結(jié)核病是世界上主要傳染病的死因,，特別是多重耐藥性結(jié)核病的暴發(fā)流行和嚴(yán)重危害性,，引起人們的重視。各國(guó)學(xué)者對(duì)結(jié)核桿菌的耐藥特征,，耐藥的分子機(jī)理及涉及基因等方面的問題進(jìn)行廣泛研究,，并且取得許多重大進(jìn)展。本文就這方面進(jìn)展作一綜述,。
目前,，一個(gè)突出問題是多重耐藥結(jié)核病(multiple-durg resistance tuberculosis，mdrtb)是指結(jié)核菌對(duì)2種或2種以上的抗結(jié)核藥產(chǎn)生耐藥性,。1990年以來美國(guó)疾病控制中心報(bào)道12起mdrtb的暴發(fā)流行,。200例4～16周內(nèi)死亡，死亡率高達(dá)72％～89％,。aids病人和hiv攜帶者更易感染mdrtb,，這引起人們對(duì)mdrtb的高度重視。隨著hiv感染的蔓延,，mdrtb已成了全球共同面臨的挑戰(zhàn)。近年來,，各國(guó)學(xué)者采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)結(jié)核桿菌耐藥機(jī)理進(jìn)行深入研究,，定位了結(jié)核桿菌耐藥基因的位置和基因突變位點(diǎn),，從而促進(jìn)了第一代快速鑒定耐藥突變菌株方法的建立和新型抗結(jié)核藥物的開發(fā)。本文就這方面進(jìn)展作一簡(jiǎn)介,。
■一,、結(jié)核桿菌的耐藥特征
細(xì)菌獲得耐藥性的方式大致有三種類型，即障礙機(jī)制(降低細(xì)胞膜的通透性和外排泵機(jī)制),，產(chǎn)生降解或滅活酶類(如：β-內(nèi)酰胺酶),，藥物靶位的改變(如：某個(gè)關(guān)鍵基因的突變)。細(xì)菌可通過外源性遺傳因子如質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子或者染色體自身而獲得耐藥特性,。結(jié)核桿菌與多數(shù)細(xì)菌相似，也是通過上述方式獲得耐性,。結(jié)核桿菌特有細(xì)胞壁降低多數(shù)藥物通透性,，結(jié)核桿菌產(chǎn)生諸如β-內(nèi)酰胺酶的降解酶類和其它藥特修飾酶。因此,，結(jié)核桿菌對(duì)常見抗生素天然耐藥,。但是，與其它人類致病菌最顯著差別在于結(jié)核桿菌不存在質(zhì)粒,，即無法通過質(zhì)粒的介導(dǎo)從其它細(xì)菌或分枝桿苗獲得耐藥性[1,2],。因此，染色體介導(dǎo)的耐藥性是結(jié)核桿菌產(chǎn)生耐藥的主要形式,，mdrtb的研究揭示染色體多個(gè)相互獨(dú)立基因自發(fā)突變的逐步累加是mdrtb耐藥的分子基礎(chǔ),。
■二、結(jié)核桿菌的分子耐藥機(jī)理
1. 異煙肼(isoniazid,，inh)
異煙肼通過抑制結(jié)核桿菌分枝菌酸的合成,，造成細(xì)胞壁破損而殺菌。inh的耐藥性與一個(gè)或多個(gè)基因的多種突變有關(guān),。這些基因包括編碼觸酶-過氧化物酶的katg基因,，編碼enoyl-acp還原酶的inha基因和編碼烷基-氫過氧化物還原酶的ahpc基因。katg基因和inha基因涉及分枝菌酸的生物合成,。ahpc基因涉及細(xì)菌對(duì)氧化壓力的反應(yīng),。結(jié)核桿菌攝取inh后，菌體內(nèi)觸酶-過氧化物酶氧化inh,，形成活性中間產(chǎn)物,，后者可抑制分枝分菌酸合成酶enoyl-acp還原酶，使分枝菌酸合成減少,。zhang等將katg基因克隆導(dǎo)入耐inh的恥垢分枝桿菌,，可恢復(fù)藥物敏感性[3]。臨床分離的約50％inh耐藥株,，katg基因存在點(diǎn)突變或缺失,，使觸酶-過氧化物酶的活性喪失,，導(dǎo)致無活性的inh中間產(chǎn)物產(chǎn)生。約25％inh耐藥株與inha基因的突變相關(guān),，多數(shù)突變?cè)斐蒳nha基因表達(dá)增強(qiáng),，從而增強(qiáng)相應(yīng)酶的數(shù)量，超過了藥物抑制作用,。最近發(fā)現(xiàn)約10％inh耐藥株中,，katg、inha基因完好,，ahpc基因有突變,，推測(cè)ahpc 基因編碼的酶與inh中間產(chǎn)物的解毒有關(guān)[4]。一般將ahpc突變作為katg基因損傷的標(biāo)志,。盡管如此,，依然有10％inh耐藥株的分子機(jī)理不清楚。
