4月18日,，PLoS One在線發(fā)表了中科院上海生命科學(xué)研究院生化與細(xì)胞所胡紅雨課題組的研究論文,。該論文應(yīng)用氧化還原敏感的Gaussia熒光素酶和綠色熒光蛋白GFP，報告融合蛋白所處的不同氧化還原環(huán)境,，從而鑒定目標(biāo)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的亞定位及其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),。
真核細(xì)胞中約有三分之一的蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行折疊、修飾,、膜整合,、轉(zhuǎn)運和分泌，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)和跨膜蛋白在這些過程中發(fā)揮著重要的功能,。但是,，由于跨膜蛋白疏水區(qū)域與膜脂結(jié)合的復(fù)雜性,，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)的動態(tài)性，現(xiàn)有的鑒定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的定位和跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的方法非常有限,，且存在操作技術(shù)繁瑣等問題,。
Gaussia熒光素酶（Gluc）是近年報道的分子量最小、活性很高的熒光素酶,，含有五對二硫鍵,，需要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化環(huán)境中才具有完全的發(fā)光活性。博士生李海音等利用Gluc的發(fā)光活性對氧化還原敏感的特性,，將Gluc與GFP串聯(lián)表達(dá)作為新的報告基因,，融合于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白的不同位點，并在HEK 293T細(xì)胞中表達(dá),。他們以Gluc的發(fā)光活性檢測融合位點的氧化還原環(huán)境,，而用GFP的熒光強度檢測融合蛋白的表達(dá)量，從而報告不同融合位點的相對氧化還原環(huán)境,。
該方法可用于區(qū)分其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者細(xì)胞質(zhì)，以此鑒定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的定位和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),，已成功應(yīng)用于單次跨膜蛋白（如calnexin,、Sec61g 和CD3δ）和多次跨膜蛋白（如Herp和HRD1）的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。該方法靈敏度高,、簡單快速,，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的高通量鑒定成為可能。同時,，也可進(jìn)一步應(yīng)用于鑒定細(xì)胞膜蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),，以及檢測蛋白質(zhì)分泌途徑中的氧化還原環(huán)境變化，將為研究蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的定位,、折疊,、氧化還原和修飾，以及動態(tài)的膜整合,、轉(zhuǎn)運和分泌提供更加適用,、方便和高效的生化和細(xì)胞分析技術(shù)。
該項研究工作得到了科技部,、中國科學(xué)院和國家自然科學(xué)基金委的經(jīng)費支持,。（生物谷Bioon.com）
doi:10.1371/journal.pone.0035628
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A Redox-Sensitive Luciferase Assay for Determining the Localization and Topology of Endoplasmic Reticulum Proteins
Hai-Yin Li, Xue-Ming Zheng, Mei-Xia Che, Hong-Yu Hu
Correct localization and transmembrane topology are crucial for the proteins residing and functioning in the endoplasmic reticulum (ER). We have developed a rapid and convenient assay, based on the redox-sensitive luciferase from Gaussia princeps (Gluc) and green fluorescence protein (GFP), to determine the localization or topology of ER proteins. Using the tandem Gluc-GFP reporter fused to different positions of a target protein, we successfully characterized the topologies of two ER transmembrane proteins Herp and HRD1 that are involved in the ER quality control system. This assay method may also be applicable to the proteins in secretory pathway, plasma membrane, and other compartments of cells.
