基因芯片技術(shù)及其研究現(xiàn)狀和應(yīng)用前景
陳華友,，崔振玲（上海200062華東師范大學(xué)生物系分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室）

　　摘要：基因芯片技術(shù)是90年代中期以來(lái)快速發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)高新技術(shù)，是各學(xué)科交叉綜合的嶄新科學(xué),。其原理是采用光導(dǎo)原位合成或顯微印刷等方法,，將大量DNA探針片段有序地固化予支持物的表面，然后與已標(biāo)記的生物樣品中DNA分子雜交,，再對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)分析，就可得出該樣品的遺傳信息,?；蛐酒夹g(shù)目前國(guó)內(nèi)外都取得了較大的進(jìn)展，該技術(shù)可用于DNA測(cè)序,，基因表達(dá)及基因組圖的研究,，基因診斷，新基因的發(fā)現(xiàn),，藥物篩選,，給藥個(gè)性化等等，所以為二十一世紀(jì)生物醫(yī)藥鋪平道路,，將為整個(gè)人類(lèi)社會(huì)帶來(lái)深刻廣泛的變革,，促進(jìn)人類(lèi)早日進(jìn)入生物信息時(shí)代。

　　關(guān)鍵詞：基因芯片,；微陣列,；基因診斷；藥物篩選

　　生物芯片技術(shù)是隨著"人類(lèi)基因組計(jì)劃"（human genome project, HGP）的進(jìn)展而發(fā)展起來(lái)的,，它是90年代中期以來(lái)影響最深遠(yuǎn)的重大科技進(jìn)展之一,，它融微電子學(xué)、生物學(xué),、物理學(xué),、化學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)為一體的高度交叉的新技術(shù),，具有重大的基礎(chǔ)研究?jī)r(jià)值,，又具有明顯的產(chǎn)業(yè)化前景。生物芯片技術(shù)包括基因芯片,、蛋白質(zhì)芯片,、細(xì)胞芯片、組織芯片,、以及元件型微陣列芯片,、通道型微陣列芯片,、生物傳感芯片等新型生物芯片（1）。本文主要討論基因芯片技術(shù),，它為"后基因組計(jì)劃"時(shí)期基因功能的研究提供了強(qiáng)有力的工具,，將會(huì)使基因診斷、藥物篩選,、給藥個(gè)性化等方面取得重大突破,，該技術(shù)被評(píng)為1998年度世界十大科技進(jìn)展之一。

　　1 基本概念

　　基因芯片（gene chip）也叫DNA芯片,、DNA微陣列（DNA microarray）,、寡核苷酸陣列（oligonucleotide array），是指采用原位合成（in situ synthesis）或顯微打印手段,，將數(shù)以萬(wàn)計(jì)的DNA探針固化于支持物表面上,，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交,，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品快速,、并行、高效地檢測(cè)或醫(yī)學(xué)診斷,，由于常用硅芯片作為固相支持物,，且在制備過(guò)程運(yùn)用了計(jì)算機(jī)芯片的制備技術(shù)，所以稱(chēng)之為基因芯片技術(shù),。

　　2 技術(shù)基本過(guò)程

　　2．1 DNA方陣的構(gòu)建

　　選擇硅片,、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜,、尼龍膜等支持物,，并作相應(yīng)處理，然后采用光導(dǎo)化學(xué)合成和照相平板印刷技術(shù)可在硅片等表面合成寡核苷酸探針;（2）或者通過(guò)液相化學(xué)合成寡核苷酸鏈探針,，或PCR技術(shù)擴(kuò)增基因序列,，再純化、定量分析,，由陣列復(fù)制器（arraying and replicating device ARD）,，或陣列機(jī)（arrayer）及電腦控制的機(jī)器人，準(zhǔn)確,、快速地將不同探針樣品定量點(diǎn)樣于帶正電荷的尼龍膜或硅片等相應(yīng)位置上,，再由紫外線(xiàn)交聯(lián)固定后即得到DNA微陣列或芯片（3）。

　　2．2 樣品DNA或mRNA的準(zhǔn)備,。

　　從血液或活組織中獲取的DNA/mRNA樣品在標(biāo)記成為探針以前必須進(jìn)行擴(kuò)增提高閱讀靈敏度,。Mosaic Technologies公司發(fā)展了一種固相PCR系統(tǒng)，好于傳統(tǒng)PCR技術(shù)，他們?cè)诎蠨NA上設(shè)計(jì)一對(duì)雙向引物,，將其排列在丙烯酰胺薄膜上,，這種方法無(wú)交叉污染且省去液相處理的繁鎖；Lynx Therapeutics公司提出另一個(gè)革新的方法,，即大規(guī)模平行固相克?。╩assively parallel solid-phase cloning）這個(gè)方法可以對(duì)一個(gè)樣品中數(shù)以萬(wàn)計(jì)的DNA片段同時(shí)進(jìn)行克隆，且不必分離和單獨(dú)處理每個(gè)克隆,，使樣品擴(kuò)增更為有效快速（4）,。

　　在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，必須同時(shí)進(jìn)行樣品標(biāo)記,，標(biāo)記方法有熒光標(biāo)記法,、生物素標(biāo)記法,、同位素標(biāo)記法等,。

　　2．3 分子雜交

　　樣品DNA與探針DNA互補(bǔ)雜交要根據(jù)探針的類(lèi)型和長(zhǎng)度以及芯片的應(yīng)用來(lái)選擇,、優(yōu)化雜交條件。如用于基因表達(dá)監(jiān)測(cè),，雜交的嚴(yán)格性較低、低溫、時(shí)間長(zhǎng),、鹽濃度高；若用于突變檢測(cè),，則雜交條件相反（5）,。芯片分子雜交的特點(diǎn)是探針固化，樣品熒光標(biāo)記,，一次可以對(duì)大量生物樣品進(jìn)行檢測(cè)分析,，雜交過(guò)程只要30min。美國(guó)Nangon公司采用控制電場(chǎng)的方式,，使分子雜交速度縮到1min,，甚至幾秒鐘（6）。德國(guó)癌癥研究院的Jorg Hoheisel等認(rèn)為以肽核酸（PNA）為探針效果更好,。

　　2．4 雜交圖譜的檢測(cè)和分析

　　用激光激發(fā)芯片上的樣品發(fā)射熒光,，嚴(yán)格配對(duì)的雜交分子，其熱力學(xué)穩(wěn)定性較高,，熒光強(qiáng)；不完全雜交的雙鍵分子熱力學(xué)穩(wěn)定性低,，熒光信號(hào)弱（不到前者的1/35~1/5）（2）,，不雜交的無(wú)熒光,。不同位點(diǎn)信號(hào)被激光共焦顯微鏡,，或落射熒光顯微鏡等檢測(cè)到,，由計(jì)算機(jī)軟件處理分析,，得到有關(guān)基因圖譜,。目前，如質(zhì)譜法,、化學(xué)發(fā)光法,、光導(dǎo)纖維法等更靈敏`、快速,，有取代熒光法的趨勢(shì),。

　　3 應(yīng)用

　　3．1 測(cè)序

　　基因芯片利用固定探針與樣品進(jìn)行分子雜交產(chǎn)生的雜交圖譜而排列出待測(cè)樣品的序列，這種測(cè)定方法快速而具有十分誘人的前景,。Mark chee等用含135000個(gè)寡核苷酸探針的陣列測(cè)定了全長(zhǎng)為16.6kb的人線(xiàn)粒體基因組序列,，準(zhǔn)確率達(dá)99%（7）,。Hacia等用含有48000個(gè)寡核苷酸的高密度微陣列分析了黑猩猩和人BRCA1基因序列差異,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在外顯子11約3.4kb長(zhǎng)度范圍內(nèi)的核酸序列同源性在98.2%到83.5%之間，提示了二者在進(jìn)化上的高度相似性（8）,。

　　3．2 基因表達(dá)水平的檢測(cè),。

　　用基因芯片進(jìn)行的表達(dá)水平檢測(cè)可自動(dòng)、快速地檢測(cè)出成千上萬(wàn)個(gè)基因的表達(dá)情況,。Schena等采用擬南芥基因組內(nèi)共45個(gè)基因的cDNA微陣列（其中14個(gè)為完全序列,，31個(gè)為EST），檢測(cè)該植物的根,、葉組織內(nèi)這些基因的表達(dá)水平,，用不同顏色的熒光素標(biāo)記逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物后分別與該微陣列雜交，經(jīng)激光共聚焦顯微掃描,，發(fā)現(xiàn)該植物根和葉組織中存在26個(gè)基因的表達(dá)差異,，而參與葉綠素合成的CAB1基因在葉組織較根組織表達(dá)高500倍。（9）Schena等用人外周血淋巴細(xì)胞的cDNA文庫(kù)構(gòu)建一個(gè)代表1046個(gè)基因的cDNA微陣列,，來(lái)檢測(cè)體外培養(yǎng)的T細(xì)胞對(duì)熱休克反應(yīng)后不同基因表達(dá)的差異,，發(fā)現(xiàn)有5個(gè)基因在處理后存在非常明顯的高表達(dá)，11個(gè)基因中度表達(dá)增加和6個(gè)基因表達(dá)明顯抑制,。該結(jié)果還用熒光素交換標(biāo)記對(duì)照和處理組及RNA印跡方法證實(shí)（10）,。在HGP完成之后，用于檢測(cè)在不同生理、病理?xiàng)l件下的人類(lèi)所有基因表達(dá)變化的基因組芯片為期不遠(yuǎn)了（11）,。

　　3．3 基因診斷

　　從正常人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出標(biāo)準(zhǔn)圖譜,。從病人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出病變圖譜。通過(guò)比較,、分析這兩種圖譜,，就可以得出病變的DNA信息。這種基因芯片診斷技術(shù)以其快速,、高效,、敏感、經(jīng)濟(jì),、平行化,、自動(dòng)化等特點(diǎn)，將成為一項(xiàng)現(xiàn)代化診斷新技術(shù),。例如,，Affymetrix公司，把P53基因全長(zhǎng)序列和已知突變的探針集成在芯片上,，制成P53基因芯片,，將在癌癥早期診斷中發(fā)揮作用。又如,，Heller等構(gòu)建了96個(gè)基因的cDNA微陣,，用于檢測(cè)分析風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）相關(guān)的基因，以探討DNA芯片在感染性疾病診斷方面的應(yīng)用（12）?，F(xiàn)在，肝炎病毒檢測(cè)診斷芯片,、結(jié)核桿菌耐藥性檢測(cè)芯片,、多種惡性腫瘤相關(guān)病毒基因芯片等一系列診斷芯片逐步開(kāi)始進(jìn)入市場(chǎng)?；蛟\斷是基因芯片中最具有商業(yè)化價(jià)值的應(yīng)用,。

