互補雜交要根據(jù)探針的類型、長度以及研究目的來選擇優(yōu)化雜交條件,。如用于基因表達(dá)檢測,，雜交時需要高鹽濃度、樣品濃度高,、低溫和長時間(往往要求過夜),，但嚴(yán)謹(jǐn)性要求則比較低,，這有利于增加檢測的特異性和低拷貝基因檢測的靈敏度；若用于突變檢測,，要鑒別出單堿基錯配,，需要故需要在短時間內(nèi)(幾小時)、低鹽,、高溫條件下高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交,。多態(tài)性分析或者基因測序時，每個核苷酸或突變位都必須檢測出來,，通常設(shè)計出一套四種寡聚核酸,，在靶序列上跨越每個位點，只在中央位點堿基有所不同,，根據(jù)每套探針在某一特點位點的雜交嚴(yán)謹(jǐn)程度,，即可測定出該堿基的種類。
雜交反應(yīng)還必須考慮雜交反應(yīng)體系中鹽濃度,、探針GC含量和所帶電荷,、探針與芯片之間連接臂的長度及種類、檢測基因的二級結(jié)構(gòu)的影響,。有資料顯示探針和芯片之間適當(dāng)長度的連接臂可使雜交效率提高150倍。連接臂上任何正或負(fù)電荷都將減少雜交效率,。由于探針和檢測基因均帶負(fù)電荷,，因此影響他們之間的雜交結(jié)合，為此德國癌癥研究院的Jorg Hoheisel等提出用不帶電荷的肽核酸（PNA）做探針效果更好,。雖然PNA的制備比較復(fù)雜,，但與DNA探針比較有許多特點，如不需要鹽離子,，因此可防止檢測基因二級結(jié)構(gòu)的形成及自身復(fù)性,。由于PNA-DNA結(jié)合更加穩(wěn)定和特異，因此更有利于單堿基錯配基因的檢測,。我們在這里簡單介紹一些常用雜交試劑和消耗品
對于商品化的芯片和Array類產(chǎn)品,，通常都有配套的雜交試劑以方便使用。例如：
1. Clontech公司的Altas Glass Microarrays,，產(chǎn)品已經(jīng)包含GlassHyb™ Hybridization Solution和GlassHyb™ Wash Solution,，能有效縮短雜交時間，提高信噪比,。同時還提供了方便使用的Altas Glass Hybridization Chamber,，旋蓋式的設(shè)計和1.8ml的容積，避免了傳統(tǒng)coverslip式雜交盒的弊端,?？梢詥为氋徺I,。
7899-1 Altas Glass Hybridization Chamber each
8016-1 GlassHyb™ Hybridization Solution 50ml
2. Clontech ExpressHyb Hybridization Solution快速雜交液能有效加快雜交速度，減少雜交時間,，同時提高靈敏度,。適用于各種基于膜的核酸雜交反應(yīng)，如cDNA Array,、Southern,、Northern、菌落原位雜交,，特別是Clontech公司的Altas系列,、MTN系列、MTE系列的各種膜基質(zhì)的Macroarray,。在 這些系列的產(chǎn)品中均配有快速雜交液樣品,。由于膜可以反復(fù)使用，通常需要另外購買快速雜交液,。
8015-1 ExpressHyb Hybridization Solution 250ml
8015-2 ExpressHyb Hybridization Solution 500ml
3. 對于自己制作的芯片,，可以自行配置雜交緩沖液，也可以參考Ambion公司提供的幾種Glass Array 雜交緩沖液,。SlideHyb™ Glass Array Hybridization Survey Kit是專為玻片或者尼龍膜基質(zhì)的玻片DNA Array優(yōu)化雜交條件而設(shè)計的,。由于芯片的雜交條件受多種因素的影響，Ambion認(rèn)為很難找到一種適用于所有芯片的雜交緩沖液,。在這個試劑盒中提供了4種嚴(yán)謹(jǐn)程度不同的雜交液,，供不同的需要。1號緩沖液的雜交條件是最嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?，背景最低?,、3號的靈敏度相應(yīng)提高而背景也相應(yīng)升高，4號緩沖液沒有去垢劑,。這些雜交液可以單獨購買,，連預(yù)先配好的SDS、SSC等常用緩沖液都可以在Ambion買到,。畢竟在芯片這樣精密的實驗中,，在這么小的一個點上的DNA的量是非常有限的，要得到理想的結(jié)果需要非常精確的反應(yīng)條件,。Ambion 同樣提供芯片雜交盒,，抗化學(xué)腐蝕，耐70度高溫,，一次可放三張片,。
Cat.No. Product Name Size
1860 SlideHyb™GlassArray Hybridization Survey Kit 100rxns
8861 SlideHyb™ Glass Array Hybridization Buffer#1 5 x 2 ml
8862 SlideHyb™ Glass Array Hybridization Buffer #2 5 x 2 ml
8863 SlideHyb™ Glass Array Hybridization Buffer #3 5 x 2 ml
8864 SlideHyb™ Glass Array Hybridization Buffer #4 5 x 2 ml
10040 Glass Array Hybridization Cassette 1 each
