作者：劉憲玲 徐立 郭建成 肖冰 俞召才 樊代明
單位：劉憲玲 徐立 郭建成 肖冰 俞召才 樊代明（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院消化病研究所,，陜西西安710032）
關(guān)鍵詞：HSP90β,；反義核酸,；基因轉(zhuǎn)染,；Westernblot
摘要：目的 了解HSP90β反義核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HSP90β蛋白的表達(dá),。方法 通過lipofectamine介導(dǎo)將HSP90β反義核酸重組子pcDNA-HSP90轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞系SGC7901,、人胃癌多藥耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR,、人肝癌細(xì)胞系HCC7402及人食管癌細(xì)胞系Ec109,。經(jīng)用G418進(jìn)行篩選,，對篩選出的陽性克隆用Western blot檢測HSP90β蛋白的表達(dá),。結(jié)果 pcDNA-HSP90轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞系SGC7901，人胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR,，人肝癌細(xì)胞系HCC7402及人食管癌細(xì)胞系Ec109后,，用G418篩選出的陽性克隆，分別被命名為:AH-SGC7901,，AH-SGC7901/VCR,，AH-HCC7402及AH-Ec109。Westernblot檢測結(jié)果表明,，AH-SGC7901,，AH-SGC7901/VCR，AH-HCC7402及AH-Ec109表達(dá)的HSP90β蛋白低于其親本細(xì)胞,。結(jié)論 HSP90β反義核酸可封閉HSP90βmRNA,，使p
cDNA-HSP90轉(zhuǎn)染的細(xì)胞AH-SGC7901,，AH-SGC7901/VCR，AH-HCC7402及AH-Ec109表達(dá)的HSP90β蛋白減少,，為研究HSP90下調(diào)對腫瘤細(xì)胞生 物學(xué)活性的影響提供了實(shí)驗(yàn)材料,。
中圖號：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A
文章編號：1007－8738(2000)02－0124－04
The expression of HSP90β protein in HSP90β antisense RNA vector- transfected cells
LIU Xian- ling XU Li GUO Jian- cheng XIAO Bing YU Zhao cai FAN Dai- ming
（Institute of Digestive Disease, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province,China）
Abstracts: Aim To evaluate the expression of HSP 90β protein in HSP 90β antisense RNA vector- transfected cells. Methods pcDNA- HSP90 of HSP90β antisense RNA recombinant was transfected through mediation of lipofectamine into human gastric cancer cell line SGC7901, MDR- type human gastric cancer cell line SGC7901/VCR, human hepatic cancer cell line HCC7402 and human esophageal cancer cell line Ec109. Positive clones were selected with G418. The expression of HSP- 90β protein was assayed by Western blot. Results G418 screened positive clones from pcDNA- HSP90 transfected cells were named AH- SGC7901, AH- SGC7901/VCR,AH- HCC7402 and AH- Ec109 respectively. Western blot showed that the expression of HSP90β protein in AH- SGC7901, AH- SGC7901/VCR, AH- HCC7402 and AH- Ec109 cells was lower than that in their parental cells. Conclusion The expression of HSP90β protein in AH- SGC7901, AH- SGC7901/VCR, AH- HCC7402 and AH-Ec109 cells was decreased owing to the blocking roles of HSP90β antisense RNA to HSP90 mRNA in those cells. This supplied experimental materials for studying the effects of the down- regulation of HSP90β on biological activity of tumor cells.
