芯片的構建和閱讀
Vivian G. Cheung, Michael Morley, Francisco Aguilar,
Aldo Massimi, Raju Kucherlapati & Geoffrey Childs
聯(lián)合基因科技有限公司 吳凌凌 譯
摘要
制作芯片和獲得芯片的數據有許多不同的方法,。這里我們介紹了在學術領域中兩種芯片的構建和使用。除了詳細說明了技術細節(jié)外，我們還對組成和方法的優(yōu)缺點進行了評論，同時還介紹了雜交的方法。用我們所建立和使用芯片的方法來回答生物領域問題的事實證明了這種技術在大學的環(huán)境下是可行的。
一種獲得基因功能信息的高通量的方法是cDNA芯片,。在一塊顯微鏡載玻片上包含了幾百至幾千個固定的DNA樣本,，以類似于Northern blot 和 Southern blot的方法進行雜交,。了解了這個方法后,，我們決定在我們各自的實驗室Pennsylvania大學（Penn）和Albert Einstein學院醫(yī)學部（AECOM）制作了高速，高精度的芯片,。這個設備是由Stanford醫(yī)學院Pat Brown制造的,，第一次論證了這個方法的可行性。我們的目標是（1）最終以合理的價格,，用一塊或幾塊芯片來檢測哺乳動物細胞中每個基因的表達,，（2）發(fā)展以芯片為基礎的繪圖方法，（3）兼顧硬件和超作方法,，盡可能地提高靈敏度,。
玻片的優(yōu)勢
一個理想化的支持物允許探針有效地固定在其表面，探針與目標分子能牢固地雜交結合,。與另一種用于制作芯片的標準支持物尼龍一樣,，玻璃有許多的優(yōu)點。它也有其特長,。首先,，DNA樣品以共價鍵的形式結合在處理過的玻片上。第二,，玻璃是一種耐用的材料,，能夠耐高溫和高離子強度溶液的洗滌。第三,，玻璃不是多孔材料,，使雜交的容量能保持在最小，因此能提高探針與目標分子的退火效率,。第四,，由于材料的低熒光性，不會有背景的影響,。最后,，兩種不同的探針能夠標上兩種不同的熒光標記，在一片芯片上同一個反應中同時孵育,；尼龍就受到連續(xù)或平行雜交的限制,。
芯片需要大量的探針固定（或排列）在玻片上，這里我們描述了AECOM芯片,，掃描儀以及進行了關于設計和操作的討論,。如果想得到關于Penn芯片的信息，請到http://w95vcl.neuro.chop.edu/vcheung查找,。
自動化裝置性質
AECOM點樣儀,，Albert,，產生高密度的分隔的矩陣，矩陣包括cDNA,、基因組DNA或其他類似的生物物質。機械的基本組成有計算機控制的三軸向的機械手和獨特筆尖裝置,。
設計特點
機械手被設計成能自動從96或384孔的微量滴定板中選取樣本,，12支點樣筆同時升起，每個點樣筆收集了250-500nl溶液,，在每塊玻片上放置0.25-1nl,，產生的點的大小范圍直徑為100-150μm。機械手是由設置好的程序控制的,，能進行連續(xù)的點樣,，每一點避免與相鄰的點接觸，每點的中心距離大約為200-250μm,。檢測的精密度大約是10μm,。機械手放置在可視工作平臺上（Newport公司），允許放置大量的顯微鏡玻片,，微量滴定板,，三個洗滌裝置和一個干燥裝置。
洗滌裝置是個固定的容器,，裝有蒸餾水,，兩次微量滴定板使用后需要更換。當筆尖浸過液體后,，機械手要來回搖動點樣筆（大約5Hz）來增加清潔程度,。雖然我們認為沒必要，但電腦控制的洗滌液可用超聲波或流動的水來替代,。干燥裝置實際上是干/濕真空吸塵器（Sear公司,，美國），接頭與插入筆尖的限制插口相匹配,。干燥器要做到在筆尖有快速流動的空氣圍繞,，保持局部真空。
所設計的機械手的重要目的是要達到在最小的震動范圍內的高速和高精確性,。我們使用了保濕的可視工作平臺,，精密螺旋驅動地機械滑動，高分辨率的解碼器的隨動系統(tǒng)和沿著x軸方向的兩側支桿,，避免了在一些系統(tǒng)中所見的懸臂結構,。利用第二x軸的滑面來增加系統(tǒng)的固定性，能依次產生更快的定位以及通過工作平臺的準確一致性,。這些特點允許在精確率下的快速運動,，使機械手能在一秒內對兩塊顯微鏡載玻片操作,。
帶有筆尖的點樣筆支持物裝置是一個重要的部分。我們的設計結合了線形運動,，控制點樣筆的方向,，允許在最小的阻力下精確地縱軸運動，以防止在其他方向上的錯位,。我們設計的另一個獨特之處是可調整的末端絲,，允許在10μm的范圍內校直每個點樣筆的軸，以保證所有12支筆尖能在同一時間內接觸顯微鏡玻片,。而另一個沒有這特點的設計需要與點樣筆的精確長度一致以適應多點樣筆的操作,。每個點樣筆由低強度的彈簧作為支持，保證在未接觸表面時能回到伸展的位置,。筆尖是由直徑大約為1.6mm的不銹鋼材料逐漸處理變細直至每點直徑為100μm,。再沿著中心垂直切割，在尖端分成兩部分,，每部部分5μm,。
