生物谷報(bào)道：?jiǎn)慰寺】贵w在世界醫(yī)藥市場(chǎng)異軍突起,，已成為世界生物工程制藥業(yè)的支柱產(chǎn)品之一,。隨著日漸增多的新型單抗治療劑進(jìn)入市場(chǎng)，單克隆抗體的第二輪開(kāi)發(fā)也正在成為國(guó)際生物醫(yī)藥領(lǐng)域的熱點(diǎn),，預(yù)計(jì)今后幾年單克隆抗體將發(fā)展成為一大類獨(dú)立醫(yī)藥產(chǎn)品,。未來(lái)，鼠源性單克隆抗體將逐漸被人源化抗體所替代,，其主要原因是：鼠源性單克隆抗體與人補(bǔ)體成分結(jié)合能力低,，CDC作用相應(yīng)較弱，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力較弱,；它與NK等免疫細(xì)胞表面Fc受體親和力弱,，介導(dǎo)的ADCC作用較弱,；鼠源抗體在人血循環(huán)中的半衰期短，它發(fā)揮ADCC與CDC作用的時(shí)間較短,；鼠單克隆抗體具有免疫原性,，宿主易產(chǎn)生抗抗體引起過(guò)敏反應(yīng)。
1．鼠抗體人源化的構(gòu)建方法
鼠抗體的人源化改造主要方法包括嵌合抗體,、表面重塑抗體,、重構(gòu)抗體。
嵌合抗體：利用DNA重組技術(shù)將鼠單抗的輕,、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體中,，轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)出人鼠嵌合抗體，其人源化程度達(dá)到70%左右,，完整地保留了異源單抗的可變區(qū),，最大限度地保持了其親和活性，降低了免疫原性,。但由于人鼠嵌合抗體仍然保留了30%的鼠源性,，可誘發(fā)人抗小鼠反應(yīng)HAMA。
表面重塑抗體：對(duì)鼠抗體表面氨基酸殘基進(jìn)行人源化改造,。該方法的原則是僅替換與人抗體SAR差別明顯的區(qū)域,，在維持抗體活性并兼顧減少異源性基礎(chǔ)上選用與人抗體表面殘基相似的氨基酸替換；另外,，所替換的區(qū)段不應(yīng)過(guò)多,，對(duì)于影響側(cè)鏈大小、電荷,、疏水性,，或可能形成氫鍵從而影響到抗體互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）構(gòu)象的殘基盡量不替換。
重構(gòu)抗體：由異源抗體中與抗原結(jié)合相關(guān)的殘基與人抗體重新拼接構(gòu)建的,，包括CDR區(qū)移植,，部分CDR移植和特定決定區(qū)（SDR）轉(zhuǎn)移。
2．全人源化抗體
完全人抗體的形成始于二十世紀(jì)九十年代,，目前獲得全人源化抗體方法有抗體庫(kù)篩選技術(shù),、基因工程小鼠制備全人抗體、轉(zhuǎn)染色體牛,。
2.1 抗體庫(kù)篩選技術(shù)
抗體庫(kù)篩選技術(shù)主要包括噬菌體抗體庫(kù)和核糖體展示技術(shù),。
噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)：從免疫或未被免疫的B細(xì)胞中分離抗體可變區(qū)基因；PCR 擴(kuò)增抗體全套基因片段(如VH,、VL),，將體外擴(kuò)增的VH、VL 基因片段隨機(jī)克隆入相應(yīng)載體,，形成組合文庫(kù),；將基因組合文庫(kù)插入噬菌體編碼膜蛋白的基因Ⅲ(g3) 或基因Ⅷ(g8) 的先導(dǎo)系列的緊靠下游,，使外源基因表達(dá)的多肽以融合蛋白的形式展示在外殼蛋白gp Ⅲ或gp Ⅷ的N 端。用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合—洗脫—擴(kuò)增”數(shù)個(gè)循環(huán)直接,、方便,、簡(jiǎn)捷、高效地篩選出表達(dá)特異性好,、親和力強(qiáng)的抗體噬菌體庫(kù),。