　　3．4 藥物篩選

　　如何分離和鑒定藥的有效成份是目前中藥產(chǎn)業(yè)和傳統(tǒng)的西藥開(kāi)發(fā)遇到的重大障礙，基因芯片技術(shù)是解決這一障礙的有效手段,，它能夠大規(guī)模地篩選,、通用性強(qiáng)，能夠從基因水平解釋藥物的作用機(jī)理,，即可以利用基因芯片分析用藥前后機(jī)體的不同組織,、器官基因表達(dá)的差異。如果再用m RNA 構(gòu)建c DNA表達(dá)文庫(kù),然后用得到的肽庫(kù)制作肽芯片,則可以從眾多的藥物成分中篩選到起作用的部分物質(zhì),?；蛘?利用RNA、單鏈DNA有很大的柔性，能形成復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu),，更有利與靶分子相結(jié)合,，可將核酸庫(kù)中的RNA或單鏈DNA固定在芯片上，然后與靶蛋白孵育,，形成蛋白質(zhì)-RNA或蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物,，可以篩選特異的藥物蛋白或核酸，因此芯片技術(shù)和RNA庫(kù)的結(jié)合在藥物篩選中將得到廣泛應(yīng)用,。在尋找HIV藥物中,，Jellis等用組合化學(xué)合成及DNA芯片技術(shù)篩選了654536種硫代磷酸八聚核苷酸，并從中確定了具有XXG4XX樣結(jié)構(gòu)的抑制物,，實(shí)驗(yàn)表明,，這種篩選物對(duì)HIV感染細(xì)胞有明顯阻斷作用。（13）生物芯片技術(shù)使得藥物篩選,，靶基因鑒別和新藥測(cè)試的速度大大提高,，成本大大降低?；蛐酒幬锖Y選技術(shù)工作目前剛剛起步,，美國(guó)很多制藥公司已開(kāi)始前期工作，即正在建立表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù),，從而為藥物篩選提供各種靶基因及分析手段,。這一技術(shù)具有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值。

　　3．5 給藥個(gè)性化

　　臨床上,，同樣藥物的劑量對(duì)病人甲有效可能對(duì)病人乙不起作用,，而對(duì)病人丙則可能有副作用。在藥物療效與副作用方面,，病人的反應(yīng)差異很大,。這主要是由于病人遺傳學(xué)上存在差異，如藥物應(yīng)答基因,，導(dǎo)致對(duì)藥物產(chǎn)生不同的反應(yīng),。例如細(xì)胞色素P450酶與大約25%廣泛使用的藥物的代謝有關(guān)，如果病人該酶的基因發(fā)生突變就會(huì)對(duì)降壓藥異喹胍產(chǎn)生明顯的副作用,，大約5%~10%的高加索人缺乏該酶基因的活性?，F(xiàn)已弄清楚這類(lèi)基因存在廣泛變異，這些變異除對(duì)藥物產(chǎn)生不同反應(yīng)外,，還與易犯各種疾病如腫瘤,、自身免疫病和帕金森病有關(guān)。如果利用基因芯片技術(shù)對(duì)患者先進(jìn)行診斷,，再開(kāi)處方,，就可對(duì)病人實(shí)施個(gè)體優(yōu)化治療,。另一方面，在治療中,，很多同種疾病的具體病因是因人而異的,，用藥也應(yīng)因人而異。例如乙肝有較多亞型,，HBV基因的多個(gè)位點(diǎn)如S,P及C基因區(qū)易發(fā)生變異,。若用乙肝病毒基因多態(tài)性檢測(cè)芯片每隔一段時(shí)間就檢測(cè)一次，這對(duì)指導(dǎo)用藥防止乙肝病毒耐藥性很有意義,。又如,，現(xiàn)用于治療AIDS的藥物主要是病毒逆轉(zhuǎn)錄酶RT和蛋白酶PRO的抑制劑，但在用藥3-12月后常出現(xiàn)耐藥,，其原因是rt,、pro基因產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變。Rt基因四個(gè)常見(jiàn)突變位點(diǎn)是Asp67→Asn,、Lys70→Arg,、Thr215→Phe、Tyr和Lys219→Glu,四個(gè)位點(diǎn)均突變較單一位點(diǎn)突變后對(duì)藥物的耐受能力成百倍增加（14）,。如將這些基因突變部位的全部序列構(gòu)建為DNA芯片,，則可快速地檢測(cè)病人是這一個(gè)或那一個(gè)或多個(gè)基因發(fā)生突變，從而可對(duì)癥下藥,，所以對(duì)指導(dǎo)治療和預(yù)后有很大的意義,。

　　此外，基因芯片在新基因發(fā)現(xiàn),、藥物基因組圖,、中藥物種鑒定、DNA計(jì)算機(jī)研究等方面都有巨大應(yīng)用價(jià)值,。

　　4 基因芯片國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀和前景

　　自從1996年美國(guó)Affymetrix公司成功地制作出世界上首批用于藥物篩選和實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)用的生物芯片,，并制作出芯片系統(tǒng)（15），此后世界各國(guó)在芯片研究方面快速前進(jìn),，不斷有新的突破。美國(guó)的Hyseq公司,、Syntexi公司,、Nanogen公司、Incyte公司及日本,、歐洲各國(guó)都積極開(kāi)展DNA芯片研究工作,；摩托羅拉、惠普,、IBM等跨國(guó)公司也相繼投以巨資開(kāi)展芯片研究,。98年12月Affymefrix公司和Molecular Dynamics公司宣布成立基因分析協(xié)會(huì)（Genetic Analysis Technology Consortium）以制定一個(gè)統(tǒng)一的技術(shù)平臺(tái)生產(chǎn)更有效而價(jià)謙的設(shè)備,，與此相呼應(yīng)，英國(guó)的Amershcem Pharmacia Biotechnology公司也在同一天宣布將提供部分掌握的技術(shù)以推動(dòng)這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用（16）,。美國(guó)關(guān)于芯片技術(shù)召開(kāi)了兩次會(huì)議,，克林頓總統(tǒng)在會(huì)上高度贊賞和肯定該技術(shù)，將基因芯片看作是保證一生健康的指南針（17）,。預(yù)計(jì)在今后五年內(nèi)生物芯片銷(xiāo)售可達(dá)200-300億美元,；據(jù)《財(cái)富》雜志預(yù)測(cè)（97.3），在21世紀(jì),，生物芯片對(duì)人類(lèi)的影響將可能超過(guò)微電子芯片,。

　　我國(guó)在生物芯片研究方面剛剛起步，以97香山會(huì)議以來(lái),，我國(guó)對(duì)生物芯片高度重視,，98年10月，中科院將基因芯片列為"九五"特別支持項(xiàng)目,，利用中科院在微電子技術(shù),、生化技術(shù)、物理檢測(cè)技術(shù)方面的優(yōu)勢(shì),，組織跨所,、跨學(xué)科合作。現(xiàn)在以中科院上海冶金所為龍頭,，與上海原子核所,、有機(jī)所、生化所,、遺傳所,、腫瘤所、武漢病毒所,、上海醫(yī)科大學(xué),、上海市疾病檢測(cè)中心、華東師大等單位組成強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合,，在微陣列芯片和基于MEBS的芯片方面有大的突破,，在DNA芯片設(shè)計(jì)、基片修飾,、探針固定,、樣品標(biāo)記、雜交和檢測(cè)等方面的技術(shù)都有較大的進(jìn)展,，已研制出肝癌基因差異表達(dá)芯片,、乙肝病毒多態(tài)性檢測(cè)芯片、多種惡性腫瘤病毒基因芯片等有一定實(shí)用意義的基因芯片和DNA芯片檢測(cè)儀樣機(jī),。中科院上海冶金所等又將在徐元森院士,、趙建龍博士等帶領(lǐng)下,，決心開(kāi)發(fā)重大傳染性疾病的診斷芯片及檢測(cè)設(shè)備，如HBV,、HCV,、TB三種基因診斷芯片。上海細(xì)胞所正在進(jìn)行人類(lèi)全套基因組的cDNA陣列和微陣列制備,，為我國(guó)科研和開(kāi)發(fā)提供一個(gè)技術(shù)平臺(tái),，并使之產(chǎn)業(yè)化。同時(shí),，清華,、復(fù)旦、東南大學(xué),、北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院,、華東理工大學(xué)、第一軍醫(yī)大學(xué)等單位都在積極進(jìn)行芯片研究,。2000年國(guó)際生物芯片技術(shù)大會(huì)于10月11-14在北京召開(kāi),，這又是對(duì)我國(guó)生物芯片技術(shù)有很大的促進(jìn)作用。

　　總之,，我國(guó)基因芯片研究也緊跟國(guó)際前沿,，力爭(zhēng)在此高新技術(shù)領(lǐng)域里有一席之地，它將對(duì)我國(guó)生命科學(xué)研究,，醫(yī)學(xué)診斷,，新藥篩選具有革命性的推動(dòng)作用，也將對(duì)我國(guó)人口素質(zhì),、農(nóng)業(yè)發(fā)展,、環(huán)境保護(hù)等作出具大的貢獻(xiàn)，同時(shí)帶動(dòng)我國(guó)科學(xué)整體進(jìn)步,，為各相關(guān)高科技產(chǎn)業(yè)創(chuàng)造機(jī)會(huì),。基因芯片將成為21世紀(jì)最令人注目的高新技術(shù)領(lǐng)域之一,，將使人類(lèi)早日進(jìn)入生物信息時(shí)代,。

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基因芯片在臨床應(yīng)用中的前景

中華基因網(wǎng)技術(shù)部 王嘉嘉

　　基因芯片及其技術(shù)是融微電子學(xué)、生物學(xué),、物理學(xué)、化學(xué),、計(jì)算機(jī)科學(xué)為一體的高度交叉的新科技,，一旦被廣泛應(yīng)用與臨床,，它將在一些重癥傳染病、惡性腫瘤,、自身免疫性疾病,、神經(jīng)性疾病等方面，發(fā)生巨大的革命性的變革,，基因技術(shù)在疾病的診斷,、檢測(cè)及治療用藥等方面有廣闊的應(yīng)用、研究?jī)r(jià)值,。

　　一,、基本概念

　　基因芯片(gene chip)，又稱(chēng)DNA芯片,，是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針,，有規(guī)律地排列固定于支持物上，樣品DNA/RNA通過(guò)PCR擴(kuò)增,、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子,，然后按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交，再通過(guò)熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描,，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的熒光信號(hào)作出比較和檢測(cè),，從而迅速得出所要的信息[1]?；蛐酒夹g(shù)具有多樣品并行處理能力,、分析速度快、所需樣品量少,、污染少等優(yōu)點(diǎn),，近年來(lái)在臨床診斷、藥物篩選,、指導(dǎo)臨床用藥及治療等研究領(lǐng)域帶來(lái)革新性的影響,。

　　二、基因芯片的主要類(lèi)型　

　　基因芯片的類(lèi)型按分類(lèi)方法不同可分為不同的類(lèi)型[2]

　　1,、無(wú)機(jī)片基和有機(jī)合成物片基的基因芯片　
以基因芯片的片基或支持物的不同可以分為無(wú)機(jī)片基和有機(jī)合成物片基,，前者主要有半導(dǎo)體硅片和玻璃片等，其上的探針主要以原位聚合的方法合成,；后者主要有特定孔徑的硝酸纖維膜和尼龍膜,，其上的探針主要是預(yù)先合成后通過(guò)特殊的微量點(diǎn)樣裝置或儀器滴加到片基上。另有以聚丙烯膜支持物用傳統(tǒng)的亞磷酰胺固相法原位合成高密度探針序列,。

