微生物學報Acta Microbiologica Sinica
48(3): 330~336; 4 March 2008
基金項目: 國家自然科學基金(30471292); 國家“863 計劃”(2006AA10A206)
*通訊作者,。Tel: +86-27-87286974; Fax: +86-27-87281795; E-mail: [email protected]
作者簡介: 趙戰(zhàn)勤(1980.), 男, 河南開封人, 博士研究生, 研究方向為細菌分子生物學和基因工程疫苗。E-mail: [email protected]
收稿日期: 2007-07-06; 修回日期: 2007-12-19
ISSN 0001-6209; CN11-1995/Q
趙戰(zhàn)勤, 薛云, 吳斌*, 湯細彪, 陳煥春, 李增強, 胡睿銘, 張建民, 段龍川
(華中農業(yè)大學動物醫(yī)學院, 農業(yè)微生物學國家重點實驗室, 武漢 430070)
摘要: 【目的】以豬源支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica, Bb)百日咳桿菌黏附素(PRN)基因的原核表達產(chǎn)物為抗原建立檢測PRN 抗體的間接ELISA 方法,。【方法和結果】利用谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)表達系統(tǒng)對PRN 基因在大腸桿菌中進行融合表達,。SDS-PAGE 和Western blot 檢測證實該基因獲得高效表達, 產(chǎn)物易于純化且具有良好的免疫學活性,。通過凝血酶酶切GST-PRN 并回收,獲得不含GST 載體蛋白的PRN 蛋白片段。以PRN 蛋白片段為抗原建立檢測天然PRN 抗體的間接ELISA 方法,。該方法對豬巴氏桿菌病等7 種常見細菌性疾病陽性血清的檢測結果均為陰性, 其敏感性比乳膠凝集試驗提高4～128 倍, 能檢測到人工感染14 d 后的仔豬血清抗體IgG, 對臨床送檢的1,229 份豬血清的檢測陽性率為32.7%,。ELISA 方法對陽性豬場的監(jiān)測結果預示了保育期仔豬的合群導致豬群大量感染支氣管敗血波氏桿菌。【結論】該方法具有特異性強,、敏感性高,、重復性好的特點,可用于豬群PRN 抗體水平監(jiān)測和豬波氏菌病流行病學調查。
關鍵詞: 支氣管敗血波氏桿菌; 百日咳桿菌黏附素; ELISA
中圖分類號: R392 文獻標識碼: A 文章編號: 0001-6209 (2008) 03-0330-07
支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)可引起豬發(fā)生肺炎和非進行性萎縮性鼻炎, 也是豬呼吸道疾病綜合癥的重要致病因子之一[1],。更重要的是, Bb 的先期感染易于導致其它多種細菌性和病毒性病原, 如多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multicida,Pm),、豬鏈球菌(Streptococcus suis, S. suis)、副豬嗜血桿菌(Haemophilus suis, HPS),、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory Syndromevirus, PRRSV),、豬流感病毒(Swine influenza virus,SIV)等的繼發(fā)感染, 從而提高豬群呼吸道疾病的發(fā)病率和嚴重程度, 造成較大損失[1-5]。近年來, 人們發(fā)現(xiàn)Bb 可經(jīng)動物傳染給人, 并在免疫功能缺陷或低下的人群(如AIDS 患者體內)形成嚴重感染, 因此引起高度關注[6],。目前, 針對豬波氏菌病診斷方法的報道很少, 主要是細菌學檢查,、血清學凝集試驗、PCR 檢測等方法[1],。細菌學檢查是通過從肺沖洗物,、尸檢肺組織及鼻分泌物中進行病原菌的分離、鑒定, 該方法的缺點是操作技術要求較高,、過程繁瑣,、花費時間長。而血清學凝集試驗和PCR 檢測方法常出現(xiàn)假陽性結果,。這是因為, 血清學凝集試驗以滅活Bb 菌體為檢測抗原, 該抗原易于和巴氏桿菌,、鏈球菌等的血清抗體發(fā)生交叉反應[7, 8]; PCR 方法雖然能夠檢測到Bb 的存在, 但作為一種呼吸道常在菌, Bb 的存在并不一定代表豬群已經(jīng)發(fā)生感染或者發(fā)病。因此, 這些方法在臨床診斷中并沒有得到廣泛使用,。目前急需一種特異,、敏感的豬波氏菌病診斷方法。Bb 具有O,、K 和H 抗原, 其毒力因子包括粘附素和毒素兩大類,。粘附素包括絲狀血凝素(filamentous hemagglutinin, FHA)、百日咳桿菌粘附素(pertactin,PRN),、菌毛(fimbriae) 等; 毒素包括皮膚壞死毒素(dermonecrotic toxin, DNT),、氣管細胞毒素(tracheal cytotoxin) 、腺苷環(huán)化酶溶血素(adenylate cyclase-hemolisin, AC-Hly)等[9],。這些毒力因子的表達與病原所處的環(huán)境具有緊密的相關性, 均由BvgA/S 雙因子調節(jié)系統(tǒng)調節(jié)表達,。PRN 是由prn 基因編碼的一種具有保護性的外膜蛋白成分, 是Bb 感染的重要黏附因子[9, 10]。在豬的感染試驗中, 發(fā)現(xiàn)不產(chǎn)生PRN 的Bb 菌株不能導致豬發(fā)生波氏菌病[11, 12], 且豬群的保護率與PRN 抗體水平呈線性關系 [10, 11, 13], 這就預示著可以通過檢測動物體內特異的PRN 抗體來診斷豬波氏桿菌病,。本研究利用谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)表達系統(tǒng)對prn 基因進行了原核表達, 并以表達產(chǎn)物為抗原初步建立了PRN 抗體的間接ELISA 檢測方法,。
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