幾十年來,，一直認為RNA僅僅從DNA獲取遺傳信息,，并將信息轉換成蛋白質。但最近研究發(fā)現(xiàn),，小RNA(small RNA)發(fā)揮著基因調控的作用,。小RNA能關閉基因的表達，或改變基因表達的水平,。在發(fā)育過程中通過關閉或開放基因的表達,，小RNA可能指導著細胞的定向分化并決定細胞的命運[1]。
九十年代初期研究發(fā)現(xiàn)21到28個核苷酸的小RNA能抑制植物的基因表達,，隨后在動物細胞中也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象,。但直到1998年2月華盛頓卡耐基研究院的Fire和馬薩諸塞大學癌癥中心的Mello首次將雙鏈RNA（dsRNA）注入線蟲，結果發(fā)現(xiàn)誘導了比單獨注射正義鏈或者反義鏈都要強的基因靶向專一性的基因表達沉默（gene silencing）,。他們將這種現(xiàn)象稱為RNA干擾（RNA interference ,簡稱RNAi）,。隨后許多研究者先后采用不同長度的dsRNA使線蟲、果蠅,、植物,、動物卵細胞和哺乳類細胞等的靶向基因表達明顯降低或沉默，因此人們把這種利用dsRNA使目的基因敲低或使目的基因沉默,，從而研究目的基因的功能即為RNA干擾技術（RNAi技術）[2],。RNA干擾技術由于其獨特優(yōu)點在干細胞研究中備受關注和應用。本文主要綜述RNA干擾技術在干細胞研究中的應用及其進展,。
一,、RNAi的機制及其必需基因
1、1 RNAi的機制
實驗表明：RNAi反應中,，加入的dsRNA被切割為21-23nt小片段RNA即siRNA,，后者會使目的mRNA被切割為21-23nt的siRNA。
Hammond等人部分純化了一種RNase Ⅲ型酶（如Dicer等）,，該核酸酶具有序列特異性,，它僅降解與引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。當dsRNA導入細胞后,，被一種dsRNA特異的RNase Ⅲ型酶Dicer識別,切割成21-23 nt的siRNA,，這些片段可與該核酸酶的dsRNA結合結構域結合，并且作為模板識別目的mRNA,；識別之后,，mRNA與dsRNA的有義鏈發(fā)生鏈互換,，原先dsRNA中的有義鏈被mRNA代替，從酶-dsRNA復合物中釋放出來,，而mRNA則處于原先的有義鏈的位置,。核酸酶在同樣位置對mRNA進行切割，這樣又產(chǎn)生了21-23nt的siRNA,與Dicer形成復合物即RNA誘導基因表達沉默復合物（RISC）,，繼而RISC特異性地對目的mRNA進行切割,，從而使目的基因沉默，產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象[2-4],。就目前的研究知道在各種生物均存在通過不同長度的dsRNA引起基因表達沉默的RNAi現(xiàn)象,。如哺乳動物細胞無論RNA干擾活動,它們都有降解長片段dsRNA產(chǎn)生21-22 nt的siRNA的能力。Tuschl研究則進一步說明甚至在幾種更長片段dsRNA不能產(chǎn)生RNAi的哺乳動物細胞中,，siRNA依然能夠引起基因表達沉默[5],。而在哺乳動物細胞長片段dsRNA不能產(chǎn)生RNAi的原因可能是長于30nt的dsRNA掩敝RNAi的IFN反應的非特異性激活。但Billy研究提示在鼠未分化的EC細胞和ES細胞通過長片段dsRNA誘導RNAi引起特異基因表達沉默[6],。同時Yang的研究顯示鼠ES細胞通過siRNA誘導RNAi引起相應目的基因沉默,。但通過長片段dsRNA和siRNA引起基因沉默的程度目前仍不清楚[7],。
1,、2 RNAi的必需基因