這個系統(tǒng)由可視基礎程序控制的，在Microsoft Windous NT環(huán)境下運行,，軟件提供：印刷程序具體化,；完成系統(tǒng)校正；顯示真正地時間位置,、速度和產生的錯誤,；與其他功能參數一樣重要的隨動系統(tǒng)；動態(tài)地顯示打印過程中的重要參數,。隨動系統(tǒng)控制的計算機中的插件能夠動態(tài)地控制高速,、復雜的機械手的動力，并設計成以它的運動來控制程序的語言,?？梢?a href="http://hnhlg.com/sell/show-35942.html" target="_blank">原理和隨動插件運動控制程序相互作用，交換了參數,、圖象和所需的命令,。微量滴定板的同一性是由掃描它的閱讀器所決定的。由于有筆尖易被灰塵和纖維阻礙的問題,，打印機現在被附上了軟保護壁允許三個方向的隨意進入并且合并了高效率效式空氣過濾與吹風機以達到濕氣的再流通,。
操作
打印的第一步是將顯微鏡載載玻片以統(tǒng)一的形式排列在工作平臺上，用在激光平臺上的1孔作為引導,，然后按下,。膜微量滴定板固定器突然定位在平臺的某一位置，用同樣的孔來排列自己,。同樣的微量滴定板固定器保持在沖洗狀態(tài),，也能被放置在任何方便的位置,。使用者可任意選擇保留的配置或進入配置中的參數。緩慢移動模式用于校驗,，使坐標位置正確,。最后，使用者提示增加微量滴定板,，機械手進入自動點樣操作,。點樣筆從微量滴定板中收集樣品并點樣，從而對每塊載玻片進行同樣的操作,。然后沖洗/干燥操作，再對新的樣品進行重復操直到當所有的樣品全部完成,。在點樣的過程中,，程序自動地將同一來源的微量滴定板保留在磁盤上，優(yōu)化每一點以及載玻片上的X-Y終點位置,。這個文件稍后與基因說明文件合并,，產生載玻片上已印好的點的復合說明。
觀察
點大小的精確性依賴著筆尖的規(guī)格,。尖端精細的槽口要求特殊的微加工工具就象Wire EDM,。我們用的筆尖是TeleChem的，與我們的筆軸相匹配,。它們的性能是可接受的,，雖然它們是十分脆的。我們希望能獲得有進展,，更耐用的樣式,。
掃描儀特點
我們設計和制造的激光掃描儀IRIS，是Standford大學和國家健康研究所研制的器械的衍生產品,，使靈敏度和動態(tài)范圍最大化,。我們也試圖將運轉的適應程度結合到設計中，因此在將來能夠進行改進,，允許更有效的熒光染料的測定（最近引進了DNA自動測序儀）,。兩個有染料標記的目標雜交后，玻片被掃描后產生16位TIF圖象,。每點的象素強度是與染料分子的數量以及與PCR產物斑點雜交探針數量成比例,。
設計特點
激光掃描儀有一些關鍵的組成。軟件是與HPVEE繪圖程序語言同步的程序,。規(guī)劃圖形的運動,，控制A/D轉換數據的捕獲，處理兩個頻道的信號,，顯示每一次掃描的真實的時間參數,，產生TIF文件的標題以及保存TIF圖象的結果,。八個樣本引進的數據平均為每一個象素，轉換為二進制整數,，為校正圖象的變化,，輪流進行的掃描，然后保存,。使用者可以看見大屏幕的示波境波形就是每次掃描的平均值,，最小值和最大值統(tǒng)計。
操作
自動化分級操作搜索掃描模式,，在X軸的方向上連續(xù)地通過顯微鏡載玻片,，然后在Y軸的方向上移動一個象素的位置，產生一個bi-方向的光柵模式,。X軸的信號解碼器是由特殊設計的觸發(fā)回路處理的,，取消了每次掃描后的隨動震動，產生了在所有方向上的A/D轉換的清晰觸發(fā),?；芈繁ＷC了微米以下的空間分辨率和圖象的線性結構。兩條激光光柱合成聯(lián)合直線,，通過雙重光束分割濾波器反射過目標,，形成刺激顯微鏡載玻片上染料分子發(fā)熒光的精細聚焦光束。部分熒光是由目標分子捕獲的,，通過雙光分裂濾波器發(fā)送,，在濾波立方中分成紅綠兩種信號，在波段通過器中過濾,。發(fā)送入各自的轉換電信號的光電管（PMT0）中,。每個光電管被A/D轉換器放大，過濾和采樣,。轉換器完成8個附加抽樣,，軟件達到平均每象素8個樣本，產生真實的16位分辨率的圖象,。
觀察
