作者：唐佩弦

單位：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100039

　　一,、什么是造血干祖細(xì)胞最佳的移植物
　　造血干祖細(xì)胞移植(HSPCT)用于治療造血干祖細(xì)胞缺陷性血液病,、先天性免疫缺損、先天性貧血,、各類(lèi)自身免疫病等,，也用于實(shí)體瘤的治療,，是一種重要的生物治療或細(xì)胞治療。實(shí)際上,，不論來(lái)自骨髓,、臍帶血或動(dòng)員的外周血，移植物中含的不僅是造血干細(xì)胞,，還包括更多的早期造血祖細(xì)胞,，所謂“造血干細(xì)胞移植(HSCT)”實(shí)際上是造血干祖細(xì)胞移植(HSPCT)。這是當(dāng)前對(duì)“造血干細(xì)胞移植”含義嶄新的理解,。CD34＋細(xì)胞中90%以上是早期和晚期祖細(xì)胞,，干細(xì)胞只是很小一部分。CD34＋細(xì)胞移植更應(yīng)該是造血干祖細(xì)胞移植,。干細(xì)胞的生存必須依賴其周?chē)淖婕?xì)胞,、淋巴、巨噬,、成纖維,、內(nèi)皮和其它各類(lèi)間質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的微環(huán)境。祖細(xì)胞在移植后,，反映到外周血相的時(shí)間比干細(xì)胞早,，產(chǎn)生臨床效應(yīng)快。因此,，含有造血干細(xì)胞,、大量祖細(xì)胞的CD34＋細(xì)胞才是理想的移植物。作為造血干細(xì)胞臨床移植物決不是越純?cè)胶?。模擬天然的骨髓中各類(lèi)造血和間質(zhì)細(xì)胞組成的移植物可能是最佳的,。
　　二、究竟造血干細(xì)胞是CD34陽(yáng)性還是陰性?
　　近年來(lái)國(guó)際文獻(xiàn)中有些報(bào)告發(fā)現(xiàn)CD34/Lin陰性細(xì)胞具有長(zhǎng)期重建造血的活性,，引起了廣泛的注意,。從發(fā)育生物學(xué)觀點(diǎn)來(lái)看，CD34＋Lin-細(xì)胞來(lái)自CD34?Lin-的論點(diǎn)是合理可信的,。已定向發(fā)育為造血系統(tǒng)的干細(xì)胞(即造血干細(xì)胞)都來(lái)自尚未定向的胚胎中胚層干細(xì)胞,，所以CD34＋Lin-細(xì)胞起源于CD34-Lin-細(xì)胞。當(dāng)干細(xì)胞分化為各系的祖細(xì)胞,，出現(xiàn)髓/淋巴各系的專(zhuān)一性標(biāo)志,，如淋巴系的CD19/CD7，粒系的CD33/13,，紅系的CD71,，巨核系的CD41/61等等，統(tǒng)稱(chēng)為L(zhǎng)in陽(yáng)性,。當(dāng)各系祖細(xì)胞分化為形態(tài)可辨認(rèn)的骨髓各系原始和幼稚細(xì)胞時(shí),，CD34抗原標(biāo)志也消失,，成為CD34陰性Lin陽(yáng)性的細(xì)胞。所以,，CD34表面標(biāo)志從無(wú)到有,，又從有到無(wú)，是造血干祖細(xì)胞產(chǎn)生,、發(fā)育,、分化和成熟的過(guò)程。
　　有的作者提出“真正的干細(xì)胞都是CD34陰性,，而CD34陽(yáng)性細(xì)胞全是祖細(xì)胞”等否認(rèn)CD34＋細(xì)胞群中含有干細(xì)胞的論點(diǎn),，是缺乏科學(xué)根據(jù)的。多年來(lái),，全世界的血液學(xué)實(shí)驗(yàn)室和大量的臨床實(shí)踐已經(jīng)充分證明了：在CD34陽(yáng)性細(xì)胞群體中含有可以長(zhǎng)期重建髓系和淋巴系造血的干細(xì)胞及大量造血祖細(xì)胞,。CD34陽(yáng)性細(xì)胞已經(jīng)是公認(rèn)的理想的造血干祖細(xì)胞移植物。