4. Ambion同樣提供適用于各種核酸膜雜交的雜交液和Wash Buffer，精心優(yōu)化的反應(yīng)條件有效提高雜交靈敏度和降低背景,，已經(jīng)經(jīng)過ULTRArray™ (Ambion), Atlas™(Clontech),，LifeGrid™ (Incyte Genomics), GeneFilter® (Research Genetics), and Panorama™ (Sigma-Genosys) arrays等產(chǎn)品驗證,。
Cat# ProductName Size
7118 Yeast RNA 10 x 10 mg/ml
8665 ULTRArray™ Hybridization Buffer 225 ml
8666 ULTRArray™ Hybridization Buffer 500 ml
8667 ULTRArray™ Low Stringency Wash Buffer 1 L
8668 ULTRArray™ High Stringency Wash Buffer 1 L
9680 Salmon Sperm DNA (sheared) 10x10 mg/ml
9763 20X SSC 1 L
9765 20X SSC 4 x 1 L
9780 RNaseZap® 250 ml
圖象的采集和分析
當(dāng)生物芯片和樣品探針雜交完畢后，就需要對雜交結(jié)果進行圖象采集和分析,。一般膜芯片的雜交都用同位素p32,、p33作標(biāo)記，其信號的檢測需通過傳統(tǒng)的磷光成像系統(tǒng)來完成,。而對于用熒光標(biāo)記的玻璃芯片雜交后的檢測,，則需要用專門的熒光芯片掃描儀。
1. 磷感屏成像系統(tǒng)Cyclone Storage Phosphor System
Cyclone磷屏成像系統(tǒng)為美國Packard公司生產(chǎn)的第一臺集高分辨率,、高靈敏度和5個數(shù)量級的線性范圍于一身的計算機控制數(shù)字化自動放射成像分析系統(tǒng),，由于其使用方便、快捷,、自動化程度,、分辨率、圖像清晰度均很高,，既可定位亦可定量,，目前已廣泛應(yīng)用于核醫(yī)藥學(xué)、細(xì)胞與分子生物學(xué),、生物化學(xué),、藥理學(xué)、基因工程學(xué),、藥物代謝動力學(xué),、放射免疫及受體免疫等多方面實驗研究，成為十分方便的有力工具,。其優(yōu)異品質(zhì)主要得益于Packard專利的激光技術(shù)和共聚焦成像系統(tǒng)。應(yīng)用范圍為我們前面介紹的DNA Macroarray以及Northern,、Southern,、Western Blot.，手工測序,，放射性原位雜交等的同位素結(jié)果檢測,。使用Cyclon磷屏可以大大縮短研究周期，獲得清晰的分辨率,。
其工作原理在于：同位素標(biāo)記的雜交結(jié)果在磷屏上曝光,，曝光過程32P等核素核衰變同時發(fā)射β射線，首先激發(fā)磷屏上分子,，使磷屏吸收能量分子發(fā)生氧化反應(yīng),，以高能氧化態(tài)形式儲存在磷屏分子中。激光掃描磷屏,，對于激發(fā)態(tài)高能氧化態(tài)磷屏分子發(fā)生還原反應(yīng),，即從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時多余的能量以光子形式釋放,，從而在PMT捕獲進行光電轉(zhuǎn)換，磷屏分子回到還原態(tài),。計算機接受電信號,，經(jīng)處理形成屏幕圖像，并進一步分析和定量,。一般化學(xué)發(fā)光物質(zhì)如熒光染料標(biāo)記樣品成像過程與放射性類似,。
系統(tǒng)特點
放射性自顯影成像系統(tǒng)。儲存式磷屏根據(jù)不同樣品厚度,、射線能量有多種型號磷屏可供選擇,，磷屏可以多次重復(fù)使用。
靈敏度較X光片高數(shù)十倍,，可以檢測最弱的信號,。曝光時間可以縮短20倍以上。
快速成像,，從對磷屏進行掃描到獲得完整的的數(shù)字化圖像,，總共需要不到10min的時間，實時圖像顯示,，同時立即報告分析結(jié)果,。
可對放射性位置和強度進行相關(guān)的定位、定量分析,，寬達(dá)105的線性范圍,，定量準(zhǔn)確。
不需膠片,、暗室設(shè)備,、沖洗底片，一步到位完成分析過程,。
可選配Ouant ArrayTM 軟件,，用于尼龍膜上同位素標(biāo)計的Gene Array定量分析。
2. 熒光芯片掃描儀
由于雜交時產(chǎn)生序列重疊,，會有成百上千的雜交點出現(xiàn)在圖譜上,，形成極為復(fù)雜的雜交圖譜。序列重疊雖然可為每個堿基的正確讀出提供足夠的信息,，可提高序列分析的可靠性,，但同時信息處理量也大大增加了。一般說來,，這些圖譜的多態(tài)性處理與存儲都由專門設(shè)計的軟件來完成,，而不是通過對比進行人工讀譜。用計算機處理即可給出目的基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)信息。掃描一張10cm2的芯片大概需要2-6分種的時間,。目前專用于熒光掃描的掃描儀根據(jù)原理不同大致分為兩類：一是激光共聚焦顯微鏡的原理, 是基于PMT（photomultiplier tube,，光電倍增管）的檢測系統(tǒng)（另文介紹）；另一種是CCD（charge-coupled devices,，電荷偶合裝置）攝像原理檢測光子,。CCD一次可成像很大面積的區(qū)域，而以PMT為基礎(chǔ)的熒光掃描儀則是以單束固定波長的激光來掃描,，因此或者需要激光頭,，或者需要目的芯片的機械運動來使激光掃到整個面積，這樣就需要耗費較多的時間來掃描,；但是CCD有其缺點：目前性能最優(yōu)越的CCD數(shù)字相機的成像面積只有16×12mm（像素為10μm）,，因此要達(dá)到整個芯片的面積20×60mm的話，需要數(shù)個數(shù)碼相機同時工作,，或者也可以以降低分辨率為代價來獲得掃描精度不是很高的圖像,。由于靈敏度和分辯率較低，比較適合臨床診斷用,。
