主要方法包括嵌合抗體、表面重塑抗體,、重構抗體,。

    嵌合抗體：利用DNA重組技術將鼠單抗的輕、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū)的表達載體中,，轉化哺乳動物細胞表達出人鼠嵌合抗體,，其人源化程度達到70%左右，完整地保留了異源單抗的可變區(qū),，最大限度地保持了其親和活性,，降低了免疫原性。但由于人鼠嵌合抗體仍然保留了30%的鼠源性,，可誘發(fā)人抗小鼠反應HAMA,。

    表面重塑抗體：對鼠抗體表面氨基酸殘基進行人源化改造,。該方法的原則是僅替換與人抗體SAR差別明顯的區(qū)域，在維持抗體活性并兼顧減少異源性基礎上選用與人抗體表面殘基相似的氨基酸替換,；另外,，所替換的區(qū)段不應過多，對于影響側鏈大小,、電荷,、疏水性，或可能形成氫鍵從而影響到抗體互補決定區(qū)（CDR）構象的殘基盡量不替換,。

    重構抗體：由異源抗體中與抗原結合相關的殘基與人抗體重新拼接構建的,，包括CDR區(qū)移植，部分CDR移植和特定決定區(qū)（SDR）轉移,。

    2．全人源化抗體

    完全人抗體的形成始于二十世紀九十年代,，目前獲得全人源化抗體方法有抗體庫篩選技術、基因工程小鼠制備全人抗體,、轉染色體牛,。

    2.1 抗體庫篩選技術

    抗體庫篩選技術主要包括噬菌體抗體庫和核糖體展示技術。

    噬菌體抗體庫技術：從免疫或未被免疫的B細胞中分離抗體可變區(qū)基因,；PCR 擴增抗體全套基因片段(如VH,、VL)，將體外擴增的VH,、VL 基因片段隨機克隆入相應載體,，形成組合文庫；將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因Ⅲ(g3) 或基因Ⅷ(g8) 的先導系列的緊靠下游,，使外源基因表達的多肽以融合蛋白的形式展示在外殼蛋白gp Ⅲ或gp Ⅷ的N 端,。用固相化抗原經“親和結合—洗脫—擴增”數(shù)個循環(huán)直接、方便,、簡捷,、高效地篩選出表達特異性好、親和力強的抗體噬菌體庫,。

    核糖體展示技術：將基因型和表型聯(lián)系在一起,，編碼蛋白的DNA在體外進行轉錄與翻譯，由于對DNA進行了特殊的加工與修飾,，如,，去掉3′末端終止密碼子，核糖體翻譯到mRNA末端時,，由于缺乏終止密碼子,，停留在mRNA 的3′末端不脫離，從而形成蛋白質-核糖-2mRNA 三聚體，將目標蛋白特異性的配基固相化,，如：固定在ELISA 微孔或磁珠表面,，含有目標蛋白的核糖體三聚體就可在ELISA 板孔中或磁珠上被篩選出，對篩選分離得到的復合物進行分解,，釋放出的mRNA 進行逆轉錄酶鏈聚合反應(RT-PCR),， PCR產物進入下一輪循環(huán)，經過多次循環(huán),，最終可使目標蛋白和其編碼的基因序列得到富集和分離,。

    2.2 基因工程小鼠制備全人抗體

    制備全人抗體的基因工程小鼠包括人外周血淋巴細胞-嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠（hu-PBL-SCID小鼠）、轉基因小鼠和轉染色體小鼠制備人抗體技術,。

    Hu-PBL-SCID小鼠是將已產生一定免疫反應的供者或癌癥患者的人的外周血淋巴細胞移植于嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(SCID),，經抗原免疫后可獲得人源抗體。

    轉基因小鼠：將人抗體生產基因轉入小鼠,，以替換小鼠的抗體生成基因,。轉基因小鼠制備人抗體的優(yōu)點是，其功效優(yōu)于其它生產抗人體蛋白單抗技術,。不足之處：(1)轉基因通常有體細胞突變和其它獨特的序列,，導致不十分完全的人序列；(2)由于抗體是在小鼠體內裝配,，因而產生的單抗具有鼠糖基化模式,，所以這些單抗最終并不是全人的；(3)轉基因小鼠表達的人Ig多樣性較少,，而且在同一小鼠中不能夠產生IgG各亞類,。

    轉染色體小鼠：通過微細胞介導法（MMCT方法）將人14號染色體上產生IgH 的胚系片段和2號染色體上5～50 Mb 的κ輕鏈片段轉染到ES細胞，獲得小鼠經人血清白蛋白免疫之后,，可產生抗人血清白蛋白的人Ig,，再次免疫后IgM產生。由轉染色體技術得到的小鼠,，表達的人IgG各亞類的量與人血清中表達的IgG各亞類類同,，且可同時在一個轉基因小鼠內表達；但是,，轉染色體小鼠導入的人Ig 片斷雖然比較大，但其表達的人Ig量卻比較低,。

    2.3 轉染色體牛

    產生人Ig 轉染色體牛的構建過程仍舊利用MMCT法,，將構建的含有人Ig 輕重鏈基因片段的人人工染色體(HAC)，導入牛胚胎成纖維細胞,，進一步發(fā)育成轉染色體牛,。產生人Ig 轉染色體牛的構建特點在于：(1)由于牛胚胎干細胞不能成功建系， 因此將人人工染色體導入牛胚胎成纖維細胞,；(2)轉染色體牛用核移植的方法來建立,；(3)由于牛胚胎成纖維細胞僅能夠存活35代,，含有人HAC 的微細胞與牛胚胎成纖維細胞融合后，牛胎兒成纖維細胞只能再存活7d,，因此必須經過2次篩選,，確保HAC在轉染色體牛體內的高存留率。轉染色體牛生產人多抗,，可以在短時間內大量獲得,，所以，轉染色體牛獲得的人多抗可以在一定程度上彌補轉染色體小鼠的不足,，應付突發(fā)事件的發(fā)生（http://www.bioon.com/）,。