微生物學(xué)通報 AUG 20, 2008, 35(8): 1171~1175
Microbiology 2008 by Institute of Microbiology, CAS
蔡 勇1 母 茜1 王肇悅2 張博潤2 晏本菊1*
(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院 雅安 625014)
(2. 中國科學(xué)院微生物研究所 北京 100101)
摘 要: 采用自克隆技術(shù), 破壞啤酒酵母工業(yè)菌株YSF31的ADH2基因, 在ADH2基因位點(diǎn)插入來源于YSF31的編碼γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的GSH1基因和銅抗性篩選標(biāo)記CUP1基因,。通過銅抗性篩選轉(zhuǎn)化子, 經(jīng)PCR和乙醇脫氫酶Ⅱ (ADHⅡ) 活性測定驗證, 獲得了1株啤酒酵母工程菌。10 P麥芽汁發(fā)酵實驗顯示, 自克隆菌株的乙醇脫氫酶Ⅱ活性是受體菌的65%, 谷胱甘肽含量比受體菌YSF31的高34%,。其他發(fā)酵指標(biāo)并沒有發(fā)生明顯改變,。由于DNA操作過程中沒有外源基因介入, 因此啤酒酵母工程菌為生物安全的自克隆菌株, 具有重要的應(yīng)用價值。
關(guān)鍵詞: 啤酒酵母工業(yè)菌株, 谷胱甘肽, 乙醇脫氫酶Ⅱ, 自克隆
Construction of Self-cloning Industrial Brewing Yeast with High-glutathione Production and Low-ADH II Enzyme Activity
CAI Yong1 MU Qian1 WANG Zhao-Yue2 ZHANG Bo-Run2 YAN Ben-Ju1*
(1. College of Life Sciences, Sichuan Agricultural University, Ya'an 625014)
(2. Institute of Microbiology, Chinese Academy of Science, Beijing 100101)
Abstract: Self-cloning strains of industrial brewing yeast were constructed by integrating Saccharomyces cerevisiae genes, γ-glutamylcysteine synthetase gene (GSH1) and copper resistant gene (CUP1) into the lo-cus of alcohol dehydrogenase II (ADH II) gene (ADH2). The self-cloning strains were selected for their re-sistance to CuSO4 and identified by PCR amplification. The results of ADH II and glutathione (GSH) assay from fermentation with the self-cloning strains in 500ml conical flask showed that ADH II activity decreased to 65% and GSH content was 1.3 fold compared with that of host yeasts. The self-cloning strains do not contain any heterologous DNA; they may be more acceptable to the public.
Keywords: Industrial brewing yeast, Glutathione, Alcohol dehydrogenase II, Self-cloning
乙醛(CH3CHO)是啤酒中主要的風(fēng)味物質(zhì)之一[1],。一般啤酒中的含量為5 mg/L~12 mg/L,。國外優(yōu)質(zhì)啤酒的乙醛含量多在3 mg/L以下。低濃度的乙醛使啤酒具有芳香味, 高濃度則產(chǎn)生像青草或者蘋果腐爛的味道[2],。乙醛含量已成為國內(nèi)啤酒風(fēng)味改良的瓶頸,。降低啤酒中乙醛的含量, 主要有兩種手段：一是通過對發(fā)酵工藝的改進(jìn)降低乙醛含量; 二是通過代謝工程, 修飾工業(yè)菌株的代謝途徑達(dá)到降低乙醛含量的目的。關(guān)于前者有大量的文獻(xiàn)報道, 但由于啤酒生產(chǎn)對發(fā)酵條件要求嚴(yán)格, 使此類工藝改進(jìn)很難在生產(chǎn)中應(yīng)用,。國內(nèi)外對啤酒酵母(Saccha- romyces cerevisiae)開展的代謝工程有大量報道, 但針對乙醛含量開展的代謝工程研究報道很少,。隨著對啤酒酵母中乙醛代謝途徑的揭示, 以及相關(guān)基因的克隆, 利用基因工程的手段對乙醛代謝過程進(jìn)行修飾已成為可能。
谷胱甘肽是三肽小分子, 具有抗氧化的功能, 對細(xì)胞有保護(hù)作用,。增加谷胱甘肽的含量可以提高啤酒的抗老化能力[3],。 -谷氨酰半胱氨酸合成酶基因GSH1所編碼的 -谷氨酰半胱氨酸合成酶是谷胱甘肽合成途徑中的限速步驟, 增強(qiáng)γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性可以達(dá)到增加谷胱甘肽含量的目的[4]。
在發(fā)酵后期, 發(fā)酵液中的葡萄糖不足的情況下, 啤酒酵母ADH2基因編碼的ADH II (alcohol dehy-drogenase II)催化乙醇脫氫生成乙醛, 乙醛氧化生成乙酸鹽進(jìn)入三羧酸循環(huán), 為酵母生長提供物質(zhì)和能量[5],。ADH2基因在這個代謝途徑中是個關(guān)鍵基因,。將基因GSH1通過同源重組插入到啤酒酵母的ADH2基因位點(diǎn), 成功構(gòu)建了1株低乙醇脫氫酶Ⅱ活性的抗老化啤酒酵母工程菌, 為構(gòu)建低乙醛的啤酒酵母工程菌提供一定的依據(jù)和基礎(chǔ)。
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