幾十年來，一直認(rèn)為RNA僅僅從DNA獲取遺傳信息,，并將信息轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì),。但最近研究發(fā)現(xiàn)，小RNA(small RNA)發(fā)揮著基因調(diào)控的作用,。小RNA能關(guān)閉基因的表達(dá),，或改變基因表達(dá)的水平。在發(fā)育過程中通過關(guān)閉或開放基因的表達(dá),，小RNA可能指導(dǎo)著細(xì)胞的定向分化并決定細(xì)胞的命運(yùn)[1],。
九十年代初期研究發(fā)現(xiàn)21到28個(gè)核苷酸的小RNA能抑制植物的基因表達(dá),，隨后在動(dòng)物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。但直到1998年2月華盛頓卡耐基研究院的Fire和馬薩諸塞大學(xué)癌癥中心的Mello首次將雙鏈RNA（dsRNA）注入線蟲,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)了比單獨(dú)注射正義鏈或者反義鏈都要強(qiáng)的基因靶向?qū)Ｒ恍缘幕虮磉_(dá)沉默（gene silencing）,。他們將這種現(xiàn)象稱為RNA干擾（RNA interference ,簡稱RNAi）。隨后許多研究者先后采用不同長度的dsRNA使線蟲,、果蠅,、植物、動(dòng)物卵細(xì)胞和哺乳類細(xì)胞等的靶向基因表達(dá)明顯降低或沉默,，因此人們把這種利用dsRNA使目的基因敲低或使目的基因沉默,，從而研究目的基因的功能即為RNA干擾技術(shù)（RNAi技術(shù)）[2]。RNA干擾技術(shù)由于其獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)在干細(xì)胞研究中備受關(guān)注和應(yīng)用,。本文主要綜述RNA干擾技術(shù)在干細(xì)胞研究中的應(yīng)用及其進(jìn)展,。
一、RNAi的機(jī)制及其必需基因
1,、1 RNAi的機(jī)制
實(shí)驗(yàn)表明：RNAi反應(yīng)中,，加入的dsRNA被切割為21-23nt小片段RNA即siRNA，后者會(huì)使目的mRNA被切割為21-23nt的siRNA,。
Hammond等人部分純化了一種RNase Ⅲ型酶（如Dicer等）,，該核酸酶具有序列特異性，它僅降解與引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA,。當(dāng)dsRNA導(dǎo)入細(xì)胞后,，被一種dsRNA特異的RNase Ⅲ型酶Dicer識別,切割成21-23 nt的siRNA，這些片段可與該核酸酶的dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合,，并且作為模板識別目的mRNA,；識別之后，mRNA與dsRNA的有義鏈發(fā)生鏈互換,，原先dsRNA中的有義鏈被mRNA代替,，從酶-dsRNA復(fù)合物中釋放出來，而mRNA則處于原先的有義鏈的位置,。核酸酶在同樣位置對mRNA進(jìn)行切割,，這樣又產(chǎn)生了21-23nt的siRNA,與Dicer形成復(fù)合物即RNA誘導(dǎo)基因表達(dá)沉默復(fù)合物（RISC），繼而RISC特異性地對目的mRNA進(jìn)行切割,，從而使目的基因沉默,，產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象[2-4]。就目前的研究知道在各種生物均存在通過不同長度的dsRNA引起基因表達(dá)沉默的RNAi現(xiàn)象,。如哺乳動(dòng)物細(xì)胞無論RNA干擾活動(dòng),它們都有降解長片段dsRNA產(chǎn)生21-22 nt的siRNA的能力,。Tuschl研究則進(jìn)一步說明甚至在幾種更長片段dsRNA不能產(chǎn)生RNAi的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，siRNA依然能夠引起基因表達(dá)沉默[5]。而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞長片段dsRNA不能產(chǎn)生RNAi的原因可能是長于30nt的dsRNA掩敝RNAi的IFN反應(yīng)的非特異性激活,。但Billy研究提示在鼠未分化的EC細(xì)胞和ES細(xì)胞通過長片段dsRNA誘導(dǎo)RNAi引起特異基因表達(dá)沉默[6],。同時(shí)Yang的研究顯示鼠ES細(xì)胞通過siRNA誘導(dǎo)RNAi引起相應(yīng)目的基因沉默。但通過長片段dsRNA和siRNA引起基因沉默的程度目前仍不清楚[7],。