Keywords: HSP90β ； antisense RNA;gene transfection; Western blot
HSP90為生物進(jìn)化過程中一種高度保守的胞漿蛋白質(zhì),，約占胞漿蛋白的1％～2％,。HSP90在體內(nèi)多為二聚體。在較高等的真核生物體內(nèi),，HSP90有兩種,，即α型和β型，兩者分別由730和724個氨基酸組成,，其同源性為84％,。它們分別由不同的基因編碼。HSP90α與HSP90β為組成型表達(dá),，應(yīng)激（如高溫,、感染）可誘導(dǎo)其生成增加，誘導(dǎo)因素不同,，對α及β的誘導(dǎo)有所不同,。相比之下，HSP90α易受熱誘導(dǎo),，而HSP90β易受有絲分裂原誘導(dǎo),。
近年發(fā)現(xiàn)，HSP90與腫瘤關(guān)系較密切[1－3],。腫瘤細(xì)胞中HSP90的表達(dá)比正常細(xì)胞高2～10倍,。HSP90α可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞增殖，HSP90β能夠抑制細(xì)胞凋亡與分化[4,，5],。最近有人報(bào)道，HSP90β還與P-gp的表達(dá)有關(guān)[6],。本研究擬用HSP90β反義核酸載體轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞系SGC7901及其多藥耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR,、人肝癌細(xì)胞系HCC7402和人食管癌細(xì)胞系Ec109，以建立HSP90β蛋白的低表達(dá)細(xì)胞系,為進(jìn)一步研究HSP90β對消化系腫瘤細(xì)胞生物學(xué)活性的影響,，以及HSP90β與耐藥的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)材料。
1 材料和方法
1．1 材料 人胃癌細(xì)胞系SGC7901從軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物研究所引入,。人胃癌多藥耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR由本研究所提供,。人肝癌細(xì)胞系HCC7402由本校病理學(xué)教研室提供。人食管癌細(xì)胞系Ec109由本校生物化學(xué)教研室提供,。HSP90β反義核酸重組子pcDNA-HSP90由作者等[7]構(gòu)建,。pcDNA3.1(＋)由美國楊靜華提供。Lipofactamine，G418,，RPMI1640（Gibco公司）,。小牛血清（浙江金華公司）；山羊抗人HSP90β多克隆抗體(美國Santa Cruz Biotechnology,，Inc),，生物素化的兔抗山羊IgG，SABC試劑盒(武漢BosterInc),；DAB（華美公司）,；三去污劑裂解緩沖液[50mmol/LTris·ClpH8.0，150mmol/LNaCl,，0.2g/L疊氮鈉,，1g/LSDS，100mg/LPMSF（Sigma公司）,，1mg/Laprotinin（Sigma公司）,，10g/LNP-40及5g/L去氧膽酸]；丙烯酰胺,，N,，N-亞甲雙丙烯酰胺（上海華美公司）；TBE（89mmol/LTris-硼酸,；2mmol/LEDTA）,；100g/L過硫酸銨；100g/LSDS,；TEMED（Sigma公司）,；Tris-甘氨酸工作液（25mmol/L Tris堿，250mmol/L甘氨酸
,，1g/LSDS）,；2×SDS凝膠加樣緩沖液（100mmol/LTris·ClpH6.8，200mmol/LDTT,，40g/LSDS,，2g/L溴酚藍(lán)，200mL/L甘油）,；電轉(zhuǎn)移緩沖液（39mmol/L甘氨酸,，48mmol/LTris堿，0.37g/LSDS,，200mL/L甲醇 ）及四氯萘酚（上海華美公司）,。
1.2 方法
1.2.1 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及陽性克隆的篩選 實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染pcDNA-HSP90；空載體對照組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(＋),。SGC7901,，SGC7901/VCR,，HCC7402和Ec109細(xì)胞作為相應(yīng)的空白對照組。以堿裂解法提取重組質(zhì)粒pcDNA-HSP90,，經(jīng)PEG純化,。用lipofectamine介導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)染（按說明書進(jìn)行）：即在接種于6孔板中的細(xì)胞達(dá)到80％融合時，用無雙抗,、無血清RPMI1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞,，加入質(zhì)脂體包裹的質(zhì)粒，37°C50mL/LCO2培養(yǎng)6h,。然后,，更換用含100mL/LFBS的RPMI1640液繼續(xù)培養(yǎng)48～72h后，加入G418（400mg/L）進(jìn)行抗性篩選,。3～4wk后,，見有抗性細(xì)胞集落形成時，挑選細(xì)胞克隆,，用含100mg/LG418的100mL/LFBS-PRMI1640液擴(kuò)大培養(yǎng),。其中pcDNA-HSP90轉(zhuǎn)染組經(jīng)G418篩選出的克隆，分別被命名為:AH-SGC7901,，AH-SGC7901/VCR,，AH-HCC74O2及AH-Ec109。pcDNA3.1（＋）轉(zhuǎn)染組篩選出的克隆,，分別被命名為：SGC701-pcDNA,，SGC7901/VCR-pcDNA，HCC7402-pcDNA及Ec109-pcDNA,。
