生物谷報道：單克隆抗體在世界醫(yī)藥市場異軍突起,，已成為世界生物工程制藥業(yè)的支柱產(chǎn)品之一。隨著日漸增多的新型單抗治療劑進入市場,，單克隆抗體的第二輪開發(fā)也正在成為國際生物醫(yī)藥領(lǐng)域的熱點,，預(yù)計今后幾年單克隆抗體將發(fā)展成為一大類獨立醫(yī)藥產(chǎn)品。未來,，鼠源性單克隆抗體將逐漸被人源化抗體所替代,，其主要原因是：鼠源性單克隆抗體與人補體成分結(jié)合能力低，CDC作用相應(yīng)較弱,，對腫瘤細胞的殺傷能力較弱,；它與NK等免疫細胞表面Fc受體親和力弱，介導(dǎo)的ADCC作用較弱,；鼠源抗體在人血循環(huán)中的半衰期短,，它發(fā)揮ADCC與CDC作用的時間較短,；鼠單克隆抗體具有免疫原性，宿主易產(chǎn)生抗抗體引起過敏反應(yīng),。

    1．鼠抗體人源化的構(gòu)建方法

    鼠抗體的人源化改造主要方法包括嵌合抗體,、表面重塑抗體、重構(gòu)抗體,。

    嵌合抗體：利用DNA重組技術(shù)將鼠單抗的輕,、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū)的表達載體中，轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞表達出人鼠嵌合抗體,，其人源化程度達到70%左右,，完整地保留了異源單抗的可變區(qū)，最大限度地保持了其親和活性,，降低了免疫原性,。但由于人鼠嵌合抗體仍然保留了30%的鼠源性，可誘發(fā)人抗小鼠反應(yīng)HAMA,。

    表面重塑抗體：對鼠抗體表面氨基酸殘基進行人源化改造。該方法的原則是僅替換與人抗體SAR差別明顯的區(qū)域,，在維持抗體活性并兼顧減少異源性基礎(chǔ)上選用與人抗體表面殘基相似的氨基酸替換；另外,，所替換的區(qū)段不應(yīng)過多,，對于影響側(cè)鏈大小、電荷,、疏水性，或可能形成氫鍵從而影響到抗體互補決定區(qū)（CDR）構(gòu)象的殘基盡量不替換,。

    重構(gòu)抗體：由異源抗體中與抗原結(jié)合相關(guān)的殘基與人抗體重新拼接構(gòu)建的，包括CDR區(qū)移植，部分CDR移植和特定決定區(qū)（SDR）轉(zhuǎn)移,。

    2．全人源化抗體

    完全人抗體的形成始于二十世紀(jì)九十年代，目前獲得全人源化抗體方法有抗體庫篩選技術(shù),、基因工程小鼠制備全人抗體,、轉(zhuǎn)染色體牛,。

    2.1 抗體庫篩選技術(shù)

    抗體庫篩選技術(shù)主要包括噬菌體抗體庫和核糖體展示技術(shù),。

    噬菌體抗體庫技術(shù)：從免疫或未被免疫的B細胞中分離抗體可變區(qū)基因,；PCR 擴增抗體全套基因片段(如VH、VL),，將體外擴增的VH、VL 基因片段隨機克隆入相應(yīng)載體,，形成組合文庫；將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因Ⅲ(g3) 或基因Ⅷ(g8) 的先導(dǎo)系列的緊靠下游,，使外源基因表達的多肽以融合蛋白的形式展示在外殼蛋白gp Ⅲ或gp Ⅷ的N 端。用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合—洗脫—擴增”數(shù)個循環(huán)直接,、方便,、簡捷,、高效地篩選出表達特異性好,、親和力強的抗體噬菌體庫,。