通過遺傳分析的方法，目前已從線蟲中分離到RDE-2,，RDE-3和Mut-7等,、果蠅中的ago2等、擬南芥中的sgs-2,、sgs-3,、argonaute1(ago1)、sde1,、sde3,、caf、ddm-1,、met-1等RNAi相關的基因,。研究發(fā)現(xiàn)這些基因多數(shù)屬于多基因家族，有很大的保守性,。進一步研究發(fā)現(xiàn),，許多基因沉默必需蛋白與一些基因表達調控因子結構相似,如擬南芥的DDMI蛋白與染色體再構因子SW12/SNF2相似；擬南芥的MET1是一種維持DNA甲基化轉移酶,；線蟲的RDE-1與翻譯因子Eif2C結構相似[3,、4]。這可能表明,，基因沉默機制在生物的進化中有很大的保守性和多樣性,。
二,、RNAi 在細胞分裂或分化中的作用
通過改變染色體的形狀（更緊或更松），能夠決定某一個基因表達,。近來研究揭示參與RNAi 的siRNA在染色體形狀的改變時起著非常重要的作用,。這樣RNAi 能永久的關閉基因的表達，而不僅僅是短期的抑制它,。而我們知道染色體中心粒周圍的異染色質控制著細胞的分裂,。在比較研究缺乏RNAi 的酵母及正常酵母時，發(fā)現(xiàn)當酵母分裂時染色質聚集并移位到細胞的對側,。而在缺乏siRNA 的酵母里,，染色體中心粒周圍不能正常形成異染色質，細胞分裂也不能正常進行,。因此研究者推測siRNA 能促進異染色質聚集到正確的部位并促進細胞分裂的發(fā)生,。同時在具有將遺傳給子代的DNA儲存在一個核里，而將表達的DNA 儲存在另一個核里特性的四膜蟲（Tetrahymena）的研究中發(fā)現(xiàn),，當四膜蟲分裂時,，siRNA 促進一些基因的刪除或重組。RNAi 似乎是作用在四膜蟲中類似于異染色質的某種結構上,，刪除或將DNA 移到另一個位置,。但機制目前仍不清楚。在酵母和四膜蟲中,，siRNA的作用集中在基因組的中心粒周圍,，這個區(qū)域包含有轉座子造成的基因重復序列。有假說認為siRNA在進化的很早階段就出現(xiàn)了,，以防止轉座子造成的基因組不穩(wěn)定,。當然，研究發(fā)現(xiàn)RNAi在發(fā)育和疾病中也具有作用,。研究證實RNAi 能定向誘導植物干細胞（分生組織）的分化,，因而研究者認為RNAi 也可能參與人的干細胞的分化。如果在人的細胞分裂中RNAi 的作用也像它在酵母和四膜蟲中一樣,，那么對RNAi 微小的干擾就可能導致細胞命運的轉變[1],。
2、1 RNAi 在植物干細胞（分生組織）增殖分化中的作用
在芽尖分生組織發(fā)現(xiàn)包含類似動物干細胞一樣的干細胞,。如果它們處于未分化的狀態(tài),，將為組織再生提供一干細胞池。研究提示ago1和zwille對于芽生組織中的干細胞具有重要的調控作用[8],。Zwille在芽生組織從胚胎發(fā)育到組織形成的過程中,，為維持芽生組織中未分化的干細胞起關鍵作用。在芽尖分化時,，Zwille像ago1一樣誘導STM(shoot meristemless)基因的表達,。而STM基因在整個發(fā)育過程中涉及莖端分生組織的結構建成,STM基因是芽生組織功能維持和啟動分化所必需的[9],。在Zwille突變的芽尖分生組織，盡管能正確的啟動分化,，但不能不對稱分裂,而牙生組織中心區(qū)里的干細胞失去了干細胞的特性,，并終末分化[9、10],。
2,、2 RNAi在哺乳動物干細胞增殖分化中的作用
線蟲sting缺失突變會導致雄性不育。線蟲AGO2是基因沉默所必需的,，它和Dicer蛋白以及siRNA組成RISC復合體進行特異性降解mRNA,根據(jù)最近的研究結果,，基因沉默可能通過控制內源基因表達來調控生長發(fā)育，而果蠅和線蟲利用基因沉默必需元件Dicer加工生成的siRNA來調控發(fā)育的時序性[11,、12],。而Dicer行使切割功能需要RDE-1或其同源基因ALG1/ALG2的協(xié)同[13、14],。
果蠅Agronaute家族成員Piwi是干細胞保持自我更新,、不對稱分裂等所必需的，piwi過表達影響干細胞的特性,，引起干細胞增殖,、分裂；而兩個與Piwi同源的鼠Agronaute家族成員Miwi和Mili,。盡管它們與Piwi有所不同,，但它們涉及精子發(fā)生和原始生殖細胞的調控,，而且目前認為Miwi是精子發(fā)生的主要調控開關[15-18],。