　　2,、原位合成和預(yù)先合成然后點(diǎn)樣的基因芯片 　

　　以探針陣列的形式分為原位合成與預(yù)先合成然后點(diǎn)樣兩種。芯片制備的原理是利用照相平板印刷技術(shù)將探針排列的序列即陣列圖"印"到支持物上,，在這些陣列點(diǎn)上結(jié)合上專(zhuān)一的化學(xué)基因,。原位合成主要是指光引導(dǎo)合成技術(shù),，該技術(shù)是照相平板印刷技術(shù)與固相合成技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)以及分子生物學(xué)等多學(xué)科相互滲透的結(jié)果,。預(yù)先合成然后點(diǎn)樣法在多聚物的設(shè)計(jì)方面與前者相似,，合成工作用傳統(tǒng)的DNA 合成儀進(jìn)行。合成后再用特殊的點(diǎn)樣裝置將其以較高密度分布于硝酸纖維膜或經(jīng)過(guò)處理的玻片上,。

　　3,、基因表達(dá)芯片和DNA測(cè)序芯片　

　　根據(jù)芯片的功能可分為基因表達(dá)譜芯片和DNA測(cè)序芯片兩類(lèi)?；虮磉_(dá)芯片可以將克隆到的成千上萬(wàn)個(gè)基因特異的探針或其cDNA片段固定在一塊DNA芯片上,，對(duì)來(lái)源于不同的個(gè)體(正常人與患者)、組織,、細(xì)胞周期,、發(fā)育階段、分化階段,、病變,、刺激(包括不同誘導(dǎo)、不同治療手段)下的細(xì)胞內(nèi)mRNA或反轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的cDNA進(jìn)行檢測(cè),，從而對(duì)這些基因表達(dá)的個(gè)體特異性,、組織特異性、發(fā)育階段特異性,、分化階段特異性,、病變特異性、刺激特異性進(jìn)行綜合的分析和判斷,，迅速將某個(gè)或幾個(gè)基因與疾病聯(lián)系起來(lái),，極大地加快這些基因功能的確定，同時(shí)可進(jìn)一步研究基因與基因間相互作用的關(guān)系,。DNA 測(cè)序芯片則是基于雜交測(cè)序發(fā)展起來(lái)的,。其原理是，任何線(xiàn)狀的單鏈DNA或RNA序列均可分解成 一系列堿基數(shù)固定,、錯(cuò)落而重疊的寡核苷酸,，又稱(chēng)亞序列(subsequence)，假如我們能把原序列所有這些錯(cuò)落重疊的亞序列全部檢測(cè)出來(lái),，就可據(jù)此重新組建出原序列,。　　

　　另外也可根據(jù)所用探針的類(lèi)型不同分為cDNA微陣列(或cDNA微陣列芯片)和寡核苷酸陣列(或芯片),，根據(jù)應(yīng)用領(lǐng)域不同而制備的專(zhuān)用芯片如毒理學(xué)芯片(Toxchip),、病毒檢測(cè)芯片(如肝炎病毒檢測(cè)芯片)、P53基因檢測(cè)芯片等。

　　又可以按生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程分：　　

　　通常的生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程包括三步,，即樣品的制備,，生化反應(yīng)、結(jié)果的檢測(cè)和分析,。可將這三步不同步驟集成為不同用途的生物芯片,，所以據(jù)此可將生物芯片分為不同的類(lèi)型,。例如用于樣品制備的生物芯片，生化反應(yīng)生物芯片及各種檢測(cè)用生物芯片等,。

　　三,、臨床上的應(yīng)用前景

　　1、疾病診斷

　　基因芯片在感染性疾病,、遺傳性疾病,、重癥傳染病和惡性腫瘤等疾病的臨床診斷方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比,，它可以在一張芯片同時(shí)對(duì)多個(gè)病人進(jìn)行多種疾病的檢測(cè),，無(wú)需機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)期，能及早診斷,，待測(cè)樣品用量?。荒芴禺愋詸z測(cè)病原微生物的亞型及變異,；可幫助醫(yī)生及患者從"系統(tǒng),、血管、組織和細(xì)胞層次（通常稱(chēng)之為'第二階段醫(yī)學(xué)'）"轉(zhuǎn)變到"DNA,、RNA,、蛋白質(zhì)及其相互作用層次（第三階段醫(yī)學(xué)）"上了解疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程,，這些特點(diǎn)使得醫(yī)務(wù)人員在短時(shí)間內(nèi),，可以掌握大量的疾病診斷信息，這些信息有助于醫(yī)生在短時(shí)間內(nèi)找到正確的治療措施,。眾所周知,，腫瘤和遺傳疾病發(fā)生的根本原因是由于遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，檢測(cè)基因突變對(duì)于闡明腫瘤及遺傳病的分子機(jī)制,、疾病的早期診斷具有重要意義,。目前，Affymetrix公司已開(kāi)發(fā)出P53基因芯片,，是將已知P53基因全長(zhǎng)序列和已知突變的探針固定在芯片上,，這將有助于惡性腫瘤的早期診斷。華盛頓大學(xué)的分子生物學(xué)系與病理系聯(lián)合研究了卵巢癌中基因表達(dá)譜的變化[3]，他們將5766個(gè)基因探針固定于芯片上,，其中5376個(gè)分別選自卵巢癌,、卵巢表面上皮細(xì)胞及正常卵巢的cDNA文庫(kù)，另外還有342個(gè)來(lái)自EST克隆,，包括一些已知確定的管家基因,、細(xì)胞因子和因子受體基因、生長(zhǎng)因子和受體基因,、與細(xì)胞分裂相關(guān)的基因以及新近確定的腫瘤相關(guān)基因,，找出在卵巢癌組織中過(guò)度表達(dá)的30個(gè)有GenBank收錄的基因，如高表達(dá)的有CD9(GenBank錄入號(hào)：M38690),、Epithelial glycoprotein (GenBank錄入號(hào)：M32306),、P27（GenBank錄入號(hào)：X67325）等，這證明了利用基因芯片分析復(fù)雜生物體系中分子變化的可行性,。又如,，Hacia等［4］在1.28 cm×1.28 cm的芯片上固定了9.66×104個(gè)長(zhǎng)度為20 nt的寡核苷酸探針，用于檢測(cè)乳腺癌基因BRCA1的exon11 (3.45 kb)中所有可能的堿基置換,、插入和缺失(1～5 bp)突變,。在15例患者樣品中，發(fā)現(xiàn)有14例有基因突變,，類(lèi)型包括點(diǎn)突變,、插入及缺失等；在20例對(duì)照樣品中均未檢出假陽(yáng)性結(jié)果,。又如,，Heller等[5]采用基因表達(dá)譜芯片研究了類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腸炎基因的特征性表達(dá)活性,，發(fā)現(xiàn)已知炎癥相關(guān)基因,，如腫瘤壞死因子、白介素和粒細(xì)胞集落刺激因子在組織中有表達(dá),。還發(fā)現(xiàn)一些以前未知的與炎癥相關(guān)基因的表達(dá),，如人基質(zhì)金屬?gòu)椥缘鞍酌?human matrix metallo-elastase)和黑素瘤生長(zhǎng)刺激因子(melanoma growth stimulatory factor)。同時(shí),，與一個(gè)來(lái)自外周血基因文庫(kù)的1046個(gè)cDNA克隆的陣列作這兩種病變狀態(tài)基因差異表達(dá)的比較,，發(fā)現(xiàn)在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組織中金屬蛋白酶組織抑制物1，鐵蛋白輕鏈和錳超氧化物歧化酶表達(dá)明顯升高 ,。通過(guò)該研究,，確定了許多基因與這兩種病變的關(guān)系，為探討基因芯片在診斷感染性疾病方面提供了新的思路?，F(xiàn)在,，肝炎病毒檢測(cè)芯片、多種惡性腫瘤相關(guān)病毒基因芯片等多種芯片已面市，相信不久的將來(lái),，會(huì)有更多的基因芯片用于臨床,。

　　2、藥物篩選

　　芯片技術(shù)具有高通量,、大規(guī)模,、平行性等特點(diǎn)可以進(jìn)行新藥的篩選，尤其對(duì)我國(guó)傳統(tǒng)的中藥有效成分進(jìn)行篩選,?；蛐酒瑢?duì)于藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)、多靶位同步高通量藥物篩選,、藥物作用的分子機(jī)理、藥物活性及毒性評(píng)價(jià)方面都有其它方法無(wú)可比擬的優(yōu)越性,，能夠從基因水平解釋藥物的作用機(jī)理,，可以用基因芯片分析用藥前后機(jī)體的不同組織、器官基因表達(dá)的差異,，國(guó)外幾乎所有的主要制藥公司都不同程度地采用了基因芯片技術(shù)來(lái)尋找藥物靶標(biāo),，查檢藥物的毒性或副作用。例如,，Kapp U等[6]用包含950個(gè)基因探針的基因芯片比較何杰金氏病細(xì)胞系L428及KMH2與EB病的B淋巴細(xì)胞系LGL-GK的基因表達(dá)譜,，發(fā)現(xiàn)何杰金氏病源的細(xì)胞系中白細(xì)胞介素-13（IL-13）及白細(xì)胞介素-5（IL-5）表達(dá)異常增高，用IL-13抗體處理何杰金氏病院源細(xì)胞系可顯著抑制其增殖,，此發(fā)現(xiàn)提示,，IL-13可能以自分泌形式促進(jìn)何杰金氏相關(guān)細(xì)胞增殖,IL-13及其信號(hào)傳導(dǎo)途徑可能成為何杰金氏病治療及藥物篩選的新靶點(diǎn)。芯片用于大規(guī)模的藥物篩選研究可以省略大量的動(dòng)物試驗(yàn),，縮短藥物篩選所用時(shí)間,，這可大大節(jié)省新藥開(kāi)發(fā)經(jīng)費(fèi)，并且可對(duì)由于不良反應(yīng)而放棄的藥物進(jìn)行重新評(píng)價(jià),，選取可適用的患者群,，實(shí)現(xiàn)個(gè)性化治療。Michael Wilson 等[7]使用包含有肺結(jié)核桿菌基因組PRF的97%的序列的基因芯片,，對(duì)應(yīng)用抗結(jié)核桿菌藥物異煙肼誘導(dǎo)前后表達(dá)的變化,，結(jié)果證明肺結(jié)核桿菌中脂肪酸合成酶Ⅱ、FbpC,、efpA,、fadE23、fadE24和 基因發(fā)生改變與耐藥性有關(guān),，并為新藥物作用的靶目標(biāo)研究及指導(dǎo)抑制這些靶目標(biāo)試劑和藥物的合成提供指導(dǎo),。研究各種藥物對(duì)不同基因的作用，從而在劑量和成分搭配上做到精確無(wú)誤。相信在不久的將來(lái),，藥品說(shuō)明書(shū)上的適用癥和禁忌癥都會(huì)改為適用基因型和禁忌基因型,，使得藥品更加針對(duì)不同個(gè)體的不同疾病，達(dá)到療效更佳,、副作用更小的目的,。