    核糖體展示技術(shù)：將基因型和表型聯(lián)系在一起，編碼蛋白的DNA在體外進行轉(zhuǎn)錄與翻譯,，由于對DNA進行了特殊的加工與修飾,，如，去掉3′末端終止密碼子,，核糖體翻譯到mRNA末端時，由于缺乏終止密碼子,，停留在mRNA 的3′末端不脫離,，從而形成蛋白質(zhì)-核糖-2mRNA 三聚體，將目標(biāo)蛋白特異性的配基固相化,，如：固定在ELISA 微孔或磁珠表面,，含有目標(biāo)蛋白的核糖體三聚體就可在ELISA 板孔中或磁珠上被篩選出,，對篩選分離得到的復(fù)合物進行分解，釋放出的mRNA 進行逆轉(zhuǎn)錄酶鏈聚合反應(yīng)(RT-PCR),， PCR產(chǎn)物進入下一輪循環(huán),，經(jīng)過多次循環(huán)，最終可使目標(biāo)蛋白和其編碼的基因序列得到富集和分離,。

    2.2 基因工程小鼠制備全人抗體

    制備全人抗體的基因工程小鼠包括人外周血淋巴細胞-嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠（hu-PBL-SCID小鼠）,、轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)染色體小鼠制備人抗體技術(shù),。

    Hu-PBL-SCID小鼠是將已產(chǎn)生一定免疫反應(yīng)的供者或癌癥患者的人的外周血淋巴細胞移植于嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(SCID),，經(jīng)抗原免疫后可獲得人源抗體,。

    轉(zhuǎn)基因小鼠：將人抗體生產(chǎn)基因轉(zhuǎn)入小鼠，以替換小鼠的抗體生成基因,。轉(zhuǎn)基因小鼠制備人抗體的優(yōu)點是，其功效優(yōu)于其它生產(chǎn)抗人體蛋白單抗技術(shù),。不足之處：(1)轉(zhuǎn)基因通常有體細胞突變和其它獨特的序列,，導(dǎo)致不十分完全的人序列；(2)由于抗體是在小鼠體內(nèi)裝配,，因而產(chǎn)生的單抗具有鼠糖基化模式，所以這些單抗最終并不是全人的,；(3)轉(zhuǎn)基因小鼠表達的人Ig多樣性較少,，而且在同一小鼠中不能夠產(chǎn)生IgG各亞類,。

    轉(zhuǎn)染色體小鼠：通過微細胞介導(dǎo)法（MMCT方法）將人14號染色體上產(chǎn)生IgH 的胚系片段和2號染色體上5～50 Mb 的κ輕鏈片段轉(zhuǎn)染到ES細胞，獲得小鼠經(jīng)人血清白蛋白免疫之后,，可產(chǎn)生抗人血清白蛋白的人Ig,，再次免疫后IgM產(chǎn)生。由轉(zhuǎn)染色體技術(shù)得到的小鼠,，表達的人IgG各亞類的量與人血清中表達的IgG各亞類類同,，且可同時在一個轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)表達；但是,，轉(zhuǎn)染色體小鼠導(dǎo)入的人Ig 片斷雖然比較大,，但其表達的人Ig量卻比較低。

    2.3 轉(zhuǎn)染色體牛

    產(chǎn)生人Ig 轉(zhuǎn)染色體牛的構(gòu)建過程仍舊利用MMCT法,，將構(gòu)建的含有人Ig 輕重鏈基因片段的人人工染色體(HAC),，導(dǎo)入牛胚胎成纖維細胞，進一步發(fā)育成轉(zhuǎn)染色體牛,。產(chǎn)生人Ig 轉(zhuǎn)染色體牛的構(gòu)建特點在于：(1)由于牛胚胎干細胞不能成功建系,， 因此將人人工染色體導(dǎo)入牛胚胎成纖維細胞；(2)轉(zhuǎn)染色體牛用核移植的方法來建立,；(3)由于牛胚胎成纖維細胞僅能夠存活35代,，含有人HAC 的微細胞與牛胚胎成纖維細胞融合后，牛胎兒成纖維細胞只能再存活7d，因此必須經(jīng)過2次篩選,，確保HAC在轉(zhuǎn)染色體牛體內(nèi)的高存留率,。轉(zhuǎn)染色體牛生產(chǎn)人多抗，可以在短時間內(nèi)大量獲得,，所以,，轉(zhuǎn)染色體牛獲得的人多抗可以在一定程度上彌補轉(zhuǎn)染色體小鼠的不足，應(yīng)付突發(fā)事件的發(fā)生（http://www.bioon.com/）,。