2. 利福平(rifampin,，rfp)
利福平為一種廣譜抗菌藥物,，它可與dna依賴的rna聚合酶的β亞單位結(jié)合，從而抑制mrna的轉(zhuǎn)錄,。幾乎所有的rfp耐藥的細(xì)菌,，都是由于編碼rna聚合酶β亞單位的rpob基因某個(gè)特定區(qū)域的突變，使之不再與rfp結(jié)合而耐藥,。結(jié)核桿菌也不例外,，臨床分離的97％以上的結(jié)核桿菌、麻風(fēng)桿菌和烏分枝菌rfp耐藥株,，它們r(jià)pob基因均有突變,。在rfp耐藥結(jié)核桿菌rpob基因中央附近69bp的高變區(qū)域內(nèi)，存在35種以上不同的錯(cuò)義突變,，其中絲氨酸531→亮氨酸(ser531→leu)和組氨酸526→酷氨酸(his526→tyr)的兩種突變最常見,，約占總突變65％以上[5]。13％rpob基因突變的rfp高度耐藥株仍對(duì)利福布丁(rifabutin)敏感,，提示可采用利福布丁治療某些rfp耐藥的結(jié)核病,。
3. 鏈霉素(srreptomycin，sm)
鏈霉素是抗結(jié)核治療中常用氨基糖甙類抗生素,。sm與結(jié)核病16s rrna結(jié)合,，干擾翻譯的準(zhǔn)確性，從而抑制蛋白質(zhì)的合成,。sm耐藥性與編碼核糖體的二部分基因突變有關(guān),，它們是編碼16s rrna的rrs基因和編碼s12蛋白的rpsl基因。rpsl基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸取代影響了16s rrna的高級(jí)結(jié)構(gòu)而攜帶sm的耐藥性。16s rrna結(jié)構(gòu)的改變破壞了16s rrna與sm的相互作用,，導(dǎo)致sm耐藥[6],。rpsl基因是主要突變位點(diǎn),，其中密碼子43最常見,，密碼子88較罕見。,。16s rrna分子的環(huán)狀結(jié)構(gòu)為次要突變點(diǎn),，即491，513,，516,，903核苷酸位點(diǎn)上[7]。臨床分離sm耐藥株中,，rpsl基因與rrs基因的突變頻率分別為50％和20％,。約1/3sm耐藥菌株的耐藥機(jī)理尚不清楚。
4. 乙胺丁醇(ethambutol,，emb)
乙胺丁醇的抗菌活性僅局限于分枝桿菌,，提示藥物靶位是一 種分枝桿菌特有的結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步研究證實(shí)乙胺丁醇可選擇性地抑制分枝桿菌細(xì)胞壁的重要結(jié)構(gòu)成分——阿拉伯半乳聚糖和脂阿拉伯甘露聚糖的生物合成,。最近鑒定了emb區(qū)域的一簇基因,，emb區(qū)域基因的表達(dá)增強(qiáng)造成了乙胺丁醇的耐藥性。初步研究顯示emb基因編碼多種合成細(xì)胞壁阿拉伯聚糖必須的酶類,，其中embab基因編碼阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶,，embab基因的突變或過度表達(dá)可導(dǎo)致持續(xù)合成阿拉伯聚糖而耐藥。50％emb耐藥株的embab基因發(fā)生突變[8],。突變位點(diǎn)和乙胺丁醇與emb蛋白作用特點(diǎn)正在研究中,。
5. 吡嗪酰胺(pyrazinamide，pza)
pza作用機(jī)制和耐藥分子機(jī)理尚不清楚,。一般認(rèn)為pza是通過在菌體內(nèi)被吡嗪酰胺酶轉(zhuǎn)化為吡嗪酸而發(fā)揮作用,。分析結(jié)核桿菌和牛分枝桿菌pza耐藥株，發(fā)現(xiàn)該酶活性顯著降低,，提示酶活性喪失與耐藥密切相關(guān),。scorpio等發(fā)現(xiàn)編碼吡嗪酰胺酶的pcna基因是造成結(jié)核桿菌pza耐藥的原因。對(duì)pza耐藥菌株的pcna基因突變,，吡嗪酰胺酶活性喪失,，使pza轉(zhuǎn)化為吡嗪酸減少而導(dǎo)致pza失效[9]。
6. 氟喹諾酮類(fluoroquinolones,，fq)