　　3、指導(dǎo)用藥及治療方案

　　種族,、個(gè)體等因素都會(huì)導(dǎo)致遺傳背景的差異,，臨床上，同樣劑量的藥物對(duì)于不同患者在藥物療效與副作用方面會(huì)有很大差異,，如果利用基因芯片技術(shù)對(duì)患者進(jìn)行診斷再開(kāi)處方,，就可以對(duì)患者實(shí)施個(gè)體化治療。疾病一般不是由單個(gè)基因引起的,， 在治療中很多同種疾病的具體病因是因人而異的,，所以用藥也因人而異，例如,，現(xiàn)用于治療ADIS的藥物[8]主要是病毒逆轉(zhuǎn)錄酶RT和蛋白酶PRO的抑制劑,，但在用藥3-12個(gè)月后常出現(xiàn)耐藥，其原因是rt,、pro基因產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變,，對(duì)藥物的耐受能力成倍增加，如果將這些基因突變部位的全部序列構(gòu)建為DNA芯片,，則可快速地檢測(cè)患者是哪些基因發(fā)生突變,，從而可對(duì)癥施藥，指導(dǎo)臨床治療和預(yù)后,。傳統(tǒng)的中醫(yī)藥講究的是整體治療觀,，在中藥基因組學(xué)和中藥化學(xué)組學(xué)中，多成分,、多靶點(diǎn)治療是基點(diǎn),，關(guān)鍵就是分析出成分譜與活性譜，實(shí)現(xiàn)精確篩選和配置,，?quot;復(fù)方"的形式作用于致病基因組,。

　　4、預(yù)防醫(yī)學(xué)

　　在嬰兒出生前,，可用生物芯片進(jìn)行有效的產(chǎn)前篩查和診斷,，防止患有先天性疾病的嬰兒出生。而在嬰兒出生后,，即可采用基因芯片技術(shù)來(lái)分析其基因圖譜,，不僅可預(yù)測(cè)出他日后可以長(zhǎng)多高,，還可預(yù)測(cè)其患某些疾病的潛在可能性有多大，以便采取預(yù)防措施,。

　　四,、前景展望

　　盡管基因芯片發(fā)展時(shí)間不長(zhǎng)，迄今在醫(yī)學(xué)研究實(shí)際應(yīng)用中的例子還不多,，但由于芯片技術(shù)與傳統(tǒng)的雜交技術(shù)相比,，有檢測(cè)系統(tǒng)微型化，對(duì)樣品的需要量非常少,，效率高,，能高通量檢測(cè)DNA序列，更好地解釋基因之間表達(dá)的相互關(guān)系及檢測(cè)基因表達(dá)變化的靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),，基因芯片在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用前景無(wú)疑是非常廣闊的,。但目前基因芯片還處在研究階段，要成為臨床可以普遍采用的技術(shù)仍有一些問(wèn)題急待解決,，隨著研究的不斷深入和技術(shù)的更加完善,，基因芯片一定會(huì)在生命科學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮出其非凡的作用?；蛐酒夹g(shù)將為我們提供一條認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)的捷徑。

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生物芯片技術(shù)診斷病毒性肝炎研究現(xiàn)狀

　　 生物芯片是指通過(guò)微加工技術(shù)和微電子技術(shù),，在固體芯片表面構(gòu)建微型生化分析系統(tǒng)，將大量特定序列和核酸片斷或蛋白有序地固定在載體上,，與標(biāo)記好地待檢核酸或蛋白分子進(jìn)行反應(yīng),，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱而判斷樣本中的靶分子數(shù)量，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)化合物,、核酸,、蛋白質(zhì)、細(xì)胞及其他生物組分的準(zhǔn)確,、快速和大信息量的篩檢,。它具有高度平行性、多樣性,、微型化和自動(dòng)化的特性,，以往常用的任何方法都難以與之相比較。 自1996年世界第一塊商品化的生物芯片問(wèn)世以來(lái),，短短數(shù)年間即得到迅猛發(fā)展,，目前常用的有生物芯片、蛋白質(zhì)芯片和芯片實(shí)驗(yàn)室三大類(lèi),，主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)組分研究,、藥物篩選,、疾病診斷與預(yù)測(cè)、基因表達(dá)譜分析,、新基因的發(fā)現(xiàn),、基因突變檢測(cè)及多態(tài)分析、基因組文庫(kù)作圖及基因測(cè)序等,。這一技術(shù)在病毒性疾病的診斷及療效評(píng)價(jià)中也得到了廣泛的應(yīng)用,，為臨床診斷、用藥,、療效判定及疾病的發(fā)生,、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸提供可靠依據(jù)。由此可以更深入地認(rèn)識(shí)病毒的分子致病基礎(chǔ)機(jī)制,，發(fā)現(xiàn)更多的,、更有效的阻斷病毒感染途徑和抗病毒作用靶標(biāo)，以便從分子水平制定實(shí)驗(yàn)診斷與臨床治療方案,。茲以肝炎病毒為例就近年的研究進(jìn)展簡(jiǎn)介如下:

　　用于病毒免疫標(biāo)志物的平行檢測(cè)與血清學(xué)分型,。

　　目前已發(fā)現(xiàn)數(shù)十種病毒可引起肝炎性損害，檢測(cè)其相應(yīng)的免疫標(biāo)志物在人體中的存在及含量,，對(duì)病因診斷與治療意義重大,。最新發(fā)展的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)原理類(lèi)似于常規(guī)的酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理，即將特異性抗原或抗體固定于載體,，待測(cè)樣本按比例稀釋后與其上的抗原或抗體進(jìn)行反應(yīng),，在加上熒光標(biāo)記的抗原或抗體，用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行分析,，即可獲得準(zhǔn)確的定性或定量結(jié)果,。一張芯片上可分布上千甚至數(shù)萬(wàn)個(gè)抗原或抗體，并能標(biāo)記多種載光素,，使之能同時(shí)倍快速檢測(cè),，且可進(jìn)行病毒的血清學(xué)分型。

　　用于肝炎病毒的分類(lèi),、分型,、變異和定量檢測(cè)

　　為遴選抗病毒藥物，評(píng)價(jià)臨床療效,，除生化,、免疫和病理指標(biāo)外，還應(yīng)明確病毒的核酸結(jié)構(gòu)和體液病毒核酸的含量,，用DNA測(cè)序,、PCR等法雖可達(dá)到目的，但技術(shù)難度和實(shí)驗(yàn)成本限制了其應(yīng)用,?；蛐酒瑒t可對(duì)所有的肝炎病毒的分型,、變異、突變和病毒核酸含量進(jìn)行高通量,、平行檢測(cè),。它將待測(cè)病毒基因（DNA或是mRNA）經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄、PCR,、逆轉(zhuǎn)錄,、末端標(biāo)記等處理成標(biāo)記有熒光分子的核酸分子，然后與芯片上的探針進(jìn)行雜交,，用計(jì)算機(jī)對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行處理,，依信號(hào)和強(qiáng)度即可得出核酸含量。這一方法簡(jiǎn)便易行,，實(shí)驗(yàn)成本低,，可為臨床的準(zhǔn)確診斷、合理用藥,、判定預(yù)后提供切實(shí)可信的依據(jù),。

　　用于病毒的耐藥性突變檢測(cè)

　　目前在肝炎的抗病毒治療中產(chǎn)生的病毒耐藥突變，最典型者為拉米夫定（3TC）抗HBV治療中出現(xiàn)的YMDD變異,。此變異發(fā)生于應(yīng)用3TC半年后,，作用靶位為病毒的DNA聚合酶（DNAP）通過(guò)與底物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)以抑制HBV底逆轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，同時(shí)易引起DNAP的多位點(diǎn)突變,?；蛐酒母咄俊⑵叫袡z測(cè)技術(shù)針對(duì)引起YMDD變異的眾多基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針,，將之結(jié)合于同一張芯片或與上述分型基因芯片合并,，從血清樣本中抽取病毒DNA,，經(jīng)體外擴(kuò)增后與芯片探針雜交,，依據(jù)雜交信號(hào)判定HBV的YMDD變異，得出是否產(chǎn)生耐藥性的結(jié)論,。

　　結(jié)合核酸類(lèi)抗體配基篩選技術(shù)（SELEX）,，實(shí)現(xiàn)基因芯片技術(shù)對(duì)肝炎免疫應(yīng)答中特異性標(biāo)志物及相關(guān)蛋白質(zhì)的分析

　　隨著DNA結(jié)合蛋白研究的深入，受組合化學(xué),、抗體庫(kù)和隨機(jī)噬菌體肽庫(kù)技術(shù)的啟發(fā),，人們構(gòu)建了隨機(jī)核酸庫(kù)并從中篩選出與靶蛋白特異結(jié)合的核酸配基，此技術(shù)稱(chēng)為SELEX,。與蛋白類(lèi)抗體相比,，此配基具有許多有點(diǎn)：作用的靶分子范圍更廣，配基與靶分子的結(jié)合能力與特異性更強(qiáng),，動(dòng)力學(xué)參數(shù)可依體外診斷條件的要求而改變,，不受抗原毒性和免疫原性的限制,，特異性和親和力不受組織或樣本中非靶抗原的干擾，體外人工合成實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn),，合成時(shí)可隨意連接其他功能基因和分子等,。目前已從核酸庫(kù)中篩選出各種與蛋白、核酸,、小分子肽,、氨基酸、有機(jī)物,、金屬離子等特異性結(jié)合配基,，并應(yīng)用于臨床治療和診斷。凡涉及抗體的診斷領(lǐng)域,，幾乎均可用核酸配基替代,。選擇針對(duì)肝炎免疫應(yīng)答過(guò)程中特異性標(biāo)志物及相關(guān)反應(yīng)蛋白篩選核酸配基，人工合成后結(jié)合于固相載體,，制作基因芯片,，即可實(shí)現(xiàn)芯片技術(shù)的病毒免疫標(biāo)記物及免疫應(yīng)答過(guò)程中的細(xì)胞因子、細(xì)胞周期,、細(xì)胞凋亡等免疫學(xué)檢測(cè),。

　　 基因芯片技術(shù)雖有諸多優(yōu)點(diǎn)，但要成為實(shí)驗(yàn)室或臨床可以普遍采用的技術(shù)目前尚有一些關(guān)鍵問(wèn)題亟待解決,，如如何提高芯片的特異性,，簡(jiǎn)化樣本制備和標(biāo)記操作程序，增加信號(hào)檢測(cè)的靈敏度和高度集成化樣本的制備,，基因擴(kuò)增,，核酸標(biāo)記及檢測(cè)儀器的研制和開(kāi)發(fā)等，已成為當(dāng)今國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn),。