　　三,、嵌合型重建造血與抗腫瘤免疫
　　造血干祖細(xì)胞移植后,，可能在宿主體內(nèi)形成供者與宿主兩種造血細(xì)胞的嵌合(D/R chimerism),即供者(D)的造血免疫細(xì)胞和宿主(R)的造血免疫細(xì)胞的嵌合而且又和宿主腫瘤細(xì)胞對(duì)持。這三者在同一宿主體內(nèi)持續(xù)保持共存,，必然有這兩種嵌合的異基因淋巴細(xì)胞既相爭(zhēng)又相容的平衡，這可能激活和增強(qiáng)這兩種淋巴細(xì)胞對(duì)宿主腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和監(jiān)控,，長(zhǎng)期地使腫瘤微小殘留病灶(minimal residual disease)不致擴(kuò)增和發(fā)展,，也就有效地制止腫瘤的臨床復(fù)發(fā)。這就是GvT(GvL)效應(yīng),。如果移植后在宿主體內(nèi)沒(méi)有嵌合型造血,，而是全供者型的造血重建(full-donor type reconstitution)，其產(chǎn)生對(duì)抗腫瘤的免疫效應(yīng)可能不如穩(wěn)定性嵌合型的強(qiáng),。
　　四,、臍帶血造血干祖細(xì)胞是嬰幼兒患者的最佳選擇
　　對(duì)嬰幼兒患者進(jìn)行造血干祖細(xì)胞移植的最優(yōu)選擇是未經(jīng)體外擴(kuò)增培養(yǎng)的、從臍帶血一次分離所得的,、含有豐富造血干祖細(xì)胞的單個(gè)核細(xì)胞,。嬰幼兒做臍帶血移植，由于臍帶血中缺乏免疫活性細(xì)胞又無(wú)腫瘤細(xì)胞的污染,，所以沒(méi)有必要用MACS二次分離純化的CD34＋細(xì)胞,。但體外擴(kuò)增祖細(xì)胞時(shí)不能用單個(gè)核細(xì)胞，必須用純化的CD34＋細(xì)胞,。
　　用胎盤(pán)臍帶血中的造血干祖細(xì)胞做移植,，有很多優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，容易得到,；無(wú)緣供者HLA可以1-3個(gè)位點(diǎn)不相合,，IV度GvHD發(fā)生率很低(＜5%),，使侯選的供者大大增加；臍帶血中的造血干祖細(xì)胞,，其重建造血和免疫的活力高于骨髓和外周血,；臍帶血中CD3＋細(xì)胞極少，CD8＋細(xì)胞更少,。國(guó)外已有臨床報(bào)告低溫保存至少15年后移植仍有效,，凍融后CD34＋細(xì)胞回收率80%。但是,，臍帶血容量小,，含有的造血干祖細(xì)胞數(shù)量太少。1999年9月Gluckman從臨床實(shí)踐中提出臍帶血移植有效劑量為單個(gè)核細(xì)胞3.7×107／kg,。低于這個(gè)劑量的,，植入率也低。不足1×107／kg的無(wú)一例植入,。一般一份臍帶血的單個(gè)核細(xì)胞總量?jī)H5-10×108,，只夠治療一個(gè)嬰兒或體重約20～30 kg的少兒。當(dāng)臍帶血移植的有效劑量被越來(lái)越多的學(xué)者所承認(rèn)之后,，臍帶血用于成人也越來(lái)越少,。一份臍帶血單個(gè)核細(xì)胞總量多達(dá)2×109，才可以用于一個(gè)50 kg體重的病人,。
　　 為了使臍帶血移植于成人,，人們探求在體外擴(kuò)增臍帶血CD34＋細(xì)胞，甚至期求干細(xì)胞也擴(kuò)增,。但大量研究報(bào)告的結(jié)果表明CD34＋祖細(xì)胞可幾十或幾百倍地?cái)U(kuò)增,，但無(wú)法實(shí)現(xiàn)真正的干細(xì)胞擴(kuò)增。少數(shù)作者誤把祖細(xì)胞的擴(kuò)增稱(chēng)為干細(xì)胞擴(kuò)增,。至今國(guó)際上還沒(méi)有一例用臍帶血CD34＋細(xì)胞擴(kuò)增后移植而在病人體內(nèi)移植物能維持6個(gè)月以上的報(bào)告,。有力地表明擴(kuò)增的是祖細(xì)胞，而不是干細(xì)胞,。擴(kuò)增的CD34＋細(xì)胞移植后,，即使在受者體內(nèi)長(zhǎng)期維持重建造血，也只能說(shuō)明移植物體外擴(kuò)增后仍含有干細(xì)胞,，也不能證明干細(xì)胞的擴(kuò)增,。