生產(chǎn)商業(yè)化掃描儀的公司包括：Genomic Solutions公司,、Packard公司、GSI公司,、Molecular Dynamics,、Genetic Microsystems公司、Axon ?Instruments公司等,。其中GSI Lumonics 公司ScanArray 系列一直是生物芯片掃描檢測系統(tǒng)中的領(lǐng)頭產(chǎn)品,。2000GSI并入著名的Parkard公司后ScanArray的軟、硬件都得到進一步加強,。
ScanArray利用其專利的激光共聚焦光學(xué)系統(tǒng),，通過計算機控制，對生物芯片的熒光雜交信號進行全自動的掃描采集,，并通過分析軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進行定量分析,。
最高靈敏度高：<0.1熒光分子/μm
掃描精度可從5μm-50μm分級調(diào)整
全范圍掃描時間僅需5分鐘，快速方便
多達(dá)十種檢測濾光片,，涵蓋所有生物芯片熒光染料的檢測，適用于多種熒光標(biāo)記探針
不同波長依次掃描避免交叉光污染
掃描后的圖像還需要進一步的處理,，這要求一定的軟件支持?，F(xiàn)有的分析軟件包括：Biodiscovery的ImaGene系列，Axon Instruments的GenePix系列,，GSI的QuantArray等
3. 基因芯片上各克隆熒光信號的分析原理
用激光激發(fā)芯片上的樣品發(fā)射熒光,，嚴(yán)格配對的雜交分子，其熱力學(xué)穩(wěn)定性較高,，熒光強,；不完全雜交的雙鍵分子熱力學(xué)穩(wěn)定性低,，熒光信號弱（不到前者的1/35~1/5），不雜交的無熒光,。不同位點信號被激光共焦顯微鏡,，或落射熒光顯微鏡等檢測到，由計算機軟件處理分析,，得用激光激發(fā)芯片上的樣品發(fā)射熒光,，嚴(yán)格配對的雜交分子，其熱力學(xué)穩(wěn)定性較高,，熒光強,；不完全雜交的雙鍵分子熱力學(xué)穩(wěn)定性低，熒光信號弱（不到前者的1/35~1/5）（2）,，不雜交的無熒光,。不同位點信號被激光共焦顯微鏡，或落射熒光顯微鏡等檢測到,，由計算機軟件處理分析,，得到到有關(guān)基因圖譜。美國GSI ?Lumonics 公司開發(fā)出專專業(yè)基因芯片檢測系統(tǒng)(ScanArray 系列),采用激光共聚焦掃描原理進行熒光信號采集,，由計算機處理熒光信號,，并對每個點的熒光強度數(shù)字化后進行分析。利用QuantArray軟件包對掃描的熒光信號進行分析,，比
較每個克隆在不同組織間表達(dá)水平的差別,。軟件具體分析步驟如下：
首先，同時導(dǎo)入同一區(qū)域兩個channel掃描的圖像文件,；將兩個channel掃描的圖像用不同的顏色顯示并重疊,；選擇擬分析的區(qū)域，輸入矩陣的行數(shù)及列數(shù)以及矩陣的個數(shù)等參數(shù),；在計算機給出的該區(qū)域信號圖片上標(biāo)定網(wǎng)格,，使得網(wǎng)格中所包含的橫線和豎線的交點個數(shù)同每個區(qū)域點樣的克隆數(shù)相同，調(diào)整網(wǎng)格,，使每個交點均位于點樣克隆信號的中心,；信號的中心確定后，計算機將自動以交點為中心,，按照設(shè)定的半徑圈定各克隆,，并將其內(nèi)部區(qū)域作為待分析的信號，同時在圈定的各克隆周圍再按照預(yù)設(shè)的值圈定一定范圍的區(qū)域,，將該區(qū)域內(nèi)的信號作為背景噪音,；計算機分析每個克隆扣除背景噪音后的信號強度，并按照不同的要求對數(shù)據(jù)進行分析；利用GenePie方式對兩個channel信號的進行定量比較分析,，此時計算機根據(jù)各克隆兩個channel掃描的信號,，以餅圖的形式給出兩個channel信號強度的相對比例，同時可以逐個克隆讀取計算機分析出的兩個channel信號的值及所占的比例,，進而確定各克隆在兩種組織間的表達(dá)差異,。
4. Microarray數(shù)據(jù)分析
Microarray數(shù)據(jù)分析簡單來說就是對Microarray高密度雜交點陣圖象處理并從中提取雜交點的熒光強度信號進行定量分析，通過有效數(shù)據(jù)的篩選和相關(guān)基因表達(dá)譜的聚類,，最終整合雜交點的生物學(xué)信息,，發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)譜與功能可能存在的聯(lián)系。
Microarray數(shù)據(jù)分析主要包括圖象分析(Biodiscovery Imagene 4.0\Quantarray分析軟件),、標(biāo)準(zhǔn)化處理（normalization）,、Ratio值分析、基因聚類分析（Gene Clustering）,。
1. 圖象分析：激光掃描儀Scaner得到的Cy3/Cy5圖象文件通過劃格（Griding）,，確定雜交點范圍，過濾背景噪音,，提取得到基因表達(dá)的熒光信號強度值,，最后以列表形式輸出。
2. 標(biāo)準(zhǔn)化處理（Normalization）：由于樣本差異,、熒光標(biāo)記效率和檢出率的不平衡,，需對cy3和cy5的原始提取信號進行均衡和修正才能進一步分析實驗數(shù)據(jù)，Normalization正是基于此種目的,。Normalization的方法有多種：一組內(nèi)參照基因（如一組看家基因）校正Microarray所有的基因,、陽性基因、陰性基因,、單個基因,。
