摘 要：【目的】 探索毫米波對人骨髓細胞和白血病細胞克隆能力的影響?！痉椒ā?以波長8 mm,，功率密度為4 mW/cm2 的毫米波輻射人骨髓細胞和HL60細胞、K562細胞,，測定粒巨噬細胞集落形成單位（GM-CFU）和腫瘤細胞集落形成單位（tCFU）,。【結果】 連續(xù)2次60 min的輻射使實驗組的GM-CFU比對照組明顯上升（P<0.05),連續(xù)10次30 min或60 min的輻射均使tCFU較之于對照組顯著降低(P<0.05或P<0.01),。其余輻射方式則對GM-CFU和tCFU的變化無明顯作用(P>0.05),。【結論】 毫米波的短期輻射（2次)能增強正常人骨髓細胞的克隆能力而不影響HL60細胞和K562細胞的克隆能力,，較長時間的輻射（10次)則使HL60細胞及K562細胞的克隆能力明顯降低,。提示微波的非熱效應可能會影響白血病細胞的凈化。
中圖分類號： R454.2 文獻標識碼： A
文章編號： 1000-257X（2000）04S0-0102-03
Effects of Millimeter-wave Radiation on the Clonogenic Capacityof Human Bone Marrow Cell and Leukemic Cells
SHI Hong-liu, WU Xin-yao, CUI Fu-rong
(Faculty of Forensic Medicine, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China)
Abstract：【Objective】 To study the effects of millimeter-wave radiation on the clonogenic capacity of human bone marrow cell and leukemic cells. 【Methods】 Normal human bone marrow cells,、 HL60 and K562 were exposed to 8.0 millimeter-wave at a power density of 4 mW/cm2. GM-CFU and tCFU were measured. 【Results】 It was found that two times of 60 minutes radiation could result in significant increase of GM-CFU (P<0.05) while ten times of 30 minutes or 60 minutes radiation could lead to remarkable decrease of tCFU compared with control group(P<0.05 or P<0.01). And the other kinds of radiation had no significant effects on both GM-CFU and tCFU(P>0.05). 【Conclusion】 A short-time millimeter-wave radiation (twice) could strengthen the clonogenic capacity of human bone marrow cell but not on that of HL60 cells and K562 cells. The longer time millimeter-wave radiation (ten times) could decreased the clonogenic capacity of HL60 cells and K562 cells significantly. It was suggested that nonthermal effect of microwave might influence purgation of leukemic cells.
Key words： microwaves; hematopoietic stem cells/radiation effects; leukemic cells/radiation effects
微波技術已廣泛應用于生物醫(yī)學領域［1］，我們在白血病細胞的凈化研究中使用了微波,，對在凈化過程中可能存在的微波非熱效應產生了興趣,。毫米波因其波長短、在生物組織中穿透深度小,、產熱少等特點而成為研究非熱效應的適宜工具,。本實驗使用低功率的8 mm微波源來研究毫米波對人骨髓細胞和HL60細胞及K562細胞克隆能力的影響，為探討微波的非熱效應對凈化白血病細胞的影響提供依據,。