核糖體展示技術(shù)：將基因型和表型聯(lián)系在一起，編碼蛋白的DNA在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄與翻譯,，由于對(duì)DNA進(jìn)行了特殊的加工與修飾,，如，去掉3′末端終止密碼子,，核糖體翻譯到mRNA末端時(shí)，由于缺乏終止密碼子,，停留在mRNA 的3′末端不脫離,，從而形成蛋白質(zhì)-核糖-2mRNA 三聚體，將目標(biāo)蛋白特異性的配基固相化,，如：固定在ELISA 微孔或磁珠表面,，含有目標(biāo)蛋白的核糖體三聚體就可在ELISA 板孔中或磁珠上被篩選出，對(duì)篩選分離得到的復(fù)合物進(jìn)行分解,，釋放出的mRNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶鏈聚合反應(yīng)(RT-PCR),， PCR產(chǎn)物進(jìn)入下一輪循環(huán)，經(jīng)過(guò)多次循環(huán),，最終可使目標(biāo)蛋白和其編碼的基因序列得到富集和分離,。
2.2 基因工程小鼠制備全人抗體
制備全人抗體的基因工程小鼠包括人外周血淋巴細(xì)胞-嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠（hu-PBL-SCID小鼠）、轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)染色體小鼠制備人抗體技術(shù),。
Hu-PBL-SCID小鼠是將已產(chǎn)生一定免疫反應(yīng)的供者或癌癥患者的人的外周血淋巴細(xì)胞移植于嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(SCID),，經(jīng)抗原免疫后可獲得人源抗體。
轉(zhuǎn)基因小鼠：將人抗體生產(chǎn)基因轉(zhuǎn)入小鼠,，以替換小鼠的抗體生成基因,。轉(zhuǎn)基因小鼠制備人抗體的優(yōu)點(diǎn)是，其功效優(yōu)于其它生產(chǎn)抗人體蛋白單抗技術(shù),。不足之處：(1)轉(zhuǎn)基因通常有體細(xì)胞突變和其它獨(dú)特的序列,，導(dǎo)致不十分完全的人序列；(2)由于抗體是在小鼠體內(nèi)裝配,，因而產(chǎn)生的單抗具有鼠糖基化模式,，所以這些單抗最終并不是全人的；(3)轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)的人Ig多樣性較少,，而且在同一小鼠中不能夠產(chǎn)生IgG各亞類,。
轉(zhuǎn)染色體小鼠：通過(guò)微細(xì)胞介導(dǎo)法（MMCT方法）將人14號(hào)染色體上產(chǎn)生IgH 的胚系片段和2號(hào)染色體上5～50 Mb 的κ輕鏈片段轉(zhuǎn)染到ES細(xì)胞,，獲得小鼠經(jīng)人血清白蛋白免疫之后，可產(chǎn)生抗人血清白蛋白的人Ig,，再次免疫后IgM產(chǎn)生,。由轉(zhuǎn)染色體技術(shù)得到的小鼠，表達(dá)的人IgG各亞類的量與人血清中表達(dá)的IgG各亞類類同,，且可同時(shí)在一個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)表達(dá),；但是，轉(zhuǎn)染色體小鼠導(dǎo)入的人Ig 片斷雖然比較大,，但其表達(dá)的人Ig量卻比較低,。
2.3 轉(zhuǎn)染色體牛
產(chǎn)生人Ig 轉(zhuǎn)染色體牛的構(gòu)建過(guò)程仍舊利用MMCT法，將構(gòu)建的含有人Ig 輕重鏈基因片段的人人工染色體(HAC),，導(dǎo)入牛胚胎成纖維細(xì)胞,，進(jìn)一步發(fā)育成轉(zhuǎn)染色體牛。產(chǎn)生人Ig 轉(zhuǎn)染色體牛的構(gòu)建特點(diǎn)在于：(1)由于牛胚胎干細(xì)胞不能成功建系,， 因此將人人工染色體導(dǎo)入牛胚胎成纖維細(xì)胞,；(2)轉(zhuǎn)染色體牛用核移植的方法來(lái)建立；(3)由于牛胚胎成纖維細(xì)胞僅能夠存活35代,，含有人HAC 的微細(xì)胞與牛胚胎成纖維細(xì)胞融合后,，牛胎兒成纖維細(xì)胞只能再存活7d，因此必須經(jīng)過(guò)2次篩選,，確保HAC在轉(zhuǎn)染色體牛體內(nèi)的高存留率,。轉(zhuǎn)染色體牛生產(chǎn)人多抗，可以在短時(shí)間內(nèi)大量獲得,，所以,，轉(zhuǎn)染色體牛獲得的人多抗可以在一定程度上彌補(bǔ)轉(zhuǎn)染色體小鼠的不足，應(yīng)付突發(fā)事件的發(fā)生（http://www.bioon.com/）,。