1,、2 RNAi的必需基因
通過遺傳分析的方法，目前已從線蟲中分離到RDE-2,，RDE-3和Mut-7等,、果蠅中的ago2等、擬南芥中的sgs-2,、sgs-3,、argonaute1(ago1)、sde1,、sde3,、caf、ddm-1,、met-1等RNAi相關(guān)的基因,。研究發(fā)現(xiàn)這些基因多數(shù)屬于多基因家族,，有很大的保守性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),，許多基因沉默必需蛋白與一些基因表達(dá)調(diào)控因子結(jié)構(gòu)相似,如擬南芥的DDMI蛋白與染色體再構(gòu)因子SW12/SNF2相似,；擬南芥的MET1是一種維持DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶；線蟲的RDE-1與翻譯因子Eif2C結(jié)構(gòu)相似[3,、4],。這可能表明，基因沉默機(jī)制在生物的進(jìn)化中有很大的保守性和多樣性,。
二、RNAi 在細(xì)胞分裂或分化中的作用
通過改變?nèi)旧w的形狀（更緊或更松）,，能夠決定某一個(gè)基因表達(dá),。近來研究揭示參與RNAi 的siRNA在染色體形狀的改變時(shí)起著非常重要的作用。這樣RNAi 能永久的關(guān)閉基因的表達(dá),，而不僅僅是短期的抑制它,。而我們知道染色體中心粒周圍的異染色質(zhì)控制著細(xì)胞的分裂。在比較研究缺乏RNAi 的酵母及正常酵母時(shí),，發(fā)現(xiàn)當(dāng)酵母分裂時(shí)染色質(zhì)聚集并移位到細(xì)胞的對側(cè),。而在缺乏siRNA 的酵母里，染色體中心粒周圍不能正常形成異染色質(zhì),，細(xì)胞分裂也不能正常進(jìn)行,。因此研究者推測siRNA 能促進(jìn)異染色質(zhì)聚集到正確的部位并促進(jìn)細(xì)胞分裂的發(fā)生。同時(shí)在具有將遺傳給子代的DNA儲(chǔ)存在一個(gè)核里,，而將表達(dá)的DNA 儲(chǔ)存在另一個(gè)核里特性的四膜蟲（Tetrahymena）的研究中發(fā)現(xiàn),，當(dāng)四膜蟲分裂時(shí)，siRNA 促進(jìn)一些基因的刪除或重組,。RNAi 似乎是作用在四膜蟲中類似于異染色質(zhì)的某種結(jié)構(gòu)上,，刪除或?qū)NA 移到另一個(gè)位置。但機(jī)制目前仍不清楚,。在酵母和四膜蟲中,，siRNA的作用集中在基因組的中心粒周圍，這個(gè)區(qū)域包含有轉(zhuǎn)座子造成的基因重復(fù)序列,。有假說認(rèn)為siRNA在進(jìn)化的很早階段就出現(xiàn)了,，以防止轉(zhuǎn)座子造成的基因組不穩(wěn)定。當(dāng)然,，研究發(fā)現(xiàn)RNAi在發(fā)育和疾病中也具有作用,。研究證實(shí)RNAi 能定向誘導(dǎo)植物干細(xì)胞（分生組織）的分化，因而研究者認(rèn)為RNAi 也可能參與人的干細(xì)胞的分化,。如果在人的細(xì)胞分裂中RNAi 的作用也像它在酵母和四膜蟲中一樣,，那么對RNAi 微小的干擾就可能導(dǎo)致細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)變[1]。
2,、1 RNAi 在植物干細(xì)胞（分生組織）增殖分化中的作用