　　五、輸注的細(xì)胞劑量是移植成敗的關(guān)鍵
　　臨床的實(shí)踐證明：細(xì)胞劑量是臍帶血移植成功的關(guān)鍵,。美國(guó)Rubinstein認(rèn)為臍帶血有核細(xì)胞至少5.0×107/kg,，而法國(guó)Gluckman提出臍帶血有核細(xì)胞有效劑量為3.7×107／kg。筆者認(rèn)為3.3-5.0×107／kg有核細(xì)胞為臍帶血移植的有效劑量,；而1×108／kg是優(yōu)效劑量,。因?yàn)?×108個(gè)有核細(xì)胞中,，CD34＋細(xì)胞才可能達(dá)到106。在臨床選用供者時(shí),，要把細(xì)胞輸注劑量放在首位,。
　　Welte報(bào)告半相合的有緣供者移植給35例小兒白血病、NHL,，MDS等患者用G-CSF動(dòng)員后經(jīng)2次分離純化所得的大劑量(megadose)外周血CD34＋細(xì)胞2×107／kg移植,，移植物中含CD3＋細(xì)胞控制在2×104／kg以下，17/35存活,，16/35無(wú)病生存3-38個(gè)月,。平均第11 d中性粒細(xì)胞＞500,無(wú)一例發(fā)生明顯的GvHD。1999年歐洲好幾個(gè)國(guó)家都報(bào)告用大劑量CD34(＋)細(xì)胞即107／kg而CD3(+)控制在104／kg,，即使3個(gè)位點(diǎn)不合的無(wú)血緣供者,，竟也不出現(xiàn)GvHD，其植入率高,，血象回升也早,，這些不約而同而又令人振奮的臨床報(bào)告，給干細(xì)胞移植生物學(xué)和GVHD的發(fā)生機(jī)制,，提出一些值得研究的課題,。
　　所謂大劑量CD34＋細(xì)胞，其實(shí)主要是大劑量的祖細(xì)胞,。因?yàn)?，移植成功所需要的真正干?xì)胞不是很多的。而祖細(xì)胞的大劑量輸注一定會(huì)明顯地提前血象的回升,，提高干細(xì)胞的植入率,。
　　六,、HLA檢測(cè)分辨率的提高是開(kāi)展非血緣移植的保證
　　國(guó)外非血緣HLA 3個(gè)位點(diǎn)不合而移植成功的報(bào)告已經(jīng)不少,。在那些找不到HLA全相合的又急需做造血干祖細(xì)胞移植的病人，應(yīng)該慎重而積極地開(kāi)展無(wú)血緣HLA不全相合的移植(unrelated mismatched transplant),，努力追上和國(guó)際間的差距,，使更多的病人獲救。歐洲的統(tǒng)計(jì),，白血病非血緣臍帶血移植的病人中HLA 1個(gè)位點(diǎn)不合的占44%,，2個(gè)位點(diǎn)不合的40%，而全相合的僅9%,；歐洲白血病非血緣骨髓移植中全相合的占71%,，1位點(diǎn)不合的占26%，2個(gè)位點(diǎn)不合3%,。在應(yīng)用非血緣供者做造血干細(xì)胞移植的經(jīng)驗(yàn)方面,，我國(guó)和發(fā)達(dá)國(guó)家之間有很大的差距,。開(kāi)展非血緣HLA 1-2位點(diǎn)不合的移植，HLA配型的技術(shù)是成敗的關(guān)鍵,。國(guó)外HLA配型不論Ⅰ或Ⅱ類(lèi)抗原都已經(jīng)采用了探針做基因配型(genotyping),。然而，國(guó)內(nèi)目前多數(shù)還用表型配型(phenotyping)即血清學(xué)配型來(lái)檢測(cè)Ⅰ類(lèi)抗原,。