生物工程學報 Chin J Biotech 2008, March 25; 24(3): 381-386
journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061
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雞氨肽酶H 在大腸桿菌中的表達,、純化與部分酶學性質(zhì)分析
賴慶安1, 劉樹滔1, 盧菀華1, 陳莉1, Toshihide NISHIMURA2, 饒平凡1
1 福州大學生物科學與工程學院, 生物工程研究所, 福州 350001
2 Graduate School of Biosphere Science, Hiroshima University, Japan
摘 要: 氨肽酶H(Aminopeptidase H, APH))是生物組織內(nèi)一種常見的氨基內(nèi)肽酶, 但因為天然材料中含量很低, 基本無法深入研究其催化機理,、功能與結(jié)構(gòu)的關(guān)系及其在生物體內(nèi)的確切功能。從雞肝組織克隆了APH 的全基因序列, 并把該序列亞克隆到載體pET22b(+)上, 然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3), 構(gòu)建了APH 的表達菌株,。該菌株經(jīng)IPTG 誘導(dǎo), 在SDS-PAGE 上明顯出現(xiàn)一條與天然APH 理論分子量一致的新增蛋白帶, 該條帶的濃度隨著表達時間的延長逐漸加深; 6h 基本達到平衡, 此時重組蛋白占總蛋白的16.7%, 表達水平高達94.7 mg/L,。對表達產(chǎn)物進行了活性檢測、純化和酶學性質(zhì)分析, 發(fā)現(xiàn)重組蛋白在亞基構(gòu)成, 熱穩(wěn)定性, 最適pH 等方面與天然APH 基本相同, 據(jù)此可以確認表達產(chǎn)物確實是APH, 發(fā)酵液總活力達到1636 u/L,。這些結(jié)果為APH 的催化機理及其在生物體內(nèi)的功能的闡明奠定了重要的物質(zhì)基礎(chǔ),。
關(guān)鍵詞: 氨肽酶H(APH), 表達, 純化, 酶活
Expression in Escherichia coli, Purification and Enzymatic Properties of Chicken Aminopeptidase H
Qingan Lai1, Shutao Liu1, Wanhua Lu1, Li Chen1, Toshihide Nishimura2, and Pingfan Rao1
1 The Institute of Biotechnology in Fuzhou University, Fuzhou 350001, China
2 Graduate School of Biosphere Science, Hiroshima University, Japan
Abstract: Aminopeptidase H (APH) is an universally distributed aminoendopeptidase in the tissue of many organism. However, it is hard to investigate its mechanism underlying the catalysis and the function in cell. In this paper, the full DNA sequence of this enzyme was cloned from chicken liver, then subcloned to the vector pET22 b(+). The recombined vector was transformed into E. coli Rosetta(DE3), and the APH gene was expressed by the induction of IPTG. It was found the recombinant protein exhibited same molecular weight as authentic APH on SDS-PAGE analysis; the expression level increased with induction time and approached maximum of 94.7mg/L till 6 hours, which contained 16.7% of the total protein. Moreover, this recombinant protein showed similar properties of subunit composition, thermal stability and optimum pH with native APH, based on the enzymatic assay, purification and analysis of enzymological properties. Therefore, it is confirmed that APH was expressed in this prokaryote system with a high-level of 1636 u/L aminopeptidase activity. These results would help to elucidate the catalysis mechanism and biological function of APH by providing enough material.
Keywords: aminopeptidase H(APH), expression, purification, enzymological properties
氨肽酶H(Aminopeptidase H, APH))是廣泛分布在哺乳動物組織中的一種氨基內(nèi)肽酶(aminoendopeptidase),其重要特點是與組織蛋白酶H(cathepsin H)一樣同時具有氨肽酶和肽鏈內(nèi)切酶的活性。它最早發(fā)現(xiàn)于兔子骨骼肌中, 當時命名為水解酶H(hydrolase H)[1,2], 隨后Nishimura 等對其酶反應(yīng)方式進行了研究(1983)[3],。之后Nishimura, Rhyu 等對豬肉,、雞肉和牛肉中氨肽酶H 的部分性質(zhì)分別進行了表征[4.6]。這些研究說明APH 在動物肌肉中主要是作為肽鏈端解酶存在, 與其他水解酶協(xié)同作用, 水解各種小肽底物時起到互補的效果, 是影響宰后動物肌肉成熟過程中形成風味肽與自由氨基酸的主要水解酶之一[4.6],。其他的研究推測APH 對細胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)的成熟與降解起到一定的作用, 所以對體內(nèi)荷爾蒙水平的調(diào)節(jié),、細胞周期的控制等生理過程或者不可或缺[7,8];同時作為一種組織蛋白酶, 氨肽酶H 還可能參與了細胞凋亡以及腫瘤等病理過程[9,10]。對氨肽酶的研究多在發(fā)現(xiàn)新來源,、新蛋白上, 較少深入研究催化機理,、功能與結(jié)構(gòu)的關(guān)系及其在生物體內(nèi)的確切功能,。
H Adachi 等對該酶基因進行了克隆并在COS 細胞中進行了表達, 為朝這些方面的努力奠定了基礎(chǔ)[11], 但是表達水平極低, 無法最終滿足要求。所以, 本文嘗試在大腸桿菌中對該酶的基因進行表達, 并對表達產(chǎn)物進行純化,、表征,。因為原核生物表達系統(tǒng)的表達量大大高于天然來源的材料,容易獲得大量的重組蛋白質(zhì), 可望為進一步認識該蛋白的各種理化性質(zhì), 了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系, 以及實際應(yīng)用奠定良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。
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