微生物學(xué)報Acta Microbiologica Sinica
48(3): 330~336; 4 March 2008
基金項目: 國家自然科學(xué)基金(30471292); 國家“863 計劃”(2006AA10A206)
*通訊作者,。Tel: +86-27-87286974; Fax: +86-27-87281795; E-mail: [email protected]
作者簡介: 趙戰(zhàn)勤(1980.), 男, 河南開封人, 博士研究生, 研究方向為細(xì)菌分子生物學(xué)和基因工程疫苗,。E-mail: [email protected]
收稿日期: 2007-07-06; 修回日期: 2007-12-19
ISSN 0001-6209; CN11-1995/Q
趙戰(zhàn)勤, 薛云, 吳斌*, 湯細(xì)彪, 陳煥春, 李增強(qiáng), 胡睿銘, 張建民, 段龍川
(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室, 武漢 430070)
摘要: 【目的】以豬源支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica, Bb)百日咳桿菌黏附素(PRN)基因的原核表達(dá)產(chǎn)物為抗原建立檢測PRN 抗體的間接ELISA 方法,?！痉椒ê徒Y(jié)果】利用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)表達(dá)系統(tǒng)對PRN 基因在大腸桿菌中進(jìn)行融合表達(dá)。SDS-PAGE 和Western blot 檢測證實該基因獲得高效表達(dá), 產(chǎn)物易于純化且具有良好的免疫學(xué)活性,。通過凝血酶酶切GST-PRN 并回收,獲得不含GST 載體蛋白的PRN 蛋白片段,。以PRN 蛋白片段為抗原建立檢測天然PRN 抗體的間接ELISA 方法。該方法對豬巴氏桿菌病等7 種常見細(xì)菌性疾病陽性血清的檢測結(jié)果均為陰性, 其敏感性比乳膠凝集試驗提高4～128 倍, 能檢測到人工感染14 d 后的仔豬血清抗體IgG, 對臨床送檢的1,229 份豬血清的檢測陽性率為32.7%,。ELISA 方法對陽性豬場的監(jiān)測結(jié)果預(yù)示了保育期仔豬的合群導(dǎo)致豬群大量感染支氣管敗血波氏桿菌?！窘Y(jié)論】該方法具有特異性強(qiáng),、敏感性高、重復(fù)性好的特點,可用于豬群PRN 抗體水平監(jiān)測和豬波氏菌病流行病學(xué)調(diào)查,。
關(guān)鍵詞: 支氣管敗血波氏桿菌; 百日咳桿菌黏附素; ELISA
中圖分類號: R392 文獻(xiàn)標(biāo)識碼: A 文章編號: 0001-6209 (2008) 03-0330-07
支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)可引起豬發(fā)生肺炎和非進(jìn)行性萎縮性鼻炎, 也是豬呼吸道疾病綜合癥的重要致病因子之一[1],。更重要的是, Bb 的先期感染易于導(dǎo)致其它多種細(xì)菌性和病毒性病原, 如多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multicida,Pm)、豬鏈球菌(Streptococcus suis, S. suis),、副豬嗜血桿菌(Haemophilus suis, HPS),、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory Syndromevirus, PRRSV)、豬流感病毒(Swine influenza virus,SIV)等的繼發(fā)感染, 從而提高豬群呼吸道疾病的發(fā)病率和嚴(yán)重程度, 造成較大損失[1-5],。近年來, 人們發(fā)現(xiàn)Bb 可經(jīng)動物傳染給人, 并在免疫功能缺陷或低下的人群(如AIDS 患者體內(nèi))形成嚴(yán)重感染, 因此引起高度關(guān)注[6]。目前, 針對豬波氏菌病診斷方法的報道很少, 主要是細(xì)菌學(xué)檢查,、血清學(xué)凝集試驗,、PCR 檢測等方法[1]。細(xì)菌學(xué)檢查是通過從肺沖洗物,、尸檢肺組織及鼻分泌物中進(jìn)行病原菌的分離,、鑒定, 該方法的缺點是操作技術(shù)要求較高、過程繁瑣,、花費時間長,。而血清學(xué)凝集試驗和PCR 檢測方法常出現(xiàn)假陽性結(jié)果,。這是因為, 血清學(xué)凝集試驗以滅活Bb 菌體為檢測抗原, 該抗原易于和巴氏桿菌、鏈球菌等的血清抗體發(fā)生交叉反應(yīng)[7, 8]; PCR 方法雖然能夠檢測到Bb 的存在, 但作為一種呼吸道常在菌, Bb 的存在并不一定代表豬群已經(jīng)發(fā)生感染或者發(fā)病,。因此, 這些方法在臨床診斷中并沒有得到廣泛使用,。目前急需一種特異、敏感的豬波氏菌病診斷方法,。Bb 具有O,、K 和H 抗原, 其毒力因子包括粘附素和毒素兩大類。粘附素包括絲狀血凝素(filamentous hemagglutinin, FHA),、百日咳桿菌粘附素(pertactin,PRN),、菌毛(fimbriae) 等; 毒素包括皮膚壞死毒素(dermonecrotic toxin, DNT)、氣管細(xì)胞毒素(tracheal cytotoxin) ,、腺苷環(huán)化酶溶血素(adenylate cyclase-hemolisin, AC-Hly)等[9],。這些毒力因子的表達(dá)與病原所處的環(huán)境具有緊密的相關(guān)性, 均由BvgA/S 雙因子調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)節(jié)表達(dá)。PRN 是由prn 基因編碼的一種具有保護(hù)性的外膜蛋白成分, 是Bb 感染的重要黏附因子[9, 10],。在豬的感染試驗中, 發(fā)現(xiàn)不產(chǎn)生PRN 的Bb 菌株不能導(dǎo)致豬發(fā)生波氏菌病[11, 12], 且豬群的保護(hù)率與PRN 抗體水平呈線性關(guān)系 [10, 11, 13], 這就預(yù)示著可以通過檢測動物體內(nèi)特異的PRN 抗體來診斷豬波氏桿菌病,。本研究利用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)表達(dá)系統(tǒng)對prn 基因進(jìn)行了原核表達(dá), 并以表達(dá)產(chǎn)物為抗原初步建立了PRN 抗體的間接ELISA 檢測方法。
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