3月13日,，國際著名化學雜志《德國應用化學》Angewandte Chemie 在線刊登了中國科學院生物物理研究所王江云課題組和美國伊利諾伊大學香檳分校（University of Illinois at Urbana-Champaign）化學系陸藝教授課題組的最新合作研究成果：“Dramatic Increase of Oxidase Activity through the Genetic Incorporation of Tyrosine-Histidine Crosslink in a Myoglobin Model of Heme-Copper Oxidasse”,。該研究利用非天然氨基酸的定點插入,，首次實現了用18kD 的肌紅蛋白模擬呼吸鏈中重要膜蛋白復合物細胞色素c氧化酶,。該工作首次提供了細胞色素c氧化酶中保守翻譯后修飾Tyr-His功能的直接證據，是蛋白質設計領域的重要進展，并有望在生物能學中獲得重要應用。
細胞色素c氧化酶（CcO）即呼吸鏈復合體IV是線粒體氧化呼吸的限速酶,，它直接參與線粒體中氧氣的還原和質子梯度產生,，它的損傷影響線粒體功能,，導致大量產生活性氧。由于CcO在能量產生和調節(jié)中的重要地位,，自被發(fā)現以來一直是生物研究領域中重要的研究課題,。X-射線晶體結構衍射研究發(fā)現，哺乳動物或細菌中都含有經翻譯后修飾形成的Tyr-His 共價交聯(lián),，但因受技術手段的限制及缺乏直接的證據,，對于共價交聯(lián)Tyr-His的確切作用目前仍是科學研究爭議的焦點。
通過人工進化的方法可以增加非天然氨基酸的新基因編碼,。研究人員首先把無意密碼子“UAG”確定為新的遺傳密碼,，然后對天然的組裝核糖核酸（tRNA）突變，使其含有反密碼子“CUA”,。在此基礎上,，從氨酰-tRNA合成酶突變庫中篩選出可專一結合這種tRNA和指定非天然氨基酸的氨酰-tRNA合成酶突變體。之后,，將生命體中mRNA上任意一個遺傳密碼取代為UAG,，并在培養(yǎng)基中加入化學合成的非天然氨基酸，就可以在蛋白質中相應的位置插入有特殊物理性質,、化學性質的非天然氨基酸,。
本研究首先篩選得到了對含有Tyr-His共價交聯(lián)特征元素的3-咪唑基酪氨酸特異性識別的氨酰-tRNA合成酶，并將該非天然氨基酸插入到了模型蛋白Myoglobin中。再將Mb活性中心空穴內的氨基酸Leu29突變成His,，Phe33突變?yōu)?-咪唑基酪氨酸,，實現了催化還原氧氣轉化為水分子，產生小于6%的活性氧,，催化轉化數超過1000,，催化劑未出現明顯降解。
作為對照,，研究人員構建了突變體Leu29His/Phe33Tyr/Phe43His （F33YCuBMb）,，其中，29位,、43位和64位His可以形成一個銅離子結合位點,，而33Tyr和43His在Mb上的位點及結構與imiTyrCuBMb中33位imiTyr的咪唑基團及酚基團類似，但沒有形成共價交聯(lián),。相比imiTyrCuBMb,，F33YCuBMb將50%的O2轉化成了ROS。這一研究結果表明了Tyr-His翻譯后修飾共價交聯(lián)的重要性,。在此基礎上,，研究人員將能進一步利用非天然氨基酸定點插入及定向進化提高細胞色素c氧化酶模型蛋白的活性，并將其應用到生物電極中,。
生物物理研究所劉曉紅副研究員為論文的第一作者,。該研究得到973計劃和國家自然科學基金委的資助。（生物谷Bioon.com）
doi:10.1002/anie.201108756
PMC:
PMID:
Significant Increase of Oxidase Activity through the Genetic Incorporation of a Tyrosine–Histidine Cross-Link in a Myoglobin Model of Heme–Copper Oxidase†
Xiaohong Liu1,‡, Yang Yu2,‡, Cheng Hu1, Wei Zhang1, Prof. Dr. Yi Lu2,*, Prof. Dr. Jiangyun Wang1,*
Keywords:enzyme catalysis;enzyme models;oxygen reduction;post‒translational modifications;protein design Top model: Heme–copper oxidase (HCO) contains a histidine–tyrosine cross-link in its heme a3/CuB oxygen reduction center. A functional model of HCO was obtained through the genetic incorporation of the unnatural amino acid imiTyr, which mimics the Tyr–His cross-link, and of the CuB site into myoglobin (see picture). Like HCO, this small soluble protein exhibits selective O2-reduction activity while generating little reactive oxygen species.