摘自：《中華基因網(wǎng)》

生物芯片技術(shù)在藥物R&D中的應(yīng)用

　　1946年世界上第一臺(tái)電子數(shù)字計(jì)算機(jī)ENIAC在美國(guó)Pennsylvania大學(xué)問(wèn),。在隨后的50年里，以美國(guó)的硅谷為搖籃,，計(jì)算機(jī)技術(shù)不斷飛速發(fā)展,，給我們的生活帶來(lái)了巨大的變革。無(wú)獨(dú)有偶,，1991年又是在美國(guó)硅谷,，Affymax公司開(kāi)始了生物芯片的研制，他們將芯片光刻技術(shù)與光化學(xué)合成技術(shù)相結(jié)合制作了寡核苷酸陣列芯片,。近年來(lái),，以DNA芯片為代表的生物芯片技術(shù)，得到了迅猛發(fā)展,，已有多種不同功能的生物芯片問(wèn)世,。目前生物芯片技術(shù)已應(yīng)用于分子生物學(xué),、疾病的預(yù)防、診斷和治療,、新藥開(kāi)發(fā),、生物武器的研制、司法鑒定,、環(huán)境污染監(jiān)測(cè)和食品衛(wèi)生監(jiān)督等諸多領(lǐng)域,，已成為各國(guó)學(xué)術(shù)界和工業(yè)界所矚目并研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

　　生物芯片的概念源自于計(jì)算機(jī)芯片,，狹義的生物芯片即微陣列芯片,，主要包括cDNA微陣列、寡核苷酸微陣列,、蛋白質(zhì)微陣列和小分子化合物微陣列,。分析的基本單位是在一定尺寸的基片（如硅片、玻璃,、塑料等）表面以點(diǎn)陣方式固定的一系列可尋址的識(shí)別分子,，點(diǎn)陣中每一個(gè)點(diǎn)都可以視為一個(gè)傳感器的探頭。芯片表面固定的分子在一定的條件下與被檢測(cè)物進(jìn)行反應(yīng),，其結(jié)果利用化學(xué)熒光法,、酶標(biāo)法。同位素法或電化學(xué)法顯示,，再用掃描儀等儀器記錄,，最后通過(guò)專(zhuān)門(mén)的計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行分析。廣義的生物芯片是指能對(duì)生物成分或生物分子進(jìn)行快速并行處理和分析的厘米見(jiàn)方的固體薄型器件,，其主要種類(lèi)有微陣列芯片,、過(guò)濾分離芯片、介電電泳分離芯片,、生化反應(yīng)芯片和毛細(xì)管電泳芯片等,。
隨著21世紀(jì)的到來(lái)，制藥公司正面臨著一次嚴(yán)峻的市場(chǎng)挑戰(zhàn),。這些公司為了保持或增強(qiáng)在市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力,，不得不尋求發(fā)展新的藥物開(kāi)發(fā)技術(shù)以提高藥物發(fā)現(xiàn)的速度,，縮短新藥上市的時(shí)間,，減少藥物開(kāi)發(fā)的成本。近年來(lái)生物芯片技術(shù)的飛速發(fā)展,，引起了制藥業(yè)的極大興趣,，使得生物芯片技術(shù)在藥物研究與開(kāi)發(fā)領(lǐng)域得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，已逐漸滲入到藥物研發(fā)過(guò)程中的各個(gè)步驟,。本文將主要討論生物芯片技術(shù)在藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)與藥物作用機(jī)制研究,、超高通量藥物篩選,、毒理學(xué)研究、藥物基因組學(xué)研究以及藥物分析中的應(yīng)用,。

　　1 生物芯片在藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)與藥物作用機(jī)制研究中的應(yīng)用

　　藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)與藥物作用機(jī)制研究是生物芯片技術(shù)在藥物研發(fā)中應(yīng)用最為廣泛的一個(gè)領(lǐng)域,。在藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和藥物作用機(jī)制研究中所使用的生物芯片主要是指DNA芯片。在DNA芯片的表面,，以微陣列的方式固定有寡核苷酸或cDNA,。使用DNA 芯片可以對(duì)研究者感興趣的基因或生物體整個(gè)基因組的基因表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。在當(dāng)代藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)和選擇合適的藥物靶點(diǎn)是藥物開(kāi)發(fā)的第一步,，也是藥物篩選及藥物定向合成的關(guān)鍵因素之一,。人體是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，疾病的發(fā)生和發(fā)展必然牽涉到網(wǎng)絡(luò)中的諸多環(huán)節(jié),。當(dāng)今嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的心腦血管疾病,、惡性腫瘤、老年性癡呆癥和一些代謝紊亂疾病都是多因素作用的結(jié)果,，往往不能歸結(jié)于單一因素的變化,。應(yīng)用一些基因?qū)ふ也呗匀鏒D PCR等雖然為發(fā)現(xiàn)新的功能基因提供了一些線(xiàn)索，但還是有相當(dāng)?shù)木窒扌?。而DNA芯片可以從疾病及藥物2個(gè)角度對(duì)生物體的多個(gè)參量同時(shí)進(jìn)行研究以發(fā)掘藥物靶點(diǎn)并同時(shí)獲取大量其他相關(guān)信息,。因此可以說(shuō)，在這種情況下,，任何一元化的分析方法均不及 DNA芯片這種集成化的分析手段更具有優(yōu)勢(shì),。

　　DNA芯片在藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)與藥物作用機(jī)制研究中的應(yīng)用具體表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。

　　比較正常不同組織細(xì)胞中基因的表達(dá)模式

　　基因的表達(dá)模式給它的功能提供了間接的信息,。例如只在腎臟中表達(dá)的基因就不大可能與精神分裂癥有關(guān),。一些藥物的靶點(diǎn)是在整個(gè)身體中分布廣泛的蛋白質(zhì)，這類(lèi)藥物的不良反應(yīng)往往比較大,。而選擇只在特異組織中才表達(dá)的蛋白作為藥物篩選的靶點(diǎn),，可以減少藥物對(duì)整體產(chǎn)生的不良反應(yīng)，因而更引起人們的關(guān)注,。例如骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis）與破骨細(xì)胞（osteoclasts）的功能有關(guān),，破骨細(xì)胞可以破壞并吸收骨質(zhì)，當(dāng)骨質(zhì)的形成與破壞出現(xiàn)不平衡的時(shí)候,，就會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥,。如果破骨細(xì)胞的功能得到抑制，那么就可以控制骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和發(fā)展,。利用已有的人類(lèi)EST序列和DNA芯片技術(shù),，可以容易地得到只在破骨細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的基因如 cathepsink基因，它編碼半胱氨酸蛋白酶。以 cathepsink基因作為靶標(biāo),，篩選對(duì)它有抑制作用的藥物,，就有可能得到治療骨質(zhì)疏松癥的藥物。但是這種方法也有其局限性,，它只能得到mRNA水平的表達(dá)譜,，另外組織一般由多種細(xì)胞組成，而要將這些細(xì)胞分離很困難,。

　　研究正常組織與病理組織基因表達(dá)差異

　　正常組織在病變的過(guò)程中,，往往伴隨著基因表達(dá)模式的變化?；虮磉_(dá)水平的升高或降低,，可能是病變的原因，也可能是病變的結(jié)果,。若基因表達(dá)的變化是病變的原因,，則以此基因?yàn)榘悬c(diǎn)的藥物就可能逆轉(zhuǎn)病變；若基因表達(dá)的變化是病變的結(jié)果,，則以此基因?yàn)榘悬c(diǎn)的藥物就可能減輕病變的癥狀,。DNA芯片技術(shù)可以在病理組織與正常組織之間一次比較成千上萬(wàn)個(gè)基因的表達(dá)變化，找出病理組織中表達(dá)異常的基因,。Heller等提取正常及誘發(fā)病變的巨噬細(xì)胞,、軟骨細(xì)胞系、原代軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞的 mRNA,，用包含細(xì)胞因子,、趨化因子、DNA結(jié)合蛋白及基質(zhì)降解金屬蛋白酶等幾大類(lèi)基因的cDNA芯片進(jìn)行篩選,，發(fā)現(xiàn)了數(shù)種變化明顯的基因,。其中除了有已知與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有關(guān)的TNF，IL－1,，IL－6,，IL－ 8，G－CSF,，RANTES,，VCAM的基因外，還有編碼基質(zhì)金屬?gòu)椥缘鞍酌窰ME,，IL-3,，ICE，趨化因子Groα 等的基因,。而以前認(rèn)為金屬?gòu)椥缘鞍酌钢淮嬖谟诜闻菥奘杉?xì)胞和胎盤(pán)細(xì)胞中,。彈性蛋白酶可以破壞膠原纖維及組織基底膜層，它在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病理組織中的出現(xiàn),，為治療該病提供了新的藥物靶點(diǎn),。

　　利用DNA芯片來(lái)尋找疾病相關(guān)基因的策略尤其適用于病因復(fù)雜的情況。例如,，惡性腫瘤的發(fā)生常常是多基因共同作用的結(jié)果,，DNA芯片技術(shù)在腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)模式及腫瘤相關(guān)基因發(fā)掘中具有重要的作用。Wang等將一些看家基因,、細(xì)胞因子及受體基因,、細(xì)胞分裂相關(guān)基因及其他一些癌基因共5766個(gè)基因的cDNA探針固定在芯片上，對(duì)正常卵巢組織及卵巢癌組織的mRNA進(jìn)行分析,，發(fā)現(xiàn)二者之間30％基因表達(dá)相差2倍以上,，9％相差3倍以上，其中上調(diào)較為明顯的有CD9．上皮糖蛋白（ep ithelial glycoprotein）,、p27及HE蛋白激酶抑制物等,。這些結(jié)果不僅進(jìn)一步證實(shí)了以前用其他方法獲得的結(jié)果，還提供了一些新的信息,。再如,，Kapp 等用包含950個(gè)DNA探針的DNA芯片分析比較霍奇金病細(xì)胞系L428及KMH2與EB病毒永生化的B淋巴細(xì)胞系LGL－GK的基因表達(dá)港，發(fā)現(xiàn)霍奇金病源的細(xì)胞系中白細(xì)胞介素-13（IL－13）及白細(xì)胞介素-5（IL－5）表達(dá)異常增高,；用IL－13抗體處理霍奇金病源的細(xì)胞系可顯著抑制其增殖,。此發(fā)現(xiàn)提示，IL-13可能以自分泌形式促進(jìn)霍奇金病相關(guān)細(xì)胞增殖,。IL-13及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能成為霍奇金病治療及藥