在芽尖分生組織發(fā)現(xiàn)包含類似動(dòng)物干細(xì)胞一樣的干細(xì)胞,。如果它們處于未分化的狀態(tài)，將為組織再生提供一干細(xì)胞池,。研究提示ago1和zwille對于芽生組織中的干細(xì)胞具有重要的調(diào)控作用[8],。Zwille在芽生組織從胚胎發(fā)育到組織形成的過程中，為維持芽生組織中未分化的干細(xì)胞起關(guān)鍵作用,。在芽尖分化時(shí),，Zwille像ago1一樣誘導(dǎo)STM(shoot meristemless)基因的表達(dá),。而STM基因在整個(gè)發(fā)育過程中涉及莖端分生組織的結(jié)構(gòu)建成,STM基因是芽生組織功能維持和啟動(dòng)分化所必需的[9]。在Zwille突變的芽尖分生組織,，盡管能正確的啟動(dòng)分化,，但不能不對稱分裂,而牙生組織中心區(qū)里的干細(xì)胞失去了干細(xì)胞的特性，并終末分化[9,、10],。
2、2 RNAi在哺乳動(dòng)物干細(xì)胞增殖分化中的作用
線蟲sting缺失突變會(huì)導(dǎo)致雄性不育,。線蟲AGO2是基因沉默所必需的,，它和Dicer蛋白以及siRNA組成RISC復(fù)合體進(jìn)行特異性降解mRNA,根據(jù)最近的研究結(jié)果，基因沉默可能通過控制內(nèi)源基因表達(dá)來調(diào)控生長發(fā)育,，而果蠅和線蟲利用基因沉默必需元件Dicer加工生成的siRNA來調(diào)控發(fā)育的時(shí)序性[11,、12]。而Dicer行使切割功能需要RDE-1或其同源基因ALG1/ALG2的協(xié)同[13,、14],。
果蠅Agronaute家族成員Piwi是干細(xì)胞保持自我更新、不對稱分裂等所必需的,，piwi過表達(dá)影響干細(xì)胞的特性,，引起干細(xì)胞增殖、分裂,；而兩個(gè)與Piwi同源的鼠Agronaute家族成員Miwi和Mili,。盡管它們與Piwi有所不同，但它們涉及精子發(fā)生和原始生殖細(xì)胞的調(diào)控,，而且目前認(rèn)為Miwi是精子發(fā)生的主要調(diào)控開關(guān)[15-18],。
在鼠未分化的EC細(xì)胞和ES細(xì)胞通過長片段dsRNA誘導(dǎo)RNAi引起特異基因沉默的研究中細(xì)胞分離和免疫定位發(fā)現(xiàn)Dicer位于細(xì)胞質(zhì)。但Dicer在EC細(xì)胞的高水平是否與stRNA合成有關(guān),，以及是否是胚胎細(xì)胞和/或未分化細(xì)胞的共同特性,，目前仍不很清楚[6]。
同時(shí),，在人類干細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)人Agronaute家族成員Hiwi在原始造血干細(xì)胞（CD34+骨髓干細(xì)胞）表達(dá),，而在已分化的血細(xì)胞不表達(dá)[19]?？赡蹾iwi表達(dá)缺失與干細(xì)胞分化有關(guān)。
2,、3 RNAi 參與調(diào)控干細(xì)胞增殖分化的機(jī)制
在調(diào)控各種生物細(xì)胞命運(yùn)以及發(fā)育模式的研究中發(fā)現(xiàn)參與干細(xì)胞功能特性調(diào)控的Agronaute家族蛋白也參與了Wingless/Wnt和Hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,。譬如：果蠅Agronaute1（dAgo1）是Wingless信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)子。dAgo1過表達(dá)挽救了通過細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)導(dǎo)激活子Armadillo引起Wingless樣的表現(xiàn)型,。然而,，如果Ago1是Wingless信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的保護(hù)成份，那么dAgo1的丟失也就不會(huì)產(chǎn)生所期望的表現(xiàn)型[20]。因此,，Ago1可能在一并行途徑起作用,。而類似地，由于在卵巢Hedgehog過表達(dá)能彌補(bǔ)Piwi的缺乏,，可見Piwi與Hedgehog相并行起作用,。這些也就與Hedgehog是干細(xì)胞促進(jìn)因子相一致[21、22],。當(dāng)然,，在人類Wingless信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與Agronaute家族間也存在聯(lián)系。如人類Wilm腎腫瘤EIF2C1/hAgo1基因缺失,，而這與激活β-磷酸苯丙胺的突變有關(guān)[23],。