1.2.2 培養(yǎng)細(xì)胞的裂解及蛋白定量 細(xì)胞接種于直徑90mm的平皿,，于37°C，50mL/LCO2飽和濕度下培養(yǎng)至細(xì)胞長滿平皿,。取出平皿,，用冷PBS洗2次，加入預(yù)冷至0°C的三去污劑裂解緩沖液1mL裂解細(xì)胞,，用移液槍將細(xì)胞碎片移入一只Ep管中,，同時加入10μLPMSF，置4°C30min,，離心(12000r/min)2min,。取上清，分裝于Ep管中,，于－20°C保存?zhèn)溆?。同時，取少許用Photometrey分 析儀進(jìn)行蛋白定量,。?1.2.3HSP90β蛋白表達(dá)的檢測取各種細(xì)胞裂解液,，調(diào)整含量后每樣品上樣10μL，進(jìn)行SDS－PAGE及免疫印跡,。于NC膜上依次加入山羊抗人HSP90β一抗（1∶100）室溫作用2h,，及辣根過氧化酶標(biāo)記的驢抗山羊IgG（1∶500）室溫作用1h。PBS洗滌后,，用四氯萘酚顯色并拍照,。用Quantimet570(Germany,LeicaInc.)圖象分析儀（QUIC圖象系統(tǒng)）對免疫印跡的結(jié)果進(jìn)行半定量分析。條帶的染色強(qiáng)度以灰度值表示（256級灰度,，黑色的灰度值最小為0 ,，白色的灰度值最大為255）。
2 結(jié)果
2．1 陽性克隆的篩選 pcDNA-HSP90載體轉(zhuǎn)染SGC7901,，SGC7901/VCR,，HCC7402及Ec109細(xì)胞后，用G418進(jìn)行篩選,。對篩選出的相應(yīng)陽性克隆,，分別命名為：AH-SGC7901，AH-SGC7901/VCR,，AH-HCC74O2及AH- Ec109（圖1）,。
圖1 pcDNA-HSP90轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)G418篩選出的陽性克隆
Fig1 pcDNA-HSP90 transfected positive clones selected with G418
1：AH-SGC7901；2：AH-SGC7901/VCR,；3：AH-HCC74O2,；4：AH-Ec109.
2.2 HSP90β蛋白的表達(dá) 將Western blot的結(jié)果用Quantimet 570圖象分析儀進(jìn)行分析（圖2）。結(jié)果表明,，SGC7901細(xì)胞與SGC7901－pcDNA細(xì)胞的平均灰度值為61.4±2.4及61.2±3.3,二者無顯著差異(P＞0.05),；AH-SGC7901細(xì)胞的平均灰度值為83.2±2.9,明顯大于前兩者(P＜0.05)，即AH-SGC7901細(xì)胞中HSP90β蛋白的表達(dá)明顯低于其親本細(xì)胞及其空白對照細(xì)胞,。SGC7901/VCR細(xì)胞與SGC7901/VCR-pcDNA細(xì)胞的平均灰度值分別為37.5±3.7及38.9±3.3,二者無顯著差異(P＞0.05);AH-SGC7901/VCR細(xì)胞的平均灰度值為80.5±3.6,明顯大于前兩者(P＜0.05),，即AH-SGC7901/VCR細(xì)胞中HSP90β蛋白的表達(dá)，明顯低于其親本細(xì)胞及其空白對照細(xì)胞,。HCC7402細(xì)胞與HCC7402－pcDNA細(xì)胞的平均灰度值分別為93.5±3.4及89.1±3.5, 二者無顯著差異(P＞0.05);AH-HCC7402細(xì)胞的平均灰度值為156.8±2.8,明顯大于前兩者(P＜0.05),，即AH-HCC7402細(xì)胞中HSP90β蛋白的表達(dá)，明顯低于其親本細(xì)胞及其空白對照細(xì)胞,。Ec109細(xì)胞與Ec109－pcDNA細(xì)胞的平均灰度值分別為81.8±4.0及81.2±3.3,二者無顯著差異(P＞0.05);AH-Ec109細(xì)胞的平均灰度值為103.2±4.2,明顯大于前兩者(P＜0.05),，即AH-Ec109細(xì)胞中HSP90β蛋白的表達(dá)，明顯低 于其親本細(xì)胞及其空白對照細(xì)胞,。
圖2 pcDNA-HSP90轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HSP90β蛋白的表達(dá)
Fig2 HSP90β protein expression in pcDNA-HSP90 transfected cells
1：SGC7901,；2：SGC7901-pcDNA；3：AH-SGC7901,；4：SGC7901/VCR,；
5：SGC7901/VCR-pcDNA,；6：AH-SGC7901/VCR；7：HCC7402,；
8：HCC7402-pcDNA,；9：AH-HCC7402；10：Ec109,；11：Ec109-pcDNA,；
12：AH-Ec109;M:Marker(Mr).