　　物篩選的新靶點(diǎn),。

　　建立模式生物細(xì)胞中的基因表達(dá)模型

　　采用模式生物細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，條件容易控制,，對(duì)模式生物基因表達(dá)的研究將啟發(fā)人們發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)新的藥物作用靶點(diǎn),。目前，已有多種模式生物（如酵母）的基因組計(jì)劃已經(jīng)完成,。釀酒酵母（saccharomvces cerevisi ae）就是一種可用來(lái)進(jìn)行藥物篩選的較為理想的模式生物,。它是真核生物而且基因組已全部測(cè)序，細(xì)胞繁殖快,，易于培養(yǎng),，與哺乳動(dòng)物細(xì)胞有許多共同的生化機(jī)制。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn),，在酵母細(xì)胞中存在許多與人類(lèi)疾病相關(guān)的基因,。如人類(lèi)Werner's綜合征表現(xiàn)出早熟的特征，其細(xì)胞的生活周期變短,。人類(lèi)與此疾病相關(guān)的基因與酵母中編碼DNA解旋酶的 SGS1基因極為相似,。Botstein等得到了SGS1基因突變的酵母菌株，此突變菌株生活周期變短，細(xì)胞的表型特征與患有Werner's綜合征入細(xì)胞相似,。已有一些研究小組根據(jù)公布的酵母基因組序列,，用PCR方法擴(kuò)增了酵母6000多個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）片段,，制成DNA芯片,，在整個(gè)基因組的范圍內(nèi)對(duì)酵母的基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

　　建立病原作基因的表達(dá)模型

　　由于病原體的基因組規(guī)模相對(duì)較小,，可用包含其全部基因的DNA 芯片鑒定那些對(duì)人產(chǎn)生毒害作用的基因,。異煙肼（isoniazid，INH）是治療肺結(jié)核的常用藥物,，其治療結(jié)核病的機(jī)制是它阻斷了分枝茵酸的生物合成途徑,。Wilson等根據(jù)已測(cè)序的肺結(jié)核桿菌基因組序列，用PCR方法擴(kuò)增了3834個(gè)ORF（占全部 ORF的97％）,，固化在玻片上,，制成檢測(cè)肺結(jié)核桿菌基因表達(dá)的DNA芯片。用INH處理敏感菌株,，發(fā)現(xiàn)除了生化途徑已清楚的與分枝菌酸合成相關(guān)的一些基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化外,，還發(fā)現(xiàn)EfpA基因的表達(dá)也被誘導(dǎo)發(fā)生了變化，推測(cè)EfpA基因也參與了分枝菌酸的生物合成,，而EfpA基因只在分枝菌屬中一些致病的種類(lèi)中才存在,，故EfpA基因可以作為治療結(jié)核病的新靶點(diǎn)。另外,，分別用INH和 Ethionamide處理敏感菌株,，獲得了相似的基因表達(dá)譜，證實(shí)了兩者具有相同的作用機(jī)制,。

　　研究藥物處理細(xì)胞后基因未達(dá)變化

　　藥物與細(xì)胞（特別是敏感細(xì)胞）相互作用,，將引起細(xì)胞外部形態(tài)及內(nèi)部正常代謝過(guò)程的一系列變化。其內(nèi)部生理活動(dòng)的變化可集中表現(xiàn)在其基因表達(dá)的變化上,。通過(guò)測(cè)定分析藥物對(duì)細(xì)胞的基因表達(dá)的影響,，可推測(cè)藥物的作用機(jī)制，評(píng)價(jià)藥物活性及毒性,，進(jìn)而確證藥物靶點(diǎn)或者發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn),。通過(guò)DNA芯片測(cè)定藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞基因表達(dá)變化來(lái)進(jìn)行藥物篩選與研究，對(duì)那些用常規(guī)方法很難追蹤監(jiān)測(cè)的藥物或需要很長(zhǎng)時(shí)間才能得到藥物臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí),，顯得尤為有用,。
通過(guò)監(jiān)測(cè)陽(yáng)性藥物處理前后組織細(xì)胞基因表達(dá)變化情況可以獲得許多十分有價(jià)值的信息。首先,，經(jīng)藥物處理后表達(dá)明顯改變的基因往往與發(fā)病過(guò)程及藥物作用途徑密切相關(guān),，很可能是藥物作用的靶點(diǎn)或繼發(fā)事件,，可作為進(jìn)一步藥物篩選的靶點(diǎn)或?qū)σ延械陌悬c(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證；其次,，藥物處理后基因表達(dá)的改變對(duì)藥物作用機(jī)制研究有一定的提示作用,。

　　理論上講，藥物作用誘導(dǎo)的細(xì)胞基因表達(dá)變化應(yīng)與缺失編碼該藥物作用靶點(diǎn)的基因引起的基因表達(dá)變化相似,。Marton等使用含有6065個(gè)釀酒酵母的ORF的DNA芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn),，由免疫抑制劑 FK506誘導(dǎo)的的基因表達(dá)變化在缺失編碼被 FK506抑制的蛋白的基因變種中未觀察到,，但在缺失與FK506作用無(wú)關(guān)的基因變種中卻視察到了,。于是推測(cè)FK506除了與親免蛋白（immunophilins）結(jié)合外還有其他被忽略的作用靶（off－target）。在實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,，他們提出了所謂的解碼器戰(zhàn)略（decoder strategy）,，即首先比較經(jīng)過(guò)藥物作用的野生株和缺失某些基因的變種株的基因表達(dá)譜，若二者相似,，則將這種變種挑選出來(lái),，并將其與藥物作用。如果突變基因所編碼的蛋白質(zhì)參與的生物途徑受藥物的影響,，則藥物誘導(dǎo)該變種的基因表達(dá)變化與藥物誘導(dǎo)野生株基因表達(dá)變化將不同,。用這種策略不僅可以確證藥物作用靶，還可以發(fā)現(xiàn)未曾引起人們注意的作用靶,，并可從這些被忽略掉的靶中推測(cè)藥物的毒副作用,。Cyclin依賴(lài)型激酶（cyclin－dependent kinas es，CDKs）在細(xì)胞增殖中有著重要的作用,，是一種抗腫瘤藥物的靶點(diǎn),。Gray等從2，6,，9,，-三取代嘌呤化合物庫(kù)中篩選CDKs的抑制劑。他們將體外有活性的2種化合物flavopiridol和52（化合物代號(hào)）與酵母作用,，然后用共含有260000個(gè)長(zhǎng)度為25個(gè)堿基的一組寡聚核苷酸芯片檢測(cè)酵母基因表達(dá)變化,。試驗(yàn)結(jié)果表明，幾乎所有的已知與細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào),。雖然flavopiridol和52體外活性相似,，但他們引起的酵母基因表達(dá)的變化卻有顯著的差異，表明二者對(duì)酵母的作用途徑是不一樣的,。
鬼臼亞乙苷（etoposide）是p53活化拓?fù)洚悩?gòu)酶 Ⅱ的抑制劑,，在臨床上作為一種抗腫瘤藥物。Wang 等經(jīng)用鬼臼亞已苷作用人成骨肉瘤細(xì)胞系U2－ OS后,，根據(jù)不同的時(shí)間間隔分別提取細(xì)胞mRNA,，用寡核苷酸芯片測(cè)定6591條mRNA表達(dá)百的變化,，發(fā)現(xiàn)62條mRNA表達(dá)縣有變化。通過(guò)選取其中12條基因做進(jìn)一步研究,，發(fā)現(xiàn)有2條是已知的 p53調(diào)控基因（WAF1／p21和PCNA）,，有兩條是新的p53靶基因，其余的與p53無(wú)關(guān),。在實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,，他們提出了介導(dǎo)鬼臼亞乙苷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。此項(xiàng)研究工作使人們又多獲得一種抗腫痛藥物的靶點(diǎn),。

　　應(yīng)用DNA芯片還可直接篩選特定的基因文庫(kù)以尋找藥物的作用靶點(diǎn),。如給酵母某一特定的呈單倍體狀態(tài)的基因?qū)?yīng)的位置上放置一個(gè)遺傳標(biāo)記，該標(biāo)記可被DNA芯片所識(shí)別,，那么通過(guò)比較藥物作用前后用芯片檢測(cè)整個(gè)文庫(kù)的結(jié)果,，便有可能獲得藥物作用的靶基因。研究者稱(chēng)此種篩選方式為 haploinsufficiency drug screen,。

　　用DNA微陣列芯片進(jìn)行藥物研究還存在如下一些缺點(diǎn)：①由于雜交樣品制備復(fù)雜,，采用DNA微陣列芯片很難實(shí)現(xiàn)高通量。②DNA微陣列芯片只能用于檢測(cè)已知序列的基因,。③由于靈敏度的限制,，采用現(xiàn)存的DNA微陣列芯片難以檢測(cè)到表達(dá)水平很低的基因。

　　除了DNA芯片外,，組織芯片,、蛋白質(zhì)芯片和細(xì)胞芯片也在藥物研究中嶄露頭角。最近,，耶魯大學(xué)的研究小組首次報(bào)道了真核生物蛋白質(zhì)組水平的蛋白質(zhì)微陣列芯片,。他們表達(dá)和純化了酵母的 5800種蛋白質(zhì)，并將這些蛋白質(zhì)點(diǎn)樣固定在載玻片上,，制作了酵母蛋白質(zhì)組微陣列芯片,。他們使用這種芯片篩選能與特定蛋白質(zhì)和磷脂相互作用蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了新的能與鈣調(diào)蛋白和磷脂相互作用的蛋白質(zhì),。這種蛋白質(zhì)微陣列芯片可以用于篩選與蛋白質(zhì)相互作用的藥物,，還可以用于檢測(cè)蛋白質(zhì)翻譯后的修飾。他們的研究成果證實(shí)了制作和使用蛋白質(zhì)組微陣列芯片進(jìn)行功能分析檢測(cè)的可行性,，并向人們預(yù)示了蛋白質(zhì)微陣列芯片在藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域的廣闊應(yīng)用前景,。

　　Zlauddin和Sabatinl發(fā)明了一種細(xì)胞微陣列芯片。他們首先將不同的質(zhì)粒DNA點(diǎn)在玻璃片上,，做成質(zhì)粒DNA做陣列芯片,。接著用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑處理該質(zhì)粒DNA微陣列芯片，然后在處理好的質(zhì)粒DNA微陣列上培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞,。點(diǎn)在芯片上的質(zhì)粒DNA在轉(zhuǎn)染試劑的幫助下原位轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞,，在質(zhì)粒DNA微陣列的每一個(gè)質(zhì)粒樣品點(diǎn)的相同位置形成了轉(zhuǎn)染了該質(zhì)粒的細(xì)胞群,。細(xì)胞因獲得了外源DNA而獲得了新的性狀。這樣,，由質(zhì)粒DNA芯片制成了由不同性狀細(xì)胞組成的細(xì)胞做陣列芯片,。他們嘗試用這種細(xì)胞芯片來(lái)確證藥物作用靶點(diǎn)，尋找能改變細(xì)胞生理狀態(tài)的基因產(chǎn)物,。這種新型細(xì)胞芯片可以用來(lái)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高通量篩選有可能成為候選先導(dǎo)分子的化合物,、蛋白質(zhì)或寡核苷酸。在功能基因組研究和藥物開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力,。