綜上所述：RNAi 可能通過其兩個(gè)必需基因-Dicer 家族、Agronaute 基因家族參與調(diào)控干細(xì)胞的增殖分化[2,、3],。
三、RNAi技術(shù)在干細(xì)胞研究中的應(yīng)用前景
最近通過比較研究胚胎干細(xì)胞,、造血干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞等幾類主要的干細(xì)胞,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些干細(xì)胞都含有一組重要的基因,，大約283個(gè),。同時(shí)還對老鼠和人類的造血干細(xì)胞進(jìn)行了比較，也發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)不同的物種也都含有這283個(gè)基因,。這揭示干細(xì)胞擁有自己的一套基因組,。同期研究揭示至少216個(gè)基因是胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞所獨(dú)有的,。這些基因可能是決定干細(xì)胞特性的最關(guān)鍵的實(shí)質(zhì)因素．譬如：不同干細(xì)胞具有共同模式的基因（JAK/STAT和TGF-β途徑的幾個(gè)基因）參與干細(xì)胞的自我更新等基本功能,，Cy28等特征的基因?qū)⒂欣谖覀冋J(rèn)識干細(xì)胞獨(dú)立的起源位置和發(fā)育階段；Foxd3,、Oct4,、Fgf4和Sox2基因是干細(xì)胞維持多能性所必需的基因.其它一部分分別參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控,、RNA加工,、翻譯、蛋白折疊,、分子伴侶等過程,。而此外大約100多個(gè)基因仍然未知。另有研究比較了干細(xì)胞周圍的干細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和非滋養(yǎng)細(xì)胞的基因活性,，發(fā)現(xiàn)有4000多個(gè)基因在干細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞中表現(xiàn)活躍,，而在非滋養(yǎng)性細(xì)胞中失去了活性,。目前對這些周圍細(xì)胞仍然缺乏充分認(rèn)識[24、25],。為此需要弄清上述每個(gè)基因的功能及其干細(xì)胞固有基因與周圍滋養(yǎng)細(xì)胞基因之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,。由于RNAi干擾技術(shù)比傳統(tǒng)方法（反義核苷酸技術(shù)、基因敲除等）更快更方便地使基因表達(dá)沉默或基因表達(dá)降低,，從而為干細(xì)胞相關(guān)基因功能的研究提供了更有效地工具[1-3],。RNAi干擾技術(shù)不僅有利于干細(xì)胞基因調(diào)控機(jī)制的研究，而且有利于研究干細(xì)胞的分化及其細(xì)胞,、基因治療,。例如：通過dsRNA使基因沉默研究干細(xì)胞的分化；利用RNAi技術(shù)對干細(xì)胞的基因做某些修飾如創(chuàng)建"萬能供者細(xì)胞",，即破壞細(xì)胞中表達(dá)組織相容性復(fù)合物的基因,，躲避受者免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，從而達(dá)到防止免疫排斥效應(yīng)發(fā)生的目的[2,、26],。總之,，RNAi技術(shù)為干細(xì)胞生物學(xué)研究提供一新的,、實(shí)用的方法和手段。
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