我們最初獲得了不恰當的信噪比,，因此制定了雙成分過濾器，（根據濃度）建立了我們規(guī)格,，降低DC成分的干擾水平,。立體過濾成分的去除，進一步改進了靈敏度,。我們原先的設計有包括兩個相配的聚焦鏡的立體過濾器,，小孔和不同的元件，這些如果組合在一起形成了共焦顯微鏡,。但是我們發(fā)現光學共焦不能加強檢測,。事實上,，鏡頭使干擾水平增加了兩倍，這是由于自動的熒光性-整個裝備導致了所需信號相當大的衰減,，結果所有信噪比大大地減弱,。我們因此推斷在X軸方向的立體過濾在應用中沒有起到作用。我們發(fā)現激光輸出的清晰過濾對降低干擾是基本的,。最后,，為了達到可視成分的精細排列和精確的最佳聚焦，利用了刻度載玻片和軟件,，獲得了高靈敏度的雙物鏡系統(tǒng)和廣大的動態(tài)視野范圍,。
有時遇到的問題是鏡子干擾的存在，由十分明亮但比我們所需的點的圖象要?。?lt;1μm-25μm）的信號組成,。我們認為這是由于灰塵和沒結合的染料所形成的。在干凈的環(huán)境中操作,，嚴格遵守雜交程序對減少這些影響是十分必要的。
在屏幕上顯示的波形是可重復的,。當比較同一行的重復掃描,，我們發(fā)現極好的重復性。從中我們降低了由于掃描儀的光學和電子學因素而沒傳入的有用信號所產生的變形,。當調節(jié)不同的控制參數時,，這個顯示能力也使我們精確地測量了在信號-干擾率上的影響。PMT冷卻是包括在保持電子干擾最小化的設計中的,。迄今為止,，當PMT冷卻到-18℃時，我們還沒有找到在提高靈敏度方面的巨大進展,。系統(tǒng)的干擾水平還沒有達到電子干擾的水平,，它的重要元件仍舊有光學干擾?？赡苁请s交進程中在載玻片上留下了一些自動顯示熒光的殘余,。我們正開發(fā)新的方法來進一步減少干擾水平。
從目前系統(tǒng)的靈敏性來看,，10 mW激光的能量看來是足夠的,，5mW就能產生令人滿意的結果，并且顯示了在這個區(qū)域中系統(tǒng)的增進是直線的,。PMT的電壓和激光能量是可交換的,，不需要降低信號-干擾率。
性能
比較掃描儀的性能,，通常沒有可接受的標準,。為了測定我們掃描儀的性能,，通過利用一些包含不同濃度Cye3染料校準的載玻片來測定靈敏性。結果顯示掃描儀能可靠地測定在100μm點上少于10-18 摩爾的染料的濃度,。我們試圖實現對染料結合和雜交能力測定的附加實驗,，但是性能顯示我們用目前的探針預備方法能探測到低量的mRNA。初步的結果顯示我們的掃描儀有比市場上的掃描儀高四倍的靈敏度,，同時能處理多三倍的信號（在飽和狀態(tài)前）,。我們的掃描儀有超過1000倍的動態(tài)范圍，明顯比高密度過濾器的10倍的動態(tài)范圍要好,。我們能同時進行雙色成像,，但是是有限制的，因為有兩個通道之間的干擾,。這能通過在一個時間掃描一種顏色的方法而最小化,，雖然當每塊載玻片用兩種以上的染料時，交叉激發(fā)仍能產生干擾現象,。由我們的系統(tǒng)產生的典型的芯片,，掃描用典型的12.8μm的象素大小，能產生16位分辨率的2048 by 1550象素的圖象,。每個點覆蓋了大約100個象素,，成像的掃描時間大約是40分鐘。
雜交注意事項
DNA的數量,。芯片上每點DNA的數量是可估計的,。猜想每點堆積的形狀是半球形的，它的容量是可以計算的：
一點的量=1/2 × (4/3πr3 )
每點的DNA的數量=樣本的濃度 × 每點的量
斑點的容量少意味著用于雜交的探針的數量也很少,，即使樣本的濃度很高,。必須努力減少這樣的限制。一些因素必須考慮到,，除了探針DNA的數量外,，還有與目標分子相互補的探針DNA的比例，長短,，目標分子的活性,，就象用于檢測信號方法的靈敏度影響著信號的強度。
雜交信號的濃度是與目標分子活性成比例的,，與它的長度成反比,，因此目標分子的特殊活性是十分重要的。每次實驗的雜交時間也應該精確測量,。
沉積機制
點樣筆的精確切口允許利用毛細現象從微量滴定板中吸取樣本,。壓力由點樣筆向下的運動產生，載玻片的表面張力拖動樣本從切口內到玻片上。點的大小依賴于點樣筆向下及離開載玻片的加速度和載玻片表面的張力,。點樣筆向玻片的加速度與點的大小成比例,，因此能調整到所希望的點的大小。當點樣筆從玻片收回后,，在切口內的樣品和沉積在載玻片上的樣本之間的流量就形成了,。如果收回的速度很快尖端的量就被打斷了，產生了大的點,，不是完美的半球形,。如果收回的速度十分慢，點樣量就在尖端"修剪"了,，留下的點就小,。
DNA樣本
樣本準備在96孔的板上，乙醇沉淀并用70%的乙醇洗滌,然后在2×檸檬酸鈉（SSC）中重建,。樣本濃度的重建依賴于所需點的大小和樣本的粘稠度,。如果樣本需要排列為小的點，它們的濃度就要高,。但是,，限制因素是筆尖的設計，會使樣本粘稠而難以排列,，那些濃度大于2μg/μl的太粘了而不能點樣,。我們點樣的目標濃度是每個樣本15ng一個點。雖然我們在2SSC中重新建立了樣本,，但是溶液的離子濃度能在1×SSC到5×SSC之間而不影響雜交，然而樣本溶解在溶液中后離子濃度高于5×SSC就很難與載玻片接觸,。