1 材料和方法
1.1 材料與裝置
1.1.1 試 樣 8例正常骨髓細胞取自正常獻髓者（6例）及非惡性血液病患者（缺鐵性貧血及真性紅細胞增多癥各1例）,。所采的骨髓細胞經淋巴細胞分離液(相對密度1.077)制成單核細胞(MNC)懸液,將2×109/L 細胞置于體積分數為10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,備用。HL60細胞株和K562細胞株（均由廣州軍區(qū)總醫(yī)院實驗科提供）分別作為急性早幼粒白血病(M3)及紅白血?。∕6）的模型,，用體積分數為10%的小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液進行傳代培養(yǎng),待細胞處于對數生長期時用于實驗,。
1.1.2 毫米波輻射裝置 由電子部第55所提供。輻射參量為：波長8 mm,，功率密度為4 mW/cm2,，輻射喇叭口徑為34 mm×40 mm。
1.1.3 輻射方式 將4 mL細胞數密度為3×105/mL的細胞懸液接種于直徑為35 mm的培養(yǎng)皿中,靜置片刻后給予微波輻射,。培養(yǎng)皿和輻射的角錐喇叭均置于36 ℃的恒溫箱中,。
1.2 實驗分組
被照樣品都分為輻射組和對照組，輻射時間分為30 min和60 min,，每日輻射1次,。正常人骨髓細胞共輻射3次，HL60細胞和K562細胞共輻射10次,，對照組在相同條件下進行假輻射,。每次輻射結束均取相等數量的細胞進行GM-CFU（粒巨噬細胞集落形成單位）和tCFU（腫瘤細胞集落形成單位）的測定，并用臺盼藍染色率確定細胞活度(臺盼藍染色率為光鏡下每100個細胞中被臺盼藍染上的細胞個數),。其余細胞經半量換液后繼續(xù)培養(yǎng),。
1.3 培養(yǎng)體系
1.3.1 GM-CFU的培養(yǎng)體系 參照文獻［2］完成,培養(yǎng)總體系1 mL,均含1×105個MNC,體積分數為20%小牛血清,體積分數為10%PHA-LCM（植物血球凝集素刺激的淋巴細胞培養(yǎng)上清）,質量分數為0.5%甲基纖維素(Sigma公司產品),青鏈霉素各100 U,加入24孔板中,置體積分數為5% CO2,37 ℃,飽和濕度下培養(yǎng)8 d,分別計數40個細胞以上的集落數。集落存活率=試驗組集落均數/對照組集落均數×100%,。
1.3.2 tCFU的培養(yǎng)體系 HL60細胞和K562細胞數密度均為2×103/mL,不加PHA-LCM,其余和GM-CFU培養(yǎng)方法相同,。
1.4 統(tǒng)計學處理 實驗數據以±s表示,采用t檢驗。
2 結 果
表1和表2顯示,，在為期3 d的培養(yǎng)和輻射中,，無論是30 min還是60 min的毫米波輻射，對GM-CFU和tCFU的影響都不顯著,，人骨髓細胞和兩種白血病細胞株的臺盼藍染色率和其對照組相比,，也無明顯變化，僅有經過2次輻射的正常骨髓細胞,，其GM-CFU比對照組有明顯上升（P<0.05),，而HL60細胞和K562細胞經過連續(xù)10 d的培養(yǎng)和輻射，30 min,、60 min的HL60細胞的tCFU分別降至對照組的43%和35%,；K562細胞的tCFU則分別降至對照組的66%和47%；HL60細胞和K562細胞的臺盼藍染色率最高升為29.3%和25.2%,，和各自的對照組相比,，上升較為顯著（P<0.05)；對于所有細胞來說,，30 min和60 min的毫米波處理之間沒有明顯差別（P>0.05),，但從趨勢上看，60 min的毫米波的作用效果要強于30 min的毫米波作用,，集落存活率和臺盼藍染率都是如此,。
3 討 論
清除骨髓中殘存的白血病細胞是提高自體骨髓移植療效的關鍵,。鄭華金等［3］在微波凈化白血病細胞的研究中發(fā)現：微波比單純高熱對白血病細胞具有更強的選擇性殺傷作用。我們的工作也得到類似結論［4］,。微波的非熱效應是否也是引起這種選擇性殺傷作用的一個因素一直為我們所關注,。在此之前沈世人等［5］在小鼠上所做的工作說明7.9 mm、3 mW/cm2的微波不僅能減輕鈷射線造成的損傷,，而且能促進放射后受損骨髓造血功能的恢復,；李國光等［6］的實驗則表明毫米波輻照對受化療處理的小鼠造血系統(tǒng)有一定的保護作用；劉守禮等［7］還發(fā)現小鼠離體骨髓懸液經7.9 mm,、2 mW/cm2微波的輻射可以促進骨髓中粒系造血祖細胞的增殖,，這一明顯有利于骨髓細胞良性生長的非熱效應間接支持了下述假設：即微波在凈化白血病細胞的過程中除了熱效應外，非熱效應也可能起一定作用,。