3. Ratio分析(Ratio Analysis)：cy3/cy5的比值，又稱R/G值,。一般0.5-2.0范圍內(nèi)的基因不存在顯著表達(dá)差異,，該范圍之外則認(rèn)為基因的表達(dá)出現(xiàn)顯著改變。由于實驗條件的不同,，此域值范圍會根據(jù)可信區(qū)間有所調(diào)整,。處理后得到的信息再根據(jù)不同要求以各種形式輸出，如柱形圖,、餅形圖,、點圖、原始圖象拼圖等,。將每個Spot的所有相關(guān)信息如位標(biāo),、基因名稱、克隆號,、PCR結(jié)果,、信號強度、Ratio值等自動關(guān)聯(lián)并根據(jù)需要篩選數(shù)據(jù),。每個Spot的原始圖象另存文件,，可根據(jù)需要任意排序，得到原始圖象的拼圖,，對于結(jié)果分析十分有利,。
4. 聚類分析(Clustering Analysis)：實際是一種數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。通過建立各種不同的數(shù)學(xué)模型,，可以得到各種統(tǒng)計分析結(jié)果,，確定不同基因在表達(dá)上的相關(guān)性，從而找到未知基因的功能信息或已知基因的未知功能,。Gene Clustering就是根據(jù)統(tǒng)計分析原理,，對具有相同統(tǒng)計行為的多個基因進行歸類的分析方法，歸為一個簇的基因在功能上可能相似或關(guān)聯(lián),。目前以直觀圖形顯示GeneCluster結(jié)果的程序已有人開發(fā)出來,，可將抽象的數(shù)據(jù)結(jié)果轉(zhuǎn)化成直觀的樹形圖，便于研究人員理解和分析,。
盡管基因芯片技術(shù)受到了廣泛關(guān)注,，但在基因表達(dá)譜分析中起著關(guān)鍵作用的生物信息學(xué)卻沒能引起大家的足夠重視，認(rèn)為簡單人工處理一下原始數(shù)據(jù)就可以得到有價值的生物學(xué)信息,，大量有價值的信息就這樣被浪費和湮沒了,。可以肯定地說,，沒有生物信息學(xué)的有效參與,，基因芯片技術(shù)就不能發(fā)揮最大效能。加大基因芯片技術(shù)中生物信息學(xué)的研究開發(fā)力度已成為當(dāng)務(wù)之急,。國內(nèi)外已經(jīng)進行了有益的嘗試,，初步開發(fā)出供芯片平臺管理實驗數(shù)據(jù)的軟件包，就目前實際情況來看,，生物信息學(xué)在基因芯片研究開發(fā)中介入的程度已經(jīng)越來越深,，主要涉及基因表達(dá)信息分析管理系統(tǒng)及其分析工具和分析方法，簡單概括為以下幾個方面：
基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫
基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫是整個基因表達(dá)信息分析管理系統(tǒng)的核心,。Microarray數(shù)據(jù)庫起著數(shù)據(jù)儲存和查詢,、各種相關(guān)信息的整合的作用,。Microarray數(shù)據(jù)庫可以包含用戶的管理信息,、原始實驗結(jié)果（圖象文件、信號強度值,、背景平均值行列號,、基因號等）、各種實驗參數(shù)（Plates/unigene/Sets/Clusters）,、探針相關(guān)信息,、 clone相關(guān)信息（基因名稱,、基因序列,、GenBank accession號,、克隆標(biāo)志符（IMAGE和內(nèi)部）,、代謝途徑標(biāo)志符、內(nèi)部克隆標(biāo)志符）、分析處理結(jié)果,、芯片設(shè)計相關(guān)的資源和數(shù)據(jù)，等等,。
分析方法：
選擇分析方法的基本標(biāo)準(zhǔn)：能夠簡化原始數(shù)據(jù),，結(jié)果直觀,，使研究者能在海量基因表達(dá)數(shù)據(jù)中解析出正確的基因表達(dá)譜和功能信息。一個理想的分析方法是建立在合理的算法基礎(chǔ)之上的，應(yīng)該能全面綜合并直觀地解析原始數(shù)據(jù),，修正已有數(shù)據(jù),，并從結(jié)構(gòu),、序列,、功能之間找到新聯(lián)系,。目前已有報道用于microarray數(shù)據(jù)分析的方法主要有以下幾種：
手工分類法（Manual classification Method）
該方法在Botstein 實驗室的Michael Eisen提出新的分析方法之前是唯一用來分析microarray數(shù)據(jù)的方法,。其基本原理是通過對microarray的ratio值從大到小排序，篩出表達(dá)顯著性改變的基因,。結(jié)果可直觀地從二維plot圖得到。優(yōu)點是能夠有效篩選潛在的腫瘤標(biāo)記基因和藥物靶位點,；可以構(gòu)建多組基因誘導(dǎo)或抑制的時間表達(dá)譜。缺點是結(jié)論過于簡單；很難發(fā)現(xiàn)更高層次功能線索；處理耗時且不能充分利用數(shù)據(jù),，也不能發(fā)現(xiàn)實驗錯誤,。
非監(jiān)督聚類法(Unsupervised Clustering)又稱配對平均連鎖聚類分析(Pairwise average-linkage cluster analysis)。該方法是分層聚類的一種形式,，非常類似系統(tǒng)發(fā)生分析,。該方法是基于標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)系數(shù)的計算。K -mean方法是unsupervised聚類法的一個變化,，目前Stanford University 的Botstein實驗室和NHGRI的Trent實驗室都采用該分析方法,。