將DNA固定到玻璃片
在DNA排列到玻片上以后,，它們是自然干燥的。樣本的固定是通過紫外線（UV）固定的,，形成在DNA上的胸腺嘧啶脫氧核苷殘基和硅烷玻片上氨基之間的共價鍵,。類似的方法也用于將DNA樣本固定在尼龍膜上。為了完成最大化的雜交,，要在紫外線交聯(lián)之前,，芯片要保持微量的濕潤，通過將"排列"暴露在沸水中,，然后在254nm的紫外線下暴露到0.27J/cm2 ,。我們發(fā)現精密測量照射的量是十分有利的，只要確定產生最佳信號的照射最佳水平,。過長時間的照射導致了由于連接不充分而產生的DNA損失和個別地,，DNA樣本的過多的斷裂。在交聯(lián)后,，過多的DNA分子在室溫下被0.1%的SDS沖洗掉,，然后在雜交以前,，排列的樣本在95℃的水中變性。
雜交中的
有許多方法使目標分子和探針進行雜交,。我們發(fā)現三個工作溶液對于熒光探針和固定在玻璃上的DNA的雜交是很好的,；與溶劑和溫度不相關。一般來說,，在42℃,，甲酰胺基礎上的雜交比65℃水溶液中的要好，因為促進了信號和雜質的比率,。但在甲酰胺中的動態(tài)雜交要比在水溶液中的慢,，當用低拷貝量的目標分子時，建議使用有右旋糖苷硫酸鹽或聚乙烯乙二醇的水溶液,。
類似的方法用于使"雜質"最小化：用Denhardt試劑,，十二烷基硫酸鈉（SDS）修剪鮭精DNA，tRNA和Cot1DNA,。當我們用cDNA時,，也包括多聚A RNA或與富含T的序列相連接的多聚A。
討論
我們集體的努力顯示了在學術環(huán)境下如何實現芯片技術的,。在AECOM,，芯片和掃描儀是由家庭工程師制造的，使用家庭工程師的好處是她/他是親手改良和維修儀器的,。在Pennsylvania大學,，芯片是在大學機械店的幫助下在實驗室中制造的；掃描儀（General掃描儀公司）是購買的,。
芯片構建的改良技術必須與基因組克隆圖譜實用性的增加,，好的cDNA克隆，分析工具的良好使用相匹配,。這些工具的綜合和易操作性對基因研究發(fā)展的速度是十分重要的,。
生物芯片的制作
對于一些實驗室來說，如果現成的商品化芯片不能滿足研究需要,，而自行設計向廠家定做芯片也不能滿足時間的需要時,，就需要自制芯片。要成功的制作芯片,，需要準備3大材料：準備固定在芯片上的生物分子樣品,、芯片片基和的制作芯片的儀器。研究目的不同,，期望制作的芯片類型不同,，制備芯片方法也不盡相同，以DNA芯片為例，基本上可分為兩大類：一類是原位合成（即在支持物表面原位合成寡核苷酸探針）,，適用于寡核苷酸,；一類是預合成后直接點樣多用于大片段DNA，有時也用于寡核苷酸,，甚至mRNA,。
原位合成有兩種途徑，一是原位光刻合成（Affymerix公司專利技術,，參見前文介紹）,，該方法的主要優(yōu)點是可以用很少的步驟合成極其大量的探針陣列。某一含N個核苷酸的寡聚核苷酸,，通過4×N個化學步驟能合成出4N個可能結構,。例如合成想要8核苷酸探針，通過32個化學步驟,，8個小時可合成65,，536個探針。而如果用傳統(tǒng)方法合成然后點樣,，那么工作量的巨大將是不可思議的,。同時，用該方法合成的探針陣列密度可高達到106/cm2,。
另一種原位合成是壓電打印法(Piezoelectric printing),。原理與普通的彩色噴墨打印機相似，所用技術也是常規(guī)的固相合成方法,。不過芯片噴印頭和墨盒有多個,，墨盒中裝的是四種堿基合成試劑。噴印頭可在整個芯片上移動,。支持物經過包被后,，根據芯片上不同位點探針的序列需要將特定的堿基噴印在芯片上特定位置。沖洗,、去保護、偶聯(lián)等則同于一般的固相合成技術,。該技術采用的化學原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一致,，因此不需要特殊制定備的化學試劑。每步產率可達到99%以上,，可以合成出長度為40到50個堿基的探針,。
盡管如此，原位合成方法仍然比較復雜,，除了在基因芯片研究方面享有盛譽的Affymetrix等公司使用該技術合成探針外,，其它中小型公司大多使用合成點樣法。