在鼠未分化的EC細胞和ES細胞通過長片段dsRNA誘導RNAi引起特異基因沉默的研究中細胞分離和免疫定位發(fā)現(xiàn)Dicer位于細胞質。但Dicer在EC細胞的高水平是否與stRNA合成有關,，以及是否是胚胎細胞和/或未分化細胞的共同特性,，目前仍不很清楚[6]。
同時,，在人類干細胞的研究發(fā)現(xiàn)人Agronaute家族成員Hiwi在原始造血干細胞（CD34+骨髓干細胞）表達,，而在已分化的血細胞不表達[19]?？赡蹾iwi表達缺失與干細胞分化有關,。
2、3 RNAi 參與調控干細胞增殖分化的機制
在調控各種生物細胞命運以及發(fā)育模式的研究中發(fā)現(xiàn)參與干細胞功能特性調控的Agronaute家族蛋白也參與了Wingless/Wnt和Hedgehog信號轉導途徑,。譬如：果蠅Agronaute1（dAgo1）是Wingless信號轉導途徑的調節(jié)子,。dAgo1過表達挽救了通過細胞質中的轉導激活子Armadillo引起Wingless樣的表現(xiàn)型。然而,，如果Ago1是Wingless信號轉導途徑的保護成份,，那么dAgo1的丟失也就不會產(chǎn)生所期望的表現(xiàn)型[20],。因此，Ago1可能在一并行途徑起作用,。而類似地,，由于在卵巢Hedgehog過表達能彌補Piwi的缺乏，可見Piwi與Hedgehog相并行起作用,。這些也就與Hedgehog是干細胞促進因子相一致[21,、22]。當然,，在人類Wingless信號轉導途徑與Agronaute家族間也存在聯(lián)系,。如人類Wilm腎腫瘤EIF2C1/hAgo1基因缺失，而這與激活β-磷酸苯丙胺的突變有關[23],。
綜上所述：RNAi 可能通過其兩個必需基因-Dicer 家族,、Agronaute 基因家族參與調控干細胞的增殖分化[2、3],。
三,、RNAi技術在干細胞研究中的應用前景
最近通過比較研究胚胎干細胞、造血干細胞和神經(jīng)干細胞等幾類主要的干細胞,，結果發(fā)現(xiàn),，這些干細胞都含有一組重要的基因，大約283個,。同時還對老鼠和人類的造血干細胞進行了比較,，也發(fā)現(xiàn)這兩個不同的物種也都含有這283個基因。這揭示干細胞擁有自己的一套基因組,。同期研究揭示至少216個基因是胚胎干細胞,、神經(jīng)干細胞和造血干細胞所獨有的。這些基因可能是決定干細胞特性的最關鍵的實質因素．譬如：不同干細胞具有共同模式的基因（JAK/STAT和TGF-β途徑的幾個基因）參與干細胞的自我更新等基本功能,，Cy28等特征的基因將有利于我們認識干細胞獨立的起源位置和發(fā)育階段,；Foxd3、Oct4,、Fgf4和Sox2基因是干細胞維持多能性所必需的基因.其它一部分分別參與轉錄調控,、細胞周期調控、RNA加工,、翻譯,、蛋白折疊、分子伴侶等過程,。而此外大約100多個基因仍然未知,。另有研究比較了干細胞周圍的干細胞滋養(yǎng)細胞和非滋養(yǎng)細胞的基因活性，發(fā)現(xiàn)有4000多個基因在干細胞滋養(yǎng)細胞中表現(xiàn)活躍，而在非滋養(yǎng)性細胞中失去了活性,。目前對這些周圍細胞仍然缺乏充分認識[24,、25]。為此需要弄清上述每個基因的功能及其干細胞固有基因與周圍滋養(yǎng)細胞基因之間的網(wǎng)絡關系,。由于RNAi干擾技術比傳統(tǒng)方法（反義核苷酸技術,、基因敲除等）更快更方便地使基因表達沉默或基因表達降低，從而為干細胞相關基因功能的研究提供了更有效地工具[1-3],。RNAi干擾技術不僅有利于干細胞基因調控機制的研究,，而且有利于研究干細胞的分化及其細胞、基因治療,。例如：通過dsRNA使基因沉默研究干細胞的分化,；利用RNAi技術對干細胞的基因做某些修飾如創(chuàng)建"萬能供者細胞"，即破壞細胞中表達組織相容性復合物的基因,，躲避受者免疫系統(tǒng)的監(jiān)視,，從而達到防止免疫排斥效應發(fā)生的目的[2、26],?？傊琑NAi技術為干細胞生物學研究提供一新的,、實用的方法和手段,。
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