　　2 生物芯片作為超高通量篩選平臺(tái)的應(yīng)用

　　在過(guò)去的十幾年里,，隨著科學(xué)的進(jìn)步以及在巨大的經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使下，藥物篩選技術(shù)得到了飛速的發(fā)展,。在80年代中期（高通量篩選形成之初）,，每天只能篩選30種化合物,，到90年代中期,，每天可篩選1，500種化合物,，而如今每天可篩選超過(guò) 100,，000個(gè)化合物。高速,、低成本的高通量篩選已成為當(dāng)今藥物篩選的主流,，并逐漸向超高通量方向發(fā)展。在過(guò)去的幾年中,，世界上著名的制藥公司紛紛與以高通量藥物篩選技術(shù)為核心的中小型生物科技公司結(jié)盟或合作,，采用高通量或超高通量藥物篩選技術(shù)進(jìn)行先導(dǎo)物分子的篩選。要進(jìn)一步提高篩選率,，高通量篩選技術(shù)的各個(gè)方面均需要技術(shù)創(chuàng)新,，這為生物芯片技術(shù)進(jìn)入藥物篩選領(lǐng)域提供了寶貴的契機(jī)。

　　提高藥物篩選的通量,，實(shí)現(xiàn)超高通量篩選有2 條途徑：一是微型化,，一是自動(dòng)化。生物芯片作為一種新型技術(shù)平臺(tái),，正可滿(mǎn)足超高通量篩選微型化和自動(dòng)化的需要,。生物芯片技術(shù)應(yīng)用于超高通量篩選有2個(gè)發(fā)展方向：一是微孔板/微陣列技術(shù)，一是微流體芯片技術(shù),。

　　微孔板/微陳列技術(shù)

　　微孔板技術(shù)的發(fā)展主要表現(xiàn)在板孔數(shù)的增加,。目前，使用最多的是96孔及384孔板,，也有人使用1536孔,、3456孔,、甚至 9600孔板。如Oldenburg等報(bào)道了用9600孔板（0.2μL/孔）分析系統(tǒng),，以金屬蛋白酶為靶,，對(duì)組合及分離純化的化合物庫(kù)進(jìn)行篩選的結(jié)果。雖然隨著材料科學(xué)和加工技術(shù)的發(fā)展,，微孔板技術(shù)有了長(zhǎng)足的進(jìn)步,，但其發(fā)展面臨著一些不易解決的困難，主要有：微量液體極易蒸發(fā),，不適于那些不能用二甲亞砜（DMSO）作溶劑的篩選方法以及受限于當(dāng)今還不夠完善的微量液體分配技術(shù),。

　　微陣列技術(shù)是將微孔板技術(shù)進(jìn)一步微型化。最近,，哈佛大學(xué)的研究人員開(kāi)發(fā)了化合物微陣列芯片,，主要用于篩選能與特定蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的化合物。他們將玻片表面進(jìn)行化學(xué)處理,，使其衍生化產(chǎn)生活性基團(tuán),，然后將溶于有機(jī)溶劑中的化合物用機(jī)械手點(diǎn)在經(jīng)處理的玻片表面，化合物與玻片表面的活性基團(tuán)反應(yīng)而被固定于玻片表面,，這樣就將不同的化合物排布成微陣列,，固定在玻片表面，制成化合物微陣列芯片,。隨后將感興趣的蛋白質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)記,，然后與微陣列芯片上的化合物反應(yīng)，經(jīng)清洗后,，再進(jìn)行熒光檢測(cè)就可以篩到能與這種蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的化合物,。他們用化合物微陣列芯片進(jìn)行了原理性實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果表明,，使用這種化合物微陣列芯片可以并行,、快速地進(jìn)行大規(guī)模的化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合篩選。他們最先是將玻璃片表面進(jìn)行馬來(lái)酰亞胺衍生化處理,，后來(lái)采用亞硫酰氯處理,，都獲得了成功。他們還嘗試了使用這種化合物微陣列芯片進(jìn)行大規(guī)模對(duì)映異構(gòu)體的分型檢測(cè),。加利福尼亞大學(xué)Davis分校的科學(xué)家們采用類(lèi)似的方法也制造了一種化合物微陣列芯片,。他們對(duì)玻琥載玻片表面進(jìn)行氨基化處理，在氨基玻片上進(jìn)行乙醛酰衍生化,，然后將帶有連接臂的配體分子點(diǎn)在修飾過(guò)的玻片表面,。在進(jìn)行化學(xué)連接反應(yīng)之后，這種固定了不同小分子配體的微陣列芯片被用來(lái)進(jìn)行了3種生物學(xué)檢測(cè)：蛋白質(zhì)結(jié)合檢測(cè)、功能磷酸化檢測(cè)和活細(xì)胞粘附檢測(cè),。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了化合物微陣列芯片可以幫助我們對(duì)由組合合成方法獲得的大量化合物進(jìn)行快速的功能分析和篩選,。化合物微陣列芯片技術(shù)與基于微珠體的固相組合會(huì)成技術(shù)相結(jié)合為高通量藥物篩選帶來(lái)了一條新的途徑,，將對(duì)高通量藥物篩選技術(shù)的發(fā)展產(chǎn)生積極的影響,。

　　最近，出現(xiàn)了一種被稱(chēng)為芯片膜片鉗（patch-on- a－chip）的新技術(shù),。在這種膜片鉗芯片上加工有檢測(cè)電信號(hào)的點(diǎn)陣,，點(diǎn)陣中的每一個(gè)點(diǎn)是一個(gè)電信號(hào)記錄單元，同時(shí)每個(gè)點(diǎn)底部與負(fù)歷相通,，可以吸位細(xì)胞,。這樣膜片鉗芯片上的每一個(gè)點(diǎn)就可以實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)的功能。膜片鉗芯片具有操作簡(jiǎn)單,、快速和可實(shí)現(xiàn)高通量等優(yōu)點(diǎn),，可以用于電生理研究和高通量藥物篩選。位于美國(guó)圣地亞哥的AVIVA公司正在致力于此項(xiàng)技術(shù)的開(kāi)發(fā),。

　　微流體芯片技術(shù)

　　微流體裝置的發(fā)展已廣泛用于生化及細(xì)胞的分析,。鑒于這項(xiàng)技術(shù)在超高通量篩選中的巨大應(yīng)用前景，吸引了眾多學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的實(shí)驗(yàn)室對(duì)該項(xiàng)技術(shù)的研究與開(kāi)發(fā),。借用半導(dǎo)體工業(yè)中所用的光刻技術(shù)將內(nèi)徑在10～100μm的做通道加工在玻璃或硅片中,，利用電動(dòng)泵和流體的壓力來(lái)控制皮,、納升級(jí)液體的流動(dòng),。該技術(shù)可減少幾個(gè)數(shù)量級(jí)的試劑消耗量，并能提高數(shù)據(jù)質(zhì)量,。它所采用的并行樣品處理程序可以獲得更高的篩選通量,。多種類(lèi)型的篩選分析方法在微流體芯片上操作的可行性（包括結(jié)合分析、酶分析和細(xì)胞分析）已得到實(shí)驗(yàn)論證,。

　　Jiang等制造了2種可以用于高通量檢測(cè)食物污染物和進(jìn)行藥物篩選的微流體裝置,。他們以硅為模板，采用模壓和毛細(xì)管成形技術(shù)在聚酯和多聚硅氧烷二甲酯中加工激流體網(wǎng)絡(luò),。在第1種裝置的微通道中夾著一塊PVDF（polyvinylidene fluoride）膜可用來(lái)結(jié)合,、濃縮目標(biāo)化合物，然后再直接通過(guò)質(zhì)譜方法鑒定目標(biāo)化合物,。第2種裝置被用來(lái)超濾分離本巴比妥和苯巴比妥與抗體的復(fù)合物,。整個(gè)過(guò)程包括上樣、清洗和解離都是連續(xù)進(jìn)行的,。這些微流體裝置不僅可以顯著降低系統(tǒng)死體積和所需樣品量,，而且與先前報(bào)道的方法相比靈敏度至少可提高 1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。

　　Capliper Technologies公司設(shè)計(jì)的芯片裝置,，將從微孔板中取樣與隨后進(jìn)行的酶抑制劑篩選結(jié)合在一起,。目前,，該芯片裝置已制作完成，并通過(guò)了測(cè)試,。測(cè)試的化合物通過(guò)與芯片相連的硅毛細(xì)管注射入芯片中,，與酶及熒光酶底物混合以使它們?cè)谥鞣磻?yīng)通道內(nèi)發(fā)生相互作用。酶與熒光底物反應(yīng)產(chǎn)生基線(xiàn)熒光信號(hào),。如果測(cè)試化合物抑制酶的活性,，信號(hào)將會(huì)暫時(shí)性的降低，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度就可以測(cè)定化合物抑制酶的活性,。這種裝置每次進(jìn)樣量 1～10nL,，進(jìn)樣同期10～30s。利用這個(gè)系統(tǒng),，每塊芯片可對(duì)幾千種化合物進(jìn)行篩選,。目前對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)的努力主要集中在提高系統(tǒng)的耐用性和將不同類(lèi)型的篩選方法移植到這個(gè)平臺(tái)上來(lái)。最新設(shè)計(jì)的微流體芯片將液體分發(fā),?；衔锵♂屌c篩選分析 3者集成起來(lái)，由于減少了被視為瓶頸的芯片使用前的準(zhǔn)備步驟,，使得該系統(tǒng)更加方便實(shí)用,。

　　目前，致力于開(kāi)發(fā)微流體芯片技術(shù)并將其應(yīng)用于藥物篩選的公司有：Caliper Technologies,，Orchid

　　BioSciences,，ACLARA BioSciences，Li－Cor等,。

　　3 生物芯片在毒理學(xué)研究中的應(yīng)用

　　對(duì)藥物進(jìn)行毒性評(píng)價(jià),，是藥物篩選過(guò)程中十分重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。現(xiàn)在毒理學(xué)家多采用鼠為模型通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)確定藥物的潛在毒性,。這些方法需要使用大劑量的藥物,，花上幾年時(shí)間，花費(fèi)巨大,。 DNA芯片技術(shù)可將藥物毒性與基因表達(dá)特征聯(lián)系起來(lái),，通過(guò)基因表達(dá)分析便可確定藥物毒性，使得藥物毒性或不期望出現(xiàn)的效應(yīng)在臨床實(shí)驗(yàn)前得以確認(rèn),。用DNA芯片可以在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中同時(shí)對(duì)成千上萬(wàn)個(gè)基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析,，為研究化學(xué)或藥物分子對(duì)生物系統(tǒng)的作用提供全新的線(xiàn)索。該技術(shù)可對(duì)單個(gè)或多個(gè)有害物質(zhì)進(jìn)行分析,，確定化學(xué)物質(zhì)在低劑量條件下的毒性,，分析、推斷有毒物質(zhì)對(duì)不同生物的毒性可比性。如果不同類(lèi)型的有毒物質(zhì)所對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)諾有特征性的規(guī)律,，那么,，通過(guò)比較對(duì)照樣品和有毒物質(zhì)的基因表達(dá)譜，便可對(duì)各種不同的有毒物質(zhì)進(jìn)行分類(lèi),，在此基礎(chǔ)上通過(guò)進(jìn)一步建立合適的生物模型系統(tǒng),，便可通過(guò)基因表達(dá)港變化來(lái)反映藥物對(duì)人體的毒性。