點樣法是將預先通過液相化學合成好的探針、或PCR技術擴增cDNA或基因組DNA經純化,、定量分析后,，通過由陣列復制器（arraying and replicating device ARD）或陣列點樣機（arrayer）及電腦控制的機器人，準確,、快速地將不同探針樣品定量點樣于帶正電荷的尼龍膜或硅片等相應位置上（支持物應事先進行特定處理,，例如包被以帶正電荷的多聚賴酸或氨基硅烷），再由紫外線交聯(lián)固定后即得到DNA微陣列或芯片,。點樣的方式分兩種,，其一為接觸式點樣，即點樣針直接與固相支持物表面接觸,，將DNA樣品留在固相支持物上,；其二為非接觸式點樣，即噴點,，它是以壓電原理將DNA樣品通過毛細管直接噴至固相支持物表面,。打印法的優(yōu)點是探針密度高，通常1平方厘米可打印2,500個探針,；缺點是定量準確性及重現性不好,，打印針易堵塞且使用壽命有限。噴印法的優(yōu)點是定量準確,，重現性好,，使用壽命長；缺點是噴印的斑點大,，因此探針密度低,，通常只有1平方厘米400點。點樣機器人有一套計算機控制三維移動裝置,、多個打印/噴印頭,、一個減震底座，上面可放內盛探針的多孔板和多個芯片,。根據需要還可以有溫度和濕度控制裝置,、針洗滌裝置。打印/噴印針將探針從多孔板取出直接打印或噴印于芯片上,。檢驗點樣儀是否優(yōu)秀的指標包括點樣精度,、點樣速度、一次點樣的芯片容量,、樣點的均一性,、樣品是否有交叉污染及設備操作的靈活性、簡便性等等,。
一,、點樣設備
Telechem公司全新SpotBot Personal Microarrayer
對于那些需要經常小批量使用多種不同的研究用芯片的普通用戶來說,，向Affymetrix這樣的大公司定做自行設計芯片的時間和成本太高，然而又不太可能支付得起一套高性能的大型生物芯片點樣制作系統(tǒng),，Telechem公司最新推出的SpotBot個人微陣列點樣機絕對是一個好消息,。這種只有一臺臺式普通離心機大小(30cm x 30cm x 22cm)的個人芯片點樣機功能相當完備：
4針的打印頭(4-Pin Printhead)可以配各種Stealth點樣針；
一次可以放置14張玻片(25mm x76mm/片),；每張片可以點3600個點(9mm x9mm區(qū)域),；
最大的打印范圍可達20mm x 70mm；將來軟件升級后每張片將可以打50400個點,；
點樣可以選擇每個樣品單點,、雙點或者3點；
可以放置1塊384孔板,，可以手工換板,；
完成一塊384孔板的點樣時間為2小時(每個樣品3點，14張玻片),，6小時可在14張玻片上點超過1000個樣品(雙點/樣品),；
先進的自動清洗干燥臺保證樣品之間沒有交叉污染；
透明罩保證點樣工作環(huán)境的清潔和恒定的溫度和濕度,；
開關門感應器保證用戶的安全,；
軸運動偏差±10μm；
外形輕巧可愛,，連真空泵和蠕動泵在內總重僅6.4公斤,，
最令人驚喜的是價格相當便宜！
美國Cartesian Technology公司的MicroSys 5100小型臺式芯片工作站MicroSys 5100也是專門為實驗室做小量芯片研究工作設計的一套臺式工作站,。一次處理10張芯片,，采用接觸式點樣技術，使用標準的CHipMaker或Stealth點樣針,，可放置1塊96/384孔樣品板,，并配有一套載片真空固定系統(tǒng)和一套針頭清洗真空干燥系統(tǒng)。價格低廉,，非常適合經費緊缺的研究部門做芯片應用的中小型研究項目使用,。
對于中型到大型的用戶則可以選擇美國Cartesian Technology公司PA系列、SQ系列生物芯片點樣制作系統(tǒng),。這家公司在芯片技術剛出現時就致力于開發(fā)能將生物芯片變?yōu)楝F實的點樣制作系統(tǒng),，并得到生物芯片技術的開創(chuàng)者M.Schena的支持。通過與著名的點樣針制作廠家TeleChem公司聯(lián)合,，融合自身擁有多項專利的噴點技術,，生產的芯片點樣系統(tǒng)一直在該領域獨占鰲頭,。
PA系列是應用專利的 PinArrayTM （針陣列）技術,，在玻片等基質上生產高密度芯片的生物芯片點樣系統(tǒng),，該系列的產品均使用TeleChem公司的 ChipMaker 和 Stealth 系列點樣針。點陣密度可以達到2500/cm2
PixSys 5500 PA Workstation.
適用于中等工作量研究用途的點樣工作站,。該系列配備精密的Telechem點樣針,，也可同時選配synQUAD微定量噴頭，點樣快速,、精確,，適用范圍廣泛，使目前生物芯片點樣系統(tǒng)的主流產品,。
ProSys 5510 PA Workstation.