混合聚類法(Hybrid clustering approach)該聚類方法通過將每一數(shù)據(jù)點傅立葉變換尋找那些表達(dá)呈周期性變化的基因,，比如細(xì)胞周期涉及的基因,。所謂混合聚類就是先unsupervised聚類再supervised聚類,。優(yōu)點是可以整合以前手工聚類法得到的數(shù)據(jù),；尤其適合確認(rèn)細(xì)胞周期調(diào)控的特征性表達(dá)譜。
神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法(Neural network approach)運用自組織圖（Self organizing maps）并結(jié)合supervised法進行聚類。優(yōu)點是分類標(biāo)準(zhǔn)明確,；優(yōu)化的次序好于其它聚類法,；用一種次序風(fēng)格處理大量數(shù)據(jù)易于被生物學(xué)家接受,。
生物芯片（DNA微陣列）熒光掃描儀中的激光共聚焦掃描技術(shù)
吳嵐君
（北京放射醫(yī)學(xué)研究所 100850）
所有的微陣列上的熒光須經(jīng)熒光掃描裝置來分析其上的熒光強度和分布,，在這些裝置中,，激光共聚焦掃描儀具有優(yōu)越的性能，能獲取高質(zhì)量的圖像和數(shù)據(jù)，本文將分別介紹微陣列的相關(guān)特性和各種類型的微陣列掃描儀,，激光共聚焦掃描儀的設(shè)計和關(guān)鍵特性，另外還將介紹一種已商品化的激光共聚焦熒光掃描裝置,。
微陣列是由分子整齊排列于固相表面，這些分子與熒光分子結(jié)合，測定熒光分子的強度后可推知結(jié)合分子的濃度。固相部分主要有經(jīng)過表面化學(xué)處理的玻璃片如22mmχ75mm的載玻片。在微陣列上包被的分子常常能與多種熒光探針通過化學(xué)鍵相互作用而聯(lián)結(jié)，通常情況下能聯(lián)結(jié)兩種熒光分子，例如在檢測不同樣品的基因表達(dá)的區(qū)別時,，可將其中一樣品（如正常組織）標(biāo)記上發(fā)綠光的熒光分子,，將另一種樣品如腫瘤組織或發(fā)病組織標(biāo)記上另一種發(fā)紅光的熒光分子,，用兩種波長的激光激發(fā)微陣列上的樣品,，通過比較兩種熒光在微陣列上某點的比例得知某類基因在兩種組織中的差異,。
微陣列上有樣品組成的點陣,，除了點之外，余下的是背景,。如果玻璃片未經(jīng)過表面化學(xué)處理,，樣品在玻片上結(jié)合不牢固，且容易擴散，造成背景高,。若玻璃片經(jīng)過表面化學(xué)處理后,，點樣的樣品在微陣列上結(jié)合牢固，點的直徑小,，不擴散，從而點的密度增加,，在進行熒光數(shù)據(jù)分析時,，儀器將點上的熒光強度與點周圍的背景強度相比較，如果背景中含有與熒光波段相一致的物質(zhì),，則背景強度增高,，樣品的熒光信號將減弱，干擾信號的讀取,。
點陣上的點直徑范圍為25mm-500mm,，通常目前能達(dá)到的直徑為100mm±50，科學(xué)家們正在努力減小直徑,。因為點直徑的變化對掃描結(jié)果的讀取產(chǎn)生影響,，如果點的直徑大，熒光分子擴散的范圍也大,，則觀察到的熒光強度相對較弱,。
若在玻片上有灰塵或其它雜質(zhì)如衣物纖維、皮屑,、指紋等,，掃描結(jié)果將受到影響。微陣列上的點干燥后形成很薄的層,，使得激光共聚焦掃描成為可能,，精心地調(diào)整掃描儀的焦距，可避免檢測出不需要的背景雜質(zhì),，包括微陣列上的灰塵,、玻璃中自帶的熒光雜質(zhì)產(chǎn)生的干擾信號均可通過激光共聚焦的方式將其減少到最低程度,。因為雜交因素影響，在微陣列上點與點之間的熒光強度差別很大,。對微陣列掃描儀的要求要能夠有較寬范圍的靈敏度,，通常來說，靈敏度調(diào)整范圍為10000：1,。
當(dāng)熒光化合物或染料受到激光激發(fā)后將釋放出熒光,，在某一波長下有一最高釋放強度。各種熒光化合物有各自特定的激發(fā)吸收值,。如圖1是FITC的波長對熒光激發(fā)強度曲線,。從曲線圖可見，在494納米波長下,，有一激發(fā)高峰,，在518納米下有一釋放高峰，釋放與激發(fā)高峰波長相差24納米,，這一現(xiàn)象在微陣列使用的染料中較普遍,。兩高峰波長的差值在專業(yè)上稱之為Strokes shift, 初看曲線圖人們可能會以為：FITC在510納米的波長激發(fā)下，在475-510納米范圍內(nèi)將釋放部分熒光,，其實并不盡然,；釋放波長一般情況下大于激發(fā)波長，在圖中的激發(fā)曲線不是與釋放曲線同時繪制的,，將它們放在同一坐標(biāo)圖中是為了便于觀看,，其實它們是兩套不同的數(shù)據(jù)。激發(fā)曲線的繪制過程如下：在單一長波長下,，變換激發(fā)波長在不同波長下測定熒光釋放強度,，釋放熒光曲線的繪制過程則是在最長激發(fā)波長下開始增加波長，測定在不同波長下的熒光釋放強度,。微陣列掃描儀設(shè)計者通過閱讀和分析某中熒光染料的激發(fā)曲線和釋放曲線來確定適合某種染料的復(fù)合掃描激發(fā)波長,，該波長的激發(fā)效率至少要達(dá)到50-70%的水平。激發(fā)波長要避免太接近釋放高峰對應(yīng)的波長,，否則熒光信號受到干擾,。所以應(yīng)在峰值的左邊選擇一激發(fā)波長。如對FITC來說,，建議的激發(fā)波長在470-495nm.熒光釋放強度在某一范圍內(nèi),，與激發(fā)光的強度成正比,，當(dāng)熒光釋放達(dá)到最高峰后,，增加激發(fā)光強度卻不能提高釋放強度，因為熒光釋放已經(jīng)達(dá)到飽和或光子將染料破壞淬滅,。微陣列上各點的熒光分子受到激發(fā)后,，從各個方向釋放熒光光子,，散射成球狀，所以掃描儀須將這些散射的光子采集到,，由于掃描儀的使用的是很低的釋放光,，幾何球狀是設(shè)計掃描設(shè)備的主要根據(jù)。