　　已經(jīng)有不少研究工作表明,，利用DNA芯片預(yù)測(cè)化合物毒性和對(duì)毒性物質(zhì)進(jìn)行分類(lèi)是可行的,。 Waring等用15種已知的肝毒性化合物處理大鼠。這些毒物將對(duì)肝細(xì)胞造成多種傷害,，如DNA 損傷,、肝硬化、肝壞死和誘發(fā)肝癌等,。從大鼠肝臟中提取RNA,，用DNA芯片作基因表達(dá)分析。通過(guò)將基因表達(dá)結(jié)果與組織病理分析和臨床化學(xué)分析的結(jié)果進(jìn)行比較,，發(fā)現(xiàn)兩者有很強(qiáng)的相關(guān)性,。該結(jié)果表明，DNA芯片分析是一種可以用來(lái)分析藥物安全性和對(duì)環(huán)境毒物進(jìn)行分類(lèi)的靈敏度較高的方法,。在另一報(bào)道中他們用同樣的15種化合物作用大鼠的肝細(xì)胞,，再用DNA芯片作基因表達(dá)分析，結(jié)果顯示具有相似毒性機(jī)制的化合物所獲得基因表達(dá)譜具有相似性,。Gerhold等給大鼠服用苯巴比妥和地塞米松等藥物,，使用寡核苷酸芯片，檢測(cè)了大鼠肝組織中與藥物代謝,、毒性和能量代謝相關(guān)基因的表達(dá),。最后，通過(guò)分析基因表達(dá)變化的結(jié)果就可以推測(cè)藥物代謝與毒性的情況,。Bartosiewicz等則利用 DNA芯片對(duì)環(huán)境毒物進(jìn)行了檢測(cè)。

　　目前已有多種較為成熟的毒理學(xué)DNA芯片繼問(wèn)世,。美國(guó)國(guó)立環(huán)境衛(wèi)生研究院分子致癌機(jī)制實(shí)驗(yàn)室的Barrett等人研制了一種名為T(mén)oxChip的 DNA芯片,，可以靈敏的檢測(cè)有害化學(xué)物質(zhì)對(duì)人體基因表達(dá)的作用（http：//dir，niehs．nih．gov/dirlmc/ lmcmain．htm）,；Gene Logic公司的產(chǎn)品Flow－thru Chip已經(jīng)試投入商業(yè)運(yùn)用,，可用以檢測(cè)藥物和毒物對(duì)生物體的影響，他們還建立了龐大的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù),，可以用于藥物靶點(diǎn)確認(rèn)和毒性預(yù)測(cè)（http：// www.genelogic．com/geneexp.asp）,；Syngenta公司和AstraZeneca Pharmaceuticals公司的科學(xué)家設(shè)計(jì)制作了被稱(chēng)為T(mén)oxBlot arrays的DNA芯片，其第代產(chǎn)品ToxBlot Ⅱ含有大約13000人的基因，包含了所有毒理學(xué)家感興趣的基因家族和信號(hào)通路,；美國(guó)化學(xué)工業(yè)毒物研究所（Chemical Industry Insti tute of Toxicology）中專(zhuān)門(mén)有一個(gè)工作小組用微陣列 技術(shù)研究一些致癌毒物對(duì)人體的作用（http,；// www．ciit．org/toxicogenomics/construction．html）

　　4 生物芯片在藥物基因組學(xué)中的應(yīng)用

　　藥物基因組學(xué)是在基因組學(xué)的基礎(chǔ)上研究不個(gè)體對(duì)藥物反應(yīng)的差異以便針對(duì)不同的基因型"量身定做"藥物，從而將藥物的藥效充分發(fā)揮而不良反應(yīng)減少到最小,。其優(yōu)點(diǎn)為：①在進(jìn)入臨床試驗(yàn)前,，藥物基因組學(xué)可以通過(guò)化合物對(duì)基因多態(tài)性的影響挑選先導(dǎo)物，從而降低由于藥效的不穩(wěn)定導(dǎo)致的失敗幾率,。②在Ⅰ期臨床試驗(yàn)中,，個(gè)體基因型可以預(yù)見(jiàn)基因多態(tài)性造成的藥物代謝動(dòng)力學(xué)差異。③由于藥物作用靶蛋白的差異反映在基因多態(tài)性上,，因此在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中,，由個(gè)體基因型可以預(yù)見(jiàn)基因多態(tài)性造成的藥效差異，由此來(lái)指導(dǎo)Ⅲ期臨床試驗(yàn) ④一旦發(fā)現(xiàn)一種可以導(dǎo)致藥物作用差異的蛋白,，其他與之相關(guān)的蛋白可作為潛在的藥物作用靶,。

　　將DNA芯片技術(shù)應(yīng)用于藥物基因組學(xué)，一方面可以加速藥物基因組學(xué)的發(fā)展,，主要是利用DNA 芯片進(jìn)行基因功能及其多態(tài)性的研究,，以確認(rèn)與藥物效應(yīng)及藥物吸收、代謝,、排泄等相關(guān)的基因,，并查明這些基因的多態(tài)性；另一方面DNA芯片利用藥物基因組學(xué)的研究成果,，根據(jù)基因型將人分群,，以實(shí)現(xiàn)藥物基因組學(xué)研究的目的和價(jià)值。從這兩方面足以看到DNA芯片技術(shù)對(duì)藥物基因組學(xué)研究的影響之大,。

　　DNA芯片可以自動(dòng),、快速地檢測(cè)那些可以影響藥物效應(yīng)的基因（如藥物代謝酶、藥物作用靶和致病因子的編碼基因）和決定個(gè)人對(duì)藥物毒性敏感性的基因,。Evans和Relling就設(shè)想了一種急性原淋巴細(xì)胞白血病藥物基因組芯片,，這種芯片上包括了所有可能影響急性原淋巴細(xì)胞白血病病人對(duì)化學(xué)治療反應(yīng)的基因，借助這種芯片可以根據(jù)病人的基因型對(duì)病人分群,，幫助醫(yī)生為每個(gè)病人選擇合適的治療藥物和藥物劑量,。

　　5 生物芯片在藥物分析中的應(yīng)用

　　生物芯片在藥物分析中的應(yīng)用主要是指采用毛細(xì)管電泳芯片/質(zhì)譜系統(tǒng)對(duì)化合物庫(kù)、血樣和尿樣中的藥物進(jìn)行分析鑒定,。毛細(xì)管電泳芯片/貢譜系統(tǒng)是指將毛細(xì)管電泳芯片和質(zhì)譜聯(lián)用的一套裝置,。毛細(xì)管電泳芯片進(jìn)行樣品的分離，而與芯片聯(lián)用的質(zhì)譜則有選擇性的對(duì)分離成分進(jìn)行檢測(cè),。美國(guó)康奈爾大學(xué)的Wachs等發(fā)明了一種微型化的離子噴霧裝置,。這種裝置適合于與基于芯片的分離裝置,、多孔板或帶有待測(cè)樣品殘?jiān)谋砻媛?lián)用。這種裝置有兩種版本,，一種稱(chēng)為微型噴霧器,，主要與毛細(xì)管電泳芯片聯(lián)用；另一種稱(chēng)為小型噴霧器,，它帶有伸長(zhǎng)的吸樣毛細(xì)管,，可以插入多孔板孔的底部，所以適合與多孔板聯(lián)用,。這種裝置可以幫助人們對(duì)芯片分離所得樣品或多孔板中樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè),。來(lái)自康奈爾大學(xué)同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的Deng等將玻璃制成的毛細(xì)管電泳芯片與他們自己設(shè)計(jì)的微型離子噴霧裝置連接，使用PE公司的質(zhì)譜系統(tǒng)做檢測(cè),，對(duì)多種藥物的標(biāo)準(zhǔn)和血漿樣品進(jìn)行了分析檢測(cè),。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，使用毛細(xì)管電泳芯片/質(zhì)譜系統(tǒng)對(duì)小分子化合物進(jìn)行快速（30s）的檢測(cè)是可行的,。這套裝置可以用來(lái)對(duì)合成的化合物庫(kù)和人血漿中重要成分進(jìn)行分析檢測(cè),。Ramseier等用芯片毛細(xì)管電泳和使膠毛細(xì)管電泳檢測(cè)尿中苯丙胺及其類(lèi)似物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示芯片毛細(xì)管電泳的方法具有更快的分高速度和更高的分離效率,。Chiem等則用毛細(xì)管電泳芯片檢測(cè)了血清中的茶堿,。

　　6 結(jié)語(yǔ)

　　隨著一浪高過(guò)一浪的生物芯片技術(shù)研發(fā)熱潮，生物芯片技術(shù)在藥物研究與開(kāi)發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用也將更廣泛更深入,。特別值得一提的是,，在今天"回歸自然"思潮的影響下，天然藥物的開(kāi)發(fā)成為一股強(qiáng)大的潮流,，而中藥又以其豐富的資源,、獨(dú)特的療效、較小的不良反應(yīng)引起世界的關(guān)注,；同時(shí)人們也認(rèn)識(shí)到,，從化學(xué)合成物中篩選新藥難度大、費(fèi)用高,、周期長(zhǎng),，于是中藥的研究與開(kāi)發(fā)已成為新藥研發(fā)的熱點(diǎn)。中藥現(xiàn)代化研究的難點(diǎn)就在于中藥成分的復(fù)雜性和中藥作用機(jī)制的復(fù)雜性,。生物芯片由于具有高通量（或超高通量）,、并行性、低消耗,、微型化、自動(dòng)化的特點(diǎn),，將尤其適合于中藥的研究與開(kāi)發(fā),。例如香港城市大學(xué)的生物芯片研究小組就利用DNA微陣列芯片研究了中藥對(duì)腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)的影響,；他們還致力于開(kāi)發(fā)能對(duì)中藥有效成分進(jìn)行分離和篩選的生物芯片系統(tǒng)。香港理工大學(xué)的的研究小組采用DNA芯片對(duì)中藥進(jìn)行基因分型,，從而鑒定中藥的品種,。生物芯片北京國(guó)家工程研究中心采用自行研制的酵母全基因組DNA芯片，與北京大學(xué)藥學(xué)院生物技術(shù)室合作研究了多種抗真菌中藥的作用機(jī)制,?？梢灶A(yù)見(jiàn)，生物芯片技術(shù)將在中藥現(xiàn)代化研究與開(kāi)發(fā)中大顯身手,。

　　隨著中國(guó)加入WTO日程的日益臨近,，我國(guó)的制藥工業(yè)面臨著知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)的強(qiáng)大壓力。加緊研究開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的藥物已迫在眉睫,。目前國(guó)外幾乎所有的大制藥公司都不約而同地采用了生物芯片技術(shù),。我國(guó)在該領(lǐng)域雖然起步較晚，但潛力較大,，以此作為突破口,，將生物芯片技術(shù)應(yīng)用于創(chuàng)新藥物的研究與開(kāi)發(fā)以及中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究將一定能夠取得令人矚目的成績(jī)。

（生物芯片北京國(guó)家工程研究中心,，鄧沱,，程京）（清華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)系，鄧沱,，周玉祥,，程京）