mdrtb的暴發(fā)流行使fq成為最主要的二線抗結(jié)核藥物,。fq在抗結(jié)核治療中的廣泛使用，導(dǎo)致fq耐藥菌株數(shù)量急劇增加,。fq耐藥機(jī)理極其復(fù)雜,，與耐藥發(fā)生有關(guān)因素包括(1)dna旋轉(zhuǎn)酶,，(2)拓?fù)洚悩?gòu)酶ⅳ，(3)細(xì)胞膜蛋白,，它通過介導(dǎo)藥物的通透性和外流來調(diào)節(jié)胞內(nèi)的藥物濃度,。多個(gè)基因突變逐步累加是獲得高度耐藥性的基礎(chǔ)。fq作用靶位是dna旋轉(zhuǎn)酶,，由gyra和gyrb基因編碼的2個(gè)a亞單位和2個(gè)b亞單位組成,。結(jié)核桿菌對(duì)fq的耐藥與gyra和gyrb基因突變有關(guān)。gyra基因多步突變的發(fā)生可推測(cè)結(jié)構(gòu)桿菌對(duì)環(huán)丙沙呈和其它fq高度耐藥,。gyrb基因的突變可能改變胞內(nèi)藥物的蓄積而呈現(xiàn)低度耐藥[10],。75％～94％fq耐藥結(jié)核菌的gyra基因有突變。最近發(fā)現(xiàn)的編碼結(jié)核桿菌細(xì)胞膜外排泵蛋白的lfra基因,，它編碼的蛋白可傳遞低度耐藥性[11],。
■三、結(jié)核桿菌耐藥基因的檢測(cè)方法
研究結(jié)核桿菌耐藥分子機(jī)理的重要目的之一是建立一套快速鑒定結(jié)核桿菌耐藥基因類型的方法,，了解結(jié)核病患者的耐藥狀況,，指導(dǎo)臨床的化療和防止耐藥菌體的播散。理論上,，耐藥基因的分析不需培養(yǎng)結(jié)核桿菌,，因此與傳統(tǒng)結(jié)核桿菌藥敏試驗(yàn)相比有諸多優(yōu)點(diǎn)，包括檢測(cè)時(shí)間從數(shù)周和數(shù)月縮短為幾天,；實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化,；降低實(shí)驗(yàn)室生物危險(xiǎn)性。耐藥檢測(cè)包括pcr擴(kuò)增基因組內(nèi)攜帶耐藥性區(qū)域,，然后擴(kuò)增產(chǎn)物的突變分析,，應(yīng)用于結(jié)核桿菌耐藥基因突變分析的技術(shù)較為成熟有直接測(cè)序法，單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(sscp)及固相雜交法,。
1. 直接測(cè)序法
耐藥區(qū)域pcr擴(kuò)增,，prc擴(kuò)增產(chǎn)物純化或克隆化取dna片段直接測(cè)序，與標(biāo)準(zhǔn)敏感菌株的同一dna片段比較,，分析堿基突變的位置和分布,。直接測(cè)序法是鑒定突變的黃金標(biāo)準(zhǔn)，但該操作繁瑣,，費(fèi)用昂貴限制了它的廣泛應(yīng)用,。kapur等應(yīng)用自動(dòng)化dna測(cè)序法分析128株臨床分離的結(jié)核桿菌rpob基因69bp區(qū)域的突變特征，證實(shí)90％以上rfp耐藥株rpob基因有堿基改變,，而且多數(shù)為錯(cuò)義突變[12],。altamirano等對(duì)9株異煙肼耐藥株及1株敏感株進(jìn)行研究，通過dna直接測(cè)序證實(shí)有8例(89％)存在突變，突變包括點(diǎn)突變,，1bp的缺失和3bp以內(nèi)的插入,。指出katg基因突變?cè)趇nh耐藥中占著比較重要地位[13]。
2. 聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(prc-sscp)
pcr-sscp是檢測(cè)單堿基置換和數(shù)堿基缺失或插入的可靠而簡(jiǎn)便方法,，比直接dna測(cè)序容易進(jìn)行,，而廣泛用作一種突變篩選方法。原理是單鏈核酸通過自身互補(bǔ)或分子內(nèi)的相互作用形成折迭構(gòu)象,，單個(gè)核苷酸的突變可造成其構(gòu)象改變,，從而導(dǎo)致其在非變性凝膠電泳上遷移速度的改變。telenti等采用pcr-sscp分析122株結(jié)核桿菌rpob基因中央?yún)^(qū)域157bp片段,，66株耐藥菌株中64株有突變。56株敏感株沒有突變,。結(jié)果顯示pcr-sscp能檢出單個(gè)堿基突變,，可作為檢測(cè)rfp耐藥株的快速篩選方法。作者用熒光素標(biāo)記pcr擴(kuò)增產(chǎn)物而建立自動(dòng)化sscp分析法,，可直接檢測(cè)痰涂片陽(yáng)性標(biāo)本和bactec陽(yáng)性培養(yǎng)物中的rfp耐藥菌株[14],。采用該技術(shù)，每天可檢測(cè)40份標(biāo)本,，因此適用于大量標(biāo)本的快速篩選,。作者采用自動(dòng)化pcr-sscp技術(shù)對(duì)來自mdrtb暴發(fā)流行中分離的結(jié)核桿菌耐藥性進(jìn)行分析，pcr-sscp檢測(cè)inh耐藥性的靈敏度為87％,，katg,，inha，katg-inha,，abpc和katg-abpc的突變率分別為36.8％,，31.6％，2.6％,，13.2％和2.6％[15],。說明自動(dòng)化pcr-sscp是大量標(biāo)本或多個(gè)靶基因分析的最佳方法。