圖1 FITC的波長對熒光激發(fā)強度曲線
微陣列掃描儀可有多種設(shè)計類型,，但任何類型的微陣列掃描儀都有以下基本功能：
激發(fā)光
激發(fā)光的產(chǎn)生源有多種,，如激光、氬燈,、LEDs或鎢絲燈,。激發(fā)光的波長要避免將釋放光的波長覆蓋或重疊。對于LEDs或鎢絲燈需用濾光器來選擇某種特定波長的光,。激光的波長單一不需要濾光器來選擇某種特定波長的光,。燈泡光源可產(chǎn)生多個波長的激發(fā)光，通過多個濾光器可選擇多種特定的波長以滿足激發(fā)不同熒光的需要,。激發(fā)光應(yīng)直接射向微陣列上的待測樣品,，通過大量一次照明的方式，待測樣品的大部分區(qū)域同時受到激發(fā),，這種方式在CCD數(shù)碼相機中較常見,，該方式的缺陷是待測樣品的受到得激發(fā)光不夠均勻一致。這點是儀器設(shè)計者須考慮到的重要因數(shù)之一,。另一種方式是：激發(fā)光聚焦于樣品的很小部分,，采用特定的光線采集和定位，聚焦點上的激發(fā)光光線密度較高,，大約為10000watt/cm2,。激發(fā)波長的選擇是依據(jù)染料的激發(fā)曲線和釋放曲線的峰值來確定的，在染料激發(fā)峰值的左邊且激發(fā)效率較高的范圍內(nèi),，在某種染料水平下,，激發(fā)效率越低，要達(dá)到某種光強,，則需要向樣品上發(fā)射的光越多,。過多的發(fā)射光將通過光漂白作用破壞樣品和污染干擾釋放光的信號。
釋放光采集
熒光由目鏡的鏡頭來采集,，該鏡頭聚焦于樣品上并將一定區(qū)域內(nèi)的光線收集到裝置,。收集的角度區(qū)域的大小非常關(guān)鍵，熒光釋放是球形的,，目鏡對熒光的采集范圍是決定儀器的采集效率關(guān)鍵指標(biāo)之一,。目鏡采集光的角度由數(shù)值孔徑來表示，圖2表示了數(shù)值孔徑與光采集效率之間的變化關(guān)系,。當(dāng)數(shù)值孔徑為1.0時,，目鏡將收集到整個半球的光,，相應(yīng)的光采集效率為50%。在許多激光共聚焦微陣列掃描儀的數(shù)值孔徑在 0.5-0.9, 而CCD-掃描儀的數(shù)值孔徑為0.2-0.5,。有其他類型的掃描儀不用目鏡而是使用積分球面鏡來采集釋放的部分光源,，但是部分光線經(jīng)過多次球面反射而衰減。還有一些無散光收集裝置,，僅僅是將探測器放在樣品的某一區(qū)域的上方,，光線采集的效率受限于樣品被照明處的范圍及探測器的視角，例如,，一個直徑為25mm的探測器放在激發(fā)點上方100mm處,，其實際的有效數(shù)值孔徑為0.12。圖2顯示目鏡的不同數(shù)值孔徑與光采集效率的關(guān)系,。
圖2 目鏡的不同數(shù)值孔徑與光采集效率的關(guān)系
空間定位
是指對樣品上的某一小區(qū)域上的熒光信號進行熒光強度計算,，微陣列上的各點樣品被分割為許多微小的像素，在進行熒光信號定量時,，空間分辨率必須高于個點的大小,，如微陣列上各點的直徑為100mm，則像素的大小為5-20mm,?？臻g定位可通過多元素探測器，如CCD或機械掃描裝置,。許多相機設(shè)置為大范圍照明,，探測器直接提供由許多像素組成的圖象，該方法的缺陷是CCD提供的目鏡數(shù)值口徑較小,，后方照明及維持系統(tǒng)冷卻設(shè)備價值昂貴,，由于光散射會導(dǎo)致像素之間交叉重疊造成信號不夠清晰。機械掃描過程包括以下幾個步驟：將激發(fā)光束聚焦于某一大小同像素差不多的點上,，用單一元素的探測器采集那一小點上的釋放光,。要將整個樣品掃描完全，則需移動樣品或用一微小的反光鏡使激光束移動掃描樣品,。雖然掃描裝置增加了機械裝置的復(fù)雜程度,，但比起CCD相機來，機械掃描可達(dá)到的數(shù)值孔徑更高,，有更好的空間選擇性,，探測器也較便宜些。在低強度的光源下,，高光線采集率是至關(guān)重要的,。
激發(fā)/釋放分辨
微陣列上各點的熒光釋放強度通常要比激發(fā)光強度弱幾個數(shù)量級，要從激發(fā)光中檢測出微弱的熒光信號,，就需要對這兩種類型的光進行分離,，由于光束中的光波長不相同,，可利用光波分離將不同的光分開,。許多裝有目鏡的掃描儀采用的是表面照明方式,，激發(fā)光束與釋放光束從樣品到目鏡經(jīng)過同樣的路徑只是方向相反。這種途徑使得從樣品上反射和散射的光與熒光束混合在一起,，所以需要用光束分離器對混合光進行分離,。一種類型的光束過濾器是色彩二向或多向過濾器。它將激發(fā)光束反射并把釋放光束以一較長的波長傳輸,。這種濾光器對一,、二或三種不同的激發(fā)/釋放光都可進行較好的分離，但若超過四種以上的混合光束則分離有困難,。另外一種類型的光線分離器稱為幾何光線分離器,，如圖3所示，在掃描系統(tǒng)中,，目鏡的數(shù)值孔徑為0.6,，像素的大小為10mm，從目鏡出來的激發(fā)光束比釋放光束細(xì),，一個小反光鏡將激光束反射但是讓環(huán)形部分的釋放光束通過,，其分離效果與波長光束分離器相同。從理論上來說,，光束分離器可以完全將激發(fā)和釋放光束分開,，但實際上并非如此，通常在探測器前放濾光片過濾釋放光束,。這些濾光片只允許染料的釋放高峰附近很窄的一段波長的光通過,，而其他波長的光包括激發(fā)光都被阻擋了。這是微陣列掃描儀必需的的第二道光束分離裝置,。有的掃描儀不用光束分離器而是將激發(fā)光束和釋放光束放在不同的軸上,。該方法能將釋放光路徑的激發(fā)光發(fā)射回去，但卻難以達(dá)到較高的數(shù)值孔徑,，因為目鏡離樣品很近,，通常小于1毫米，所以激發(fā)光束能進入目鏡的角度范圍很小,。其他具有區(qū)分不同波長光束的裝置有棱鏡,、光柵等，這些裝置還可產(chǎn)生一些特殊的作用如連續(xù)的光波調(diào)諧功能,。然而,，在微陣列中，由于要求對激發(fā)光有高度的敏感性,，因而對釋放光裝置也相應(yīng)要求有很高的精密度,。