3 討論
基因轉(zhuǎn)染的方法很多,如磷酸鈣－DNA共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,、受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染法,、電穿孔法,基因槍注射法及利用病毒包裝細(xì)胞轉(zhuǎn)染法等。脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染[8]的作用機(jī)制是：脂質(zhì)體首先與DNA形成復(fù)合物,，該復(fù)合物與細(xì)胞膜接觸,、融合，通過細(xì)胞內(nèi)吞作用,，使DNA轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞內(nèi),。Lipofectamine為Gibco公司生產(chǎn)的第3代多價(jià)陽離子脂質(zhì)體，其轉(zhuǎn)染效率明顯高于其它單價(jià)陽離子脂質(zhì)體,，如lipofectin和lipofectACETM等,。一些實(shí)驗(yàn)表明，應(yīng)用lipofectamine轉(zhuǎn)染外源基因,，具有轉(zhuǎn)染效率高,、特異性強(qiáng)、無感染性,、無免疫原性,，并具有方法簡單、容易操作等優(yōu)點(diǎn),，因此,，是一種簡便、安全有效的基因轉(zhuǎn)染方法,。我們應(yīng)用lipofectamine成功地將反義HSP90β基因轉(zhuǎn)染入SGC7901,，SGC7901/VCR，HCC7402及Ec109細(xì)胞,。利用真核表達(dá)載體中含有的新
霉素抗性基因Neo,，用G418進(jìn)行抗性篩選，篩選出的相應(yīng)陽性克隆分別為AH-SGC7901,，AH-SGC7901/VCR,，AH-HCC7402和AH-Ec109。反義RNA（anti-senseRNA）是指與mRNA互補(bǔ)的RNA分子。這種反義RNA能與mRNA分子特異性結(jié)合,，抑制該mRNA的翻譯,，是原核細(xì)胞中基因表達(dá)與調(diào)控的一種方式。反義核酸技術(shù)是通過人工合成反義RNA的基因,，并將其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi),，轉(zhuǎn)錄出反義RNA，封閉其翻譯,，抑制特定基因的表達(dá)，阻斷該基因的功能,。我們曾研究表明,，AH-SGC7901，AH-SGC7901/VCR,，AH-HCC7402及AH-Ec109細(xì)胞有HSP90β反義RNA的表達(dá)[9],。Westernblot檢測表明，與親本細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞相比較,，HSP90β反義核酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞AH-SGC7901,，AH-SGC7901/VCR，AH-HCC7402及AH-Ec109中,，HSP90β蛋白的表達(dá)較其親本細(xì)胞明顯減低,，也說明AH-SGC7901，AH-SGC7901/VCR,，AH-HCC7402及AH-Ec109細(xì)胞有HSP90β反義RNA的表達(dá),。由于部分封閉HSP90mRNA,從而使其翻譯為HSP90β蛋白的量減少?？傊?，由于HSP90β反義核酸重組子pcDNA-HSP90轉(zhuǎn)染的AH-SGC7901，AH-SGC7901/VCR,，AH-HCC7402及AH-Ec109細(xì)胞中,，HSP90β蛋白的表達(dá)低于其親本細(xì)胞，為進(jìn)一步研究HSP90β對消化系腫瘤細(xì)胞生物學(xué)活性的影響及其與耐藥的關(guān)系等建立了細(xì)胞模型,。
基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助,，No.39570806; 國家杰出青年基金資助，No.3952020.
作者簡介：劉憲玲,女,36歲,主治醫(yī)師,講師,，博士 西安市長樂西路15號,，Tel.(029)[email protected]
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