近10年來(lái),，用DNA序列又新發(fā)現(xiàn)500多個(gè)等位基因(alleles)，而新發(fā)現(xiàn)的等位基因還不斷在增加,，使基因配型的分辨率和準(zhǔn)確率大大高于血清學(xué)配型,。同樣一對(duì)供者和受者樣品，用血清方法測(cè)出14%不相合,，而用分子探針?lè)蓽y(cè)出74%不相合,。這可以解釋我國(guó)一些‘全相合’的移植為什么竟會(huì)死于嚴(yán)重的GVHD?？傊?，基因配型的精確性大大超過(guò)血清配型。高精度的HLA配型無(wú)疑會(huì)顯著地提高非血緣不相合移植的成功率,。
　　七,、造血干祖細(xì)胞移植研究的新方向
　　造血干祖細(xì)胞以及構(gòu)成造血微環(huán)境的各類(lèi)間質(zhì)細(xì)胞都來(lái)自更早的胚胎干細(xì)胞或間葉干干細(xì)胞(mesenchyma stem cell, MSC)。發(fā)展組織工程新技術(shù),，可在體外誘導(dǎo)MSC分化為造血干祖細(xì)胞和各類(lèi)間質(zhì)細(xì)胞,，成為理想的重建造血的移植物。胚胎干細(xì)胞或間葉干細(xì)胞都是CD34陰性細(xì)胞,，而且Lin標(biāo)志也陰性,。目前有關(guān)CD34陰性細(xì)胞的研究，如果解決了CD34陰性細(xì)胞的純化技術(shù),，將使胚胎干細(xì)胞或間葉干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為造血干祖細(xì)胞和各類(lèi)間質(zhì)細(xì)胞的研究更快地獲得成功,。
　　造血干祖細(xì)胞移植研究另一個(gè)新的發(fā)展方向，是用造血干祖細(xì)胞做基因治療,。也就是用修飾過(guò)基因的造血干細(xì)胞進(jìn)行移植,。干細(xì)胞是治療基因在病人體內(nèi)永久表達(dá)的理想宿主細(xì)胞。祖細(xì)胞也可用來(lái)做短期表達(dá)治療基因的宿主細(xì)胞,。先天性單基因缺損的疾病,，糖尿病，高血壓病,，艾滋病,，帕金森病，自身免疫病和惡性腫瘤的基因治療都可以用造血干細(xì)胞做宿主細(xì)胞，在病人體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)所轉(zhuǎn)導(dǎo)的治療基因,。如果在造血祖細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入多藥耐藥基因,，便可以大大提高腫瘤的化療劑量。這類(lèi)基因治療,，應(yīng)該用造血祖細(xì)胞做宿主細(xì)胞,，而不是干細(xì)胞。因?yàn)楦杉?xì)胞大部分處于G0期,，對(duì)化療藥物并不敏感,。要保護(hù)的是祖細(xì)胞。又因?yàn)閏hemoprotoection也用不著長(zhǎng)期,，只要求化療期間短期的效應(yīng),。用造血干細(xì)胞做基因治療的研究，目前最大的困難是人類(lèi)造血干細(xì)胞的基因?qū)肼史浅５?。因?yàn)?，人的造血干?xì)胞表面缺乏裝載治療基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的受體。而且,，人的造血干細(xì)胞大部分處于G0靜止期,，用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體裝載的治療基因很難整合到靜止期細(xì)胞染色體的基因組中去。現(xiàn)在,，國(guó)外不少先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)室正在大力研究,。一旦這些難題得到解決，造血干細(xì)胞移植治療的適應(yīng)癥可以大大擴(kuò)展,；腫瘤的治療也會(huì)出現(xiàn)一個(gè)新的紀(jì)元,。