圖3 在上位照明掃描儀中的光束分離器
檢測熒光掃描儀的探測器
將微弱的熒光信號轉(zhuǎn)化為電信號,在微陣列掃描儀中的光線探測器有：光電倍增管,、CCD點陣探測器、雪崩光電二極管,。各種裝置有其優(yōu)點也有其缺點,。不同檢測范圍的儀器要根據(jù)它們各自的特點來選擇合適的探測裝置。光電倍增管在可見光波范圍內(nèi)是最靈敏的探測器,，它屬于單點探測器并要求掃描系統(tǒng)對微陣列上的樣品進行空間定位,，通過改變電壓可以很方便地改變光電倍增管的靈敏度。光電倍增管的靈敏度在紅外及近紅外波長范圍內(nèi)降低得很快,，所以它們的用途主要限制在可見光波長范圍內(nèi),。CCD對微弱信號的放大功能不及光電倍增管，因而需要額外的放大系統(tǒng)來將信號放大才能達(dá)到光電倍增管的靈敏度范圍的上限,。其主要的缺點是：CCD探測器的實際數(shù)值孔徑難以達(dá)到06-09的范圍,在低亮度背景下,限制微弱信號被檢測出來, 另外CCD探測器不能與共聚焦系統(tǒng)相兼容;但是在高亮度背景下, 因為CCD探測器有內(nèi)置式掃描功能,其優(yōu)越性就體現(xiàn)出來了,。
所有的微陣列掃描儀都有固定和放置微陣列固相基質(zhì)的裝置，我們稱之為掃描儀的載樣盒,。載樣盒要有能夠容納下玻片的空間,，組成其的材料應(yīng)能經(jīng)受的住上千次取放樣品的刮擦考驗。通常微陣列的固體介質(zhì)為顯微載玻片,，還有塑料片,，但是塑料片不如玻璃片剛硬，容易變形,，不易聚焦準(zhǔn)確,，所以多數(shù)研究者使用的是顯微載玻片。掃描檢測時通常是在室溫下進行,，此時玻片上各點樣品已經(jīng)干燥,，然而，有些染料如FITC在潮濕的環(huán)境下才能釋放出強烈的熒光,，所以研究者們在待測樣品上滴加適量的緩沖液,，然后蓋上蓋玻片進行觀察。這就需要載樣盒能夠容納載玻片與蓋玻片疊加之后的厚度,，掃描儀在掃描時聚焦于蓋玻片下的那一層平面進行掃描,。
以下要介紹共聚焦掃描微陣列的工作原理，顧名思義,，共聚焦掃描儀將視野中的兩個聚焦點的影象裝配為二維圖象,，工作過程如所示：平行的激光束通過光束分離器后進入目鏡，目鏡采集到部分球狀散射的熒光釋放光并使這些光成為平行的光束,，此外還采集被反射的激光,，這些激光的強度要比熒光強度大3-7倍。采集回來的光束再次通過光束分離器，光束分離器將大部分激光反射回激光源處,，并允許大部分熒光束通過光束分離器,，一面平面鏡將熒光束反射到釋放光柵處，光柵選擇很窄范圍波長的光通過,，并將剩余的激光激發(fā)光全部反射回去,。共聚焦的工作特點體現(xiàn)在探測目鏡和開了一個針孔大的孔的光線擋板上，探測目鏡將平行光聚集為很小直徑的一束光之后,，擋板上的小孔只允許聚焦的光線通過并將其余的光遮擋住,。圖5顯示若發(fā)光點不在目鏡焦點范圍內(nèi),，則光線將被探測目鏡聚集于擋光板前,，散射之后大部分光線被遮擋了，只有焦點范圍內(nèi)的光線才能有效地進入當(dāng)光板的小孔被探測器檢測到,。對焦距范圍的嚴(yán)格限制使得灰塵或近表面的小顆粒均不能成像被探測到,，因而共聚焦掃描儀獲得圖象的信噪比要高于非共聚焦掃描裝置。但另一方面,，對焦距范圍的嚴(yán)格限制要求載玻片擺放非常平穩(wěn),，掃描運動過程中載樣盒要保持在同一水平面上，偏差要小于焦距的范圍,，偏差小于±10mm,。這一要求增加了機械加工的精密度，使得加工工藝更加復(fù)雜,，但這是保證獲得最佳圖象質(zhì)量的有效途徑之一,。
圖4共聚焦掃描的工作原理
圖5目鏡焦點范圍之外的光線被遮擋
由于激光共聚焦于載玻片上的一點上,要獲得整張玻片上的各點的熒光信息則要對玻片各點進行掃描成像?？赏ㄟ^移動掃描器或移動目鏡和載玻片來實現(xiàn)上述功能,。掃描器移動后要求目鏡能采集到熒光釋放光束，這樣的目鏡很復(fù)雜且數(shù)值孔徑不超過0.3,，較為簡單的并且采集光效率高的辦法是移動目鏡或載玻片,，但移動的物體大勢必影響掃描速度。不過在弱光環(huán)境下,，圖象讀取速度取決于探測到的光子的累積量,，所以即使掃描速度快而光采集效率低的話圖象讀取信號也未必快。
所有的掃描儀都會面臨同樣的一個問題,，即如何將背景降低并提高待測樣品的信號,。共聚焦技術(shù)的應(yīng)用使得共聚焦掃描儀能比其它類型的掃描儀獲得更高質(zhì)量的圖像信號。在共聚焦掃描儀中有光束分離器及釋放光柵將熒光信號分離并傳輸給探測器,，而將激發(fā)光和雜質(zhì)產(chǎn)生的光反射回去并阻擋它們到達(dá)探測器,。探測器是光電倍增管，其靈敏度高，可探測到一個光子的存在,，光電倍增管內(nèi)的功率放大器可將光信號轉(zhuǎn)化為電信號并放大100萬倍,，通過調(diào)整電壓輸出可改變光電倍增管的靈敏度范圍，微陣列上不同樣品的制備過程導(dǎo)致對儀器靈敏度要求不同,，內(nèi)置式的可調(diào)靈敏度裝置恰好可適應(yīng)這些不同的變換,。傳統(tǒng)的硅探測器如PIN光電二極管，沒有內(nèi)置放大裝置,，在可見光范圍內(nèi)靈敏度很低,，因而需要外置的功率放大器，這就增加了雜訊,，降低了信噪比,。硅探測器在800-900nm范圍內(nèi)有一波長應(yīng)答高峰，因此用它們探測近紅外范圍的染料較為理想,。光電倍增管通常在500nm左右范圍內(nèi)有一波長應(yīng)答高峰,，高于650nm后則靈敏度迅速降低。它們適用于大部分可見光范圍的染料,。