應用其專利的PinArrayTM 技術在玻璃片基上生產高密度芯片的高通量點樣工作站,。適用范圍廣，點樣快速精確,，自動化程度高,，一次可處理100張芯片，適合大規(guī)模的工業(yè)化生產使用,。
SQ系列生物芯片點樣系統(tǒng)
SQ系列使應用其專利的synQUADTM 技術在各種類型的膜及玻片等基質上進行非接觸的同步噴點系統(tǒng),，還可以用來進行轉板等微定量液體轉移工作。點樣速度可達1000點/分鐘,。
二,、芯片片基
用點樣法制作芯片，除了專用的儀器外,，還需要要選擇合適的固相支持物--芯片片基,，也就是載體材料。一般來說各種芯片片基都選擇經過相應處理的硅片,、玻璃片,、瓷片或聚丙烯膜、硝酸纖維素膜,、尼龍膜等作為支持物,。作原位合成的支持物在聚合反應前要先使其表面衍生出羥基或氨基（視所要固定的分子為核酸或寡肽而定）并與保護基建立共價連接；作點樣用的支持物為使其表面帶上正電荷以吸附帶負電荷的探針分子,，通常需包被以氨基硅烷或多聚賴氨酸等,。我們在下面介紹一些常見的相關產品：
膜：與玻片相比，膜的優(yōu)點是與核酸親和力強,，雜交技術成熟,，通常無需另外包被。由于尼龍膜與核酸的結合能力,、韌性,、強度都比較理想，以膜為基質的芯片絕大多數采用尼龍膜,。Schleicher & Schuell 公司是專業(yè)生產雜交/過濾膜的公司,，著名的硝酸纖維素膜即是該公司首家推出的,。S&S的Nytran SuPer Charge正電荷尼龍膜帶電量是常規(guī)正電荷尼龍膜的3倍，與核酸的結合力更強,，而且又大大降低了背景和非特異結合,，克服背景高的缺點，加上韌性強,，反復雜交10次依然保持表面平整的優(yōu)點,，成為制作尼龍膜芯片的最佳選擇。Nytran SuPerCharge有多種規(guī)格,，詳細資料可以向基因有限公司查詢,。
玻片：用于制作芯片的玻片必須特別清潔和平滑。玻片表面必須包被合適的功能基團能將靶DNA片段固定住并防止其在雜交洗滌過程中被沖洗掉,。經表面化學處理的玻片是一種持久的載體,，它可耐受高溫和高離子強度；玻片具有不浸潤性,，使雜交體積降低到最小,，因此提高了退火時的動力學參數，疏水表面可以使點密度大于親水表面（因為親水表面上樣品點將擴散）,；玻片的熒光信號本底低,，不會造成很強的背景干擾；玻璃芯片可使用雙熒光甚至多熒光雜交系統(tǒng),，可在一個反應中同時對兩個以上的樣本進行平行處理,。由上可知，以玻璃為載體的芯片更具有發(fā)展和應用的前景,。
S&S公司的CAST Slides(Cat.No.10484181,20/box)將SuPerCharge正電荷尼龍膜附著在玻片上,，這種特殊的玻片綜合了尼龍膜的高親和力和玻片剛性的優(yōu)點，是世界上第一個膜結合玻片,。而FAST Slides (Cat.No.10484182,20/box)則是在玻片表面包被一種專利的聚合物,，這種聚合物能迅速與DNA以非共價但是不可逆的方式結合。由于表面包被層的多孔性和厚度使單位面積的DNA結合能力比常規(guī)化學表面處理玻片要高得多,，使得檢測更加靈敏,。其雜交方式和傳統(tǒng)的雜交一樣。適用的檢測方法包括同位素檢測,、化學發(fā)光法和熒光檢測--由于包被的多聚物有效降低對入射光的散射,，FAST Slide同樣適合用激光共聚焦成像系統(tǒng)進行熒光檢測。
TeleChem ArrayIt Super Microarray Substrates(25mm x 76mm)采用高清潔度,，超平表面的的玻片并進行化學修飾,，各項技術指標居同類產品前列。SuperClean(Cat.No.SMC-25, etc.),， SuperAmine (Cat.No.SMM-25,etc.)和SuperAldehyd(Cat.No.SMA-25, etc.)三種規(guī)格可偶聯(lián)核酸,、蛋白,、甚至細胞，且偶聯(lián)過程可以在室溫及中性條件下進行,。
Clontech提供的DNA-Ready Type I Slides (Cat.No.7880-1, 5 slides/box)是氨基修飾的，能結合200bp-10kb的修飾和未經修飾的DNA,，DNA-Ready Type II Slides (Cat.No.7881-1, 5 slides/box)是特殊氨基修飾的,，能結合50bp-10kb的修飾和未經修飾的DNA。
另外CEL公司也提供醛基化修飾的玻片Silylated Slides(Cat.No.CSS-25),。
三,、點樣樣品
點樣樣品的制備是非常關鍵的一步。樣品的純度,、雜交特異性直接決定自制芯片的質量和可信度,。可以說,，沒有好的樣品,，自制芯片也就沒有多大意義。
我們在前面介紹了Clontech公司的Atlas系列,，其中Glass Array和Plastic Array上那8300個基因對應的80堿基長寡核苷酸序列是經過Clontech公司專利軟件在GenBank中篩選出的同源性最低,，又經Clontech實驗確保能給出很強雜交信號的片斷。這種精巧的設計保證很高的分辨率,、靈敏度,，實在令人印象深刻。現在,，你可以通過基因公司定購這些寡核苷酸來制作自己的芯片了,。足夠點1000次芯片的8327個人類基因、5002個小鼠基因或者將近4000個大鼠基因的寡核苷酸片斷（凍干）放在96孔板中,，連同100個Type II玻片和雜交盒,，200ml雜交液，全面滿足中小型實驗項目的需求,。這些寡核苷酸序列數目齊全,，質量可靠，能為自制芯片的靈敏度和分辨率提供可靠的保證,，也避免了合成8000多基因的麻煩,。還有更大包裝可供選擇。對Atlas Nylon Array上的200-600bp的cDNA片斷感興趣的研究人員則可以選擇Ready-to-Print cDNA 系列,，共計5278個人類基因,，3197個小鼠基因或者2727個大鼠基因（每個基因片斷有3ug，分裝在96孔板中）,，均可定購,。
Cat.No.