在本實驗中,，我們發(fā)現：波長為8 mm的微波對正常人骨髓細胞和白血病細胞的作用是不同的。前者雖然只有經過2次60 min輻射后其GM-CFU才顯著超過對照組,，但白血病細胞卻是隨著輻射次數的增加而呈下降趨勢,；臺盼藍染色的結果表明細胞的死亡數是隨著輻射次數的增加而緩慢增加的，HL60細胞經過連續(xù)10 d的培養(yǎng)和輻射,，其臺盼藍染色率分別升為23.1%和29.3%,，換言之此時尚有76.9%和70.7%的細胞存活,但其tCFU卻分別降為對照組的43%和35%,顯示有相當一部分活細胞已經喪失了克隆能力,即出現了增殖死亡，盡管這些細胞的形態(tài)和某些生理功能仍與正常細胞相同,。K562細胞也存在類似效應,。而通常大功率微波的熱殺傷作用會造成細胞的大量壞死，這與毫米波的作用是有區(qū)別的,。8 mm的微波對正常人骨髓細胞和白血病細胞的不同影響可能是造成選擇性殺傷作用的一個原因,。因為輻射體系處于36 ℃的恒溫箱中，故熱效應可以忽略,，這種作用應屬微波的非熱效應,。
表1 毫米波對GM-CFU和tCFU的影響
Table 1 Effects of millimeter-wave radiation on GM-CFU and tCFU
（±s，%）
Group n trad. / min 1 time 2 times 3 times 10 times
Control 8 0 100 100 100
GM-CFU 8 30 115±29 131±42 96±28
8 60 137±31 148±45 1) 127±33
Control 5 0 100 100 100 100
HL60(tCFU) 5 30 95±28 92±31 90±25 43±162)
5 60 93±30 91±26 88±30 35±132)
Control 5 0 100 100 100 100
K562(tCFU) 5 30 97±25 96±32 96±23 66±211)
5 60 96±32 94±30 92±31 47±182)
1) Compared with control, P<0.05; 2) Compared with control, P<0.01
表2 毫米波對正常骨髓細胞和白血病細胞的細胞活度的影響
Table 2 Effects of millimeter-wave radiation on cell activity of NBMC1) and leukemic cells（±s,，%）
Group n trad. / min 1 time 2 times 3 times 10 times
Control 8 0 6.5±2.0 9.3±3.5 15.3±5.0
NBMC 8 30 7.0±2.1 7.5±2.5 13.2±4.5
8 60 6.1±2.3 8.0±3.0 11.8±3.6
Control 5 0 9.6±3.0 10.5±3.5 9.8±3.1 18.2±5.5
Hl60 5 30 10.3±3.5 9.7±3.2 11.4±3.8 23.1±8.0
5 60 11.2±3.8 9.7±3.2 13.5±5.0 29.3±9.62)
Control 5 0 7.1±2.5 7.5±2.4 8.4±2.8 15.3±4.7
K562 5 30 8.3±2.8 8.5±2.7 9.1±3.0 20.4±5.8
5 60 8.8±3.0 9.3±3.1 9.5±3.2 25.2±8.02)
1) NBMC: normal bone marrow cell; 2)Compared with control, P<0.05
毫米波殺傷腫瘤細胞的機理尚不清楚,，人們在這方面已經做了許多工作［8，9］,。Webb曾發(fā)現在50～200 GHz范圍內,癌細胞對毫米波段的吸收譜不同于正常細胞,利用毫米波能量可選擇性地干擾或破壞腫瘤細胞的代謝。從生物學角度來看,，就目前所知除了降低癌細胞的克隆能力外,，抑制癌細胞的DNA合成、表面受體的改變,、細胞形態(tài)的損傷以及某一時期超微結構的變化等都是導致癌細胞死亡的原因,。最后需要說明的是,，在本實驗的培養(yǎng)體系中，HL60細胞和K562細胞可無限傳代,，而正常人骨髓細胞則自培養(yǎng)的第3 d起死亡數量增多,，所以對其僅進行了3 d的培養(yǎng)和觀察。
基金項目：國家自然科學基金資助項目(69172009)
作者簡介：史泓瀏（1967-）,，男,，江蘇泰興人，博士,，講師,； 崔芙蓉，華南理工大學電子信息學院1997年級博士生.
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