微陣列掃描儀靈敏度范圍要求：在微陣列樣品制備過程中,，步驟較多，如PCR反應(yīng),、雜交反應(yīng)條件變化多,、試劑存儲條件不同、不同類型的基因表達(dá)等因素的影響,，即使適用相同的染料,，其亮度也可能相差1000倍，在同一快微陣列上的熒光強度范圍可達(dá)到4000:1的范圍,。大部分掃描儀的熒光強度讀取范圍在4000-16000,，若不改變儀器的靈敏度范圍，就無法適應(yīng)各種熒光強度樣品的讀取,。調(diào)整儀器靈敏度范圍的方法有兩種：其一是改變激發(fā)光的強度,，用激光衰減器可調(diào)整改變激發(fā)光的強度其可調(diào)范圍至少為100：1。其二是改變光電倍增管的靈敏度,，通過變化輸入電壓的大小,，光電倍增管的靈敏度改變范圍至少為100：1。兩項調(diào)整方式可相互疊加使得儀器的調(diào)整范圍增加到10000：1,，這一范圍對普通的掃描儀都足夠了,。通常人們希望使用的激光強度大而不破壞樣品上的熒光分子，我們已經(jīng)知道,，激光強度越大激發(fā)的熒光光子越多,，信號也越清楚和強烈,。但是若樣品經(jīng)過多次掃描后，被破壞的熒光光子將增加,，所以要將熒光強度降低以防樣品上的熒光淬滅,。
信號轉(zhuǎn)換及采樣過程：由被激發(fā)的熒光染料產(chǎn)生的光學(xué)信號將通過一系列過程轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)碼信號。熒光信號是由一系列隨機的光子釋放累加而成,。若將它們累計可與某一樣品區(qū)域的染料分子的密度相關(guān),。通常掃描儀對空間上和時間上探測到的熒光光子的數(shù)量都加以累計并取平均值才能代表某一樣品區(qū)域的染料分子的密度。被掃描的區(qū)域被分為大小相同的像素,。激光共聚焦和其它點-照明式掃描儀對逐個像素進行激發(fā),，然后探測器累加各像素點上熒光釋放分子。將光信號轉(zhuǎn)化為電信號并數(shù)值化,。各像素的數(shù)碼分辨率可達(dá)到16-比特,，當(dāng)掃描圖像正在進行時，顯示器要顯示圖像以供掃描者作初步的分析,，掃描過程結(jié)束后可將圖像保存為圖像格式文件如TIFF格式,，這種格式的圖像文件時目前用途較廣的一種圖像文件,。
控制和自動化系統(tǒng)是由電腦來完成的,。掃描儀使用者無須精通掃描儀的光學(xué)和電子學(xué)部分，已商品化的掃描儀已經(jīng)經(jīng)過大量的測試和信息反饋并不斷地改進,，使其用戶界面越來越友好,，圖形化的操作界面使得初學(xué)者只需接受簡單的訓(xùn)練或閱讀操作手冊就能夠使用儀器?？刂栖浖哂性S多自動設(shè)置功能,，為使用者節(jié)省時間提高工作效率。如：不同的用戶掃描不同樣品可設(shè)置,、保存,、再現(xiàn)掃描參數(shù)；可自動設(shè)定2個以上的掃描激光波長并自動保存圖像結(jié)果,；對某一掃描波段自動調(diào)整靈敏度,、激發(fā)光強度、及探測器探測范圍等,。
掃描儀各部件功能參數(shù)主要如下：
激光源的數(shù)目和熒光波段 第一代微陣列掃描儀通常是兩個或四個熒光波段及兩個激光光源,，而第二代儀器則含三或四個激光光源并可選擇10種熒光波段。
另外,，分辨率,、靈敏度、掃描速度,、掃描視野,、掃描圖像定位的準(zhǔn)確程度等指標(biāo)也是設(shè)計和制造微陣列掃描儀所需考慮的技術(shù)指標(biāo)。微陣列掃描儀之間的比較是一個復(fù)雜的過程,不應(yīng)僅僅對單個性能參數(shù)進行比較，通常需要對掃描樣品進行綜合測試,。
ScanArray共聚焦微陣列掃描儀
General Scanning ,Inc.公司已經(jīng)建立了ScanArray共聚焦微陣列掃描儀的生產(chǎn)線,，目前全世界的許多生物技術(shù)和遺傳基因組分析實驗室都在使用該種儀器進行科研工作。
ScanArray的結(jié)構(gòu)組成是：樣品載體移動,、光源固定,、多個激光頭的共聚焦掃描儀。數(shù)值孔徑可達(dá)0.75,，掃描速度達(dá)20線/秒,。
ScanArray共聚焦微陣列掃描儀優(yōu)越性能表現(xiàn)在：操作簡單、體積小,，數(shù)值孔徑高,、掃描速度快，靈敏度和分辨率高,。
目前有兩種型號：ScanArrayâ3000和ScanArrayâ5000,，它們的性能如下：
性能指標(biāo)
ScanArray3000
ScanArray5000
結(jié)構(gòu)
樣品載體移動、光源固定,、多個激光頭
樣品載體移動,、光源固定、多個激光頭
數(shù)值孔徑
0.75
0.75
載樣介質(zhì)
所有標(biāo)準(zhǔn)的1''´3''顯微載玻片
所有標(biāo)準(zhǔn)的1''´3''顯微載玻片
視野
不小于22mm´60mm
不小于22mm´60mm
掃描速度
6線/秒
20線/秒
分辨率
10,；50（預(yù)掃描）
5,，10，20,；30,；50（預(yù)掃描）
激光束
兩種（543nm和633nm）
四種（488nm，514nm,，543nm,，594nm，612nm,，633nm）
釋放光波段
2
10
輸出格式
16-bit 1
16-bit 1
體積
25"長´10.5"寬´11.5"高
30"長´15.5"寬´13.5"高
重量
35
60-70(取決于激光頭的數(shù)目)
參考文獻：
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