Product(基因數目)
可點芯片數
CS2006
Human Long Oligos(8327)
1000
CS2007
Mouse Long Oligo(5002)
1000
CS2008
Rat Long Oligo(4000)
1000
CS2009
Human Ready-to-Print cDNA(5278)
3ug/gene
CS2011
Mouse Ready-to-Print cDNA (3197)
3ug/gene
CS2012
Rat Ready-to-Print cDNA(2727)
3ug/gene
如果人,、小鼠和大鼠的這些Oligo還不能滿足你的需要，那么可以選擇Operon公司的Array-Ready Oligo Sets,。剛被QIAGEN公司收購的Operon公司是世界著名的DNA合成專家,，提供包括有酵母基因組、人類基因組,、小鼠基因組,、瘧原蟲基因組和肺結核桿菌基因組的Oligo sets。所有的OligoSets都是按最新的數據而設計的,。由于測序速度的提升,，更多新數據涌現，Operon公司保證以后根據新數據設計的Oligos將以升級試劑盒的形式提供,。
Yeast Genome Oligo Set里提供斯坦福大學酵母基因組數據庫（SGD）中6307個釀酒酵母的開放閱讀框中挑選的長度為70-mer單鏈寡核苷酸和10個對照,，所有的序列經過BLAST保證同源性最低，避免非特異雜交,。每種Oligo有2000pmol,，足夠點2000-6000張片。
Alaria Genome Oligo Set則包含整個Plasmodium falciparum瘧原蟲基因組6231個預測的基因或ORF對應的70-mer寡核苷酸,，以及138個對照,，是由加州大學的芯片專家Dr.Joe DeRisi協(xié)助設計的。數據來源是Sanger中心和TIGR以及斯坦福大學,。
Operon公司也提供Human Genome Oligo Set,，包含13971個來源于UniGene中的已知基因對應的70-mer寡核苷酸序列（Hs build 119）和29個對照。（The UniGene database automatically clusters all human Genbank sequences into a non-redundant set of genes. Similar databases are also available for the rat and mouse genomes. Each cluster in the UniGene database represents one unique gene. A cluster may contain many sequences, but one representative sequence has been selected based on the longest region of high-quality sequence data.）
Mouse Genome Oligo Set同樣包含6868個已知基因對應的70-mer序列,，數據來源也是Mouse UniGene Build 83,，還有16個對照。每個Oligo的量也是2000pmol,。
Tuberculosis Genome Oligo Set包含4295個70-mer Oligo,，其中大部分是來源于Sanger中心測序的Mycobacterium tuberculosis H37RV (lab strain)基因組中預測的3924個基因，另外371個是來源于TIGR（The Institute for Genomic Research）測序的TB strain CDC-1551中和前者同源性低于97%的預測基因,。
除了購買現成的核酸,，還可以通過自己合成寡核苷酸和PCR擴增模板的方法制備點樣樣品。由于自己合成Oligo成本太高,，只適于少量特殊樣品,。最常用的還是PCR擴增。一張芯片上可不只10個8個樣本,，少則上百多則上千個樣本的質粒純化,、PCR以及PCR產物純化，加上芯片上的樣品量很有限，點樣的純度必須有保證,，所以QIAGEN公司的96孔高通量核酸純化系列是最好的選擇,。一次可以純化96個樣品，大大簡化了上百個樣本純化的工作量和操作強度,。
26171 R.E.A.L. Prep 96 Plasmid Kit(4x96)——高通量堿法純化小量質粒DNA,，只需60-75分鐘即可純化96個樣品，需要96孔板離心機,。
27191 QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit(4x96)——高通量堿法純化小量質粒DNA,，采用真空抽濾的方法，只需45分鐘即可純化96個樣品,，無需96孔板離心機。質粒純度高,。
27781 QIAprep 96 M13 Kit(4x96——高通量純化M13單鏈DNA,，采用真空抽濾的方法，只需45分鐘即可純化96個樣品,。
28181 QIAquick 96 PCR Purification Kit--采用真空抽濾的方法,，利用硅膠膜技術25分鐘內從PCR反應體系中回收高純度的DNA，回收率高達90%(100bp-10kb),，可除掉 99.5 %的引物,，無需另外去除石蠟油，無需乙醇沉淀,，無需酚,、氯仿等有機試劑。純化產物可直接用于芯片點樣或測序,。
Telechem 公司：世界著名的芯片供應商,，提供各種芯片方面的耗材和試劑。其PCR產物純化試劑盒利用高級濾膜技術,，具有價格低,、通量高、速度快等優(yōu)點,。無需乙醇沉淀,，無需酚、氯仿等有機試劑,。90%以上的回收率,，99.9%的DNA純度，孔與孔之間的交叉污染小于0.01%,，每天可以純化1000個以上的樣品,。