3. 固相雜交法
探針雜交法是檢測(cè)耐藥基因突變的另一種快速簡(jiǎn)便篩選方法,。de beenhouwer等根據(jù)結(jié)核桿菌rfp耐藥ropb基因突變資料,，設(shè)計(jì)一組覆蓋69bp ropb高變區(qū)的寡核苷酸探針，包括結(jié)核桿菌探針一個(gè),，覆蓋69bp ropb高度區(qū)的野生型探針5個(gè),，ropb突變特異的探針4個(gè)。依次固定于尼龍膜上,，然后與待測(cè)菌株ropb基因擴(kuò)增片段進(jìn)行雜獢A根據(jù)雜交譜帶判斷有無突變及突變的類型,。因采用多個(gè)探針且固定于尼龍膜上形成多列，作者稱此方法為多列探針檢測(cè)法(line probe assay，lipa)[16],。該方法可快速鑒定結(jié)核桿菌rfp耐藥株ropb基因的突變,，適合于臨床標(biāo)本的直接檢測(cè)。現(xiàn)已有商品化lipa試劑盒,，該試劑盒檢測(cè)配藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果的符合率為90.2％[17],。
參考文獻(xiàn)
1 heym b,honore n,truffot-pernot c,et al.lancet,1994;344:293-298
2 martin c,ranes m,giequl b.plasmids,antibiotic resistance,and mobile elements in mycobacteria.in mefadden j(ed):moleclar biology of the mycobacteria.surrcy university press.1990;121-138
3 zhang y,garbe t,young d.mol microbiol,1993;8:521-524
4 wilson tm,clollins dm.mol microbiol,1996;19:1025-1034
5 musser jm.clin microbiol rev,1995;8:496-514
6 srecvatson s,pan x,stockbauer ke,et al.antimicrob agents chemother,1996;40:1024-1026
7 honore n,cole st.antimierob agents chemother,1994;38:238-242
8 belanger ae,beara gs,ford me,et al.proc natl acad sci usa,1996;21:1919-1924
9 scorpin a,zhang y.nature med,1996;2:662-667
10 takiff he,salazar l,guerrero c,et al.antimicrob agents chemother,1994;38:773-780
11 taakiff he,cimino m,musso cm,et al.natl acad sci usa,1996;96:362-366
12 kapur v,ling ling l,hamrick mr,et al.arch pathol lab med,1995;119:128-130
13 altamirano m,marostenmaki j,wang a,et al.j infect dis,1994;169:1162-1165
14 telenti a,imboden p,marchesi f,et al.antimicrob agents chemother,1993;37:2054-2058
15 telenti a,honore n,bernasconi c,et al.j clin micrbiol,1997;35:719-723
16 de beenhouwer h,lhiang z,jannes g,et al.tubercie lung dis,1995;76:425-430
17 cooksey rc,morlock gp,glickman s,et al.j clin microbiol,1997;35:1281-1283