Telechem PCR Purification Kits
384-Well PCR Purification Kit
PCR-384-01
Starter Kit (1 x 384)
￥1,320
PCR-384-10
Mini Kit (10 x 384)
￥10,648
PCR-384-50
Midi Kit (50 x 384)
￥48,246
PCR-384-100
Maxi Kit (100 x 384)
￥85,140
96-Well PCR Purification Kit For 25ul PCR Reactions
PCR-25-01
Starter Kit (1 x 96)
￥979
PCR-25-10
Mini Kit (10 x 96)
￥7,084
PCR-25-50
Midi Kit (50 x 96)
￥28,369
PCR-25-100
Maxi Kit (100 x 96)
￥53,218
96-Well PCR Purification Kit for 100ul PCR Reactions
PCR-101
Starter Kit (1 x 96)
￥1,122
PCR-110
Mini Kit (10 x 96)
￥7,788
PCR-150
Midi Kit (50 x 96)
￥31,911
PCR-100
Maxi Kit (100 x 96)
￥56,694
大規(guī)模樣品純化
對于較大規(guī)模制作芯片的用戶，由于點樣樣品數目太多，即使采用這種高通量試劑盒還是不夠方便,。這時不妨考慮分子生物學的標準工作站--全自動核酸和蛋白純化工作站,。這可不同于那種單一樣品大量純化的系統(tǒng)，而是特別適合芯片制作的很多個樣品小量純化系統(tǒng),。
隨著人類基因組,、功能組的研究不斷深入，生物芯片的研究在全世界開展的如火如荼,，它已經成為進行大規(guī)模分子生物學研究的有利工具,。但是在芯片飛速發(fā)展的今天，樣品制備已經成為芯片發(fā)展的瓶頸所在,。生物樣品往往是各種組分的混合體,，成分非常復雜，傳統(tǒng)的核酸和蛋白純化方法需要花費大量的人力,、物力,、財力，而且許多有機試劑會對人體造成不同的傷害,。如今,，您再也不用為紛繁復雜的純化過程而煩惱了，世界上聲譽卓著的核酸純化供應商--QIAGEN公司推出了全自動核酸和蛋白純化工作站--4個不同的自動純化系統(tǒng)型號：BioRobot 8000,，BioRobot 3000,，BioRobot 9604，BioRobot 9600,，加上QIAGEN優(yōu)質的多種配套純化試劑盒--從質粒,、粘粒、RNA,、血液基因組DNA,、病毒DNA到蛋白，品種豐富,，信譽卓著,，帶著德國人的嚴謹和自信，在歐美的生物醫(yī)學市場上掀起了一場革命,，各大分子生物學中心,、芯片中心、醫(yī)學中心爭相搶購,。作為國內最大的生命科學領域內的儀器和試劑供應商,，我們有理由，更有責任將這套系統(tǒng)推薦給在生命科學領域內忘我工作的科學家,，為大家分憂解難,，為促進中國的生物芯片產業(yè)發(fā)展盡牽線搭橋，為縮小與歐美在生命科學領域內的差距盡一份薄力。
BioRobot 8000:
專為基因組實驗室設計,，同時也可以用于其他分子生物學領域,。高通量、快速,、全自動核酸純化系統(tǒng),，功能強大的真空過柱、振蕩混勻及加熱制冷裝置,，無需離心即可進行核酸純化,。8通道自動移液系統(tǒng)可以對384孔板進行準確、快速地移液處理,。
特點：
1,、高通量核酸純化。
2,、速度快,、全自動樣品傳送及液面監(jiān)控。
3,、高精確處理384孔板,。
4,、提供優(yōu)質配套試劑,，結果重復性好。
5,、具有功能強大的軟件處理系統(tǒng),。
6、提供配套的優(yōu)質試劑
BioRobot 3000:
此系列為可根據客戶的不同需求量身定做的分子生物學平臺,。自動移液,，軟件功能強大，用途廣泛,。主要可以應用于：基因組或質粒DNA,，RNA純化病毒DNA，RNA純化,，6×His蛋白純化,，PCR產物純化，PCR,、測序及其它反應體系準備,，Re-arraying。
特點：
1,、根據客戶的不同需求量身定做
2,、靈活的操作系統(tǒng)、滿意的結果
3、準確的槍頭定位系統(tǒng)（根據液面不同）和液體傳輸系統(tǒng)
4,、可選擇與其他儀器（如分光光度計）連用的自動機械臂
5,、自動的樣品跟蹤和過程控制系統(tǒng)（條形碼掃描）
6、簡單易學的軟件操作系統(tǒng)
7,、提供配套的優(yōu)質試劑
BioRobot 9604,；
此儀器是專為臨床樣品和細胞培養(yǎng)液設計的核酸自動純化的分子生物學工作站?？勺詣訌呐R床診斷樣品（各種血樣,，體液，口腔刮離細胞及細胞培養(yǎng)物等）中純化基因組DNA,、質粒DNA,、RNA、病毒DNA及RNA,，還可進行PCR產物純化,，PCR樣品準備。適用于 醫(yī)院,，檢驗科分子診斷,，血庫，檢疫,，海關病毒檢測,，血液分型，法醫(yī)DNA指紋鑒定制藥公司藥物篩選等,。
特點：
滿足分子診斷所需DNA的標準的,、自動純化操作過程
滿意的得率和可信的結果
自動的樣品跟蹤和過程控制系統(tǒng)（條形碼掃描）
可同時進行2X96樣品，且有很好的可重復性
可安全處理有傳染性的樣品
配套的高質量試劑
簡單易學的軟件操作系統(tǒng)
BioRobot9600：
此儀器是為常規(guī)分子生物學研究設計的核酸純化工作站,?？梢赃M行質粒DNA，RNA純化病毒DNA,，RNA純化,， PCR產物純化，PCR,、測序及其它反應體系準備,，Re-arraying。
特點：
分子生物學標準的,、自動核酸純化操作過程
移液過程中不會造成交叉污染
配套的高質量試劑
簡單易學的軟件操作系統(tǒng)
