互補(bǔ)雜交要根據(jù)探針的類(lèi)型、長(zhǎng)度以及研究目的來(lái)選擇優(yōu)化雜交條件,。如用于基因表達(dá)檢測(cè),，雜交時(shí)需要高鹽濃度、樣品濃度高、低溫和長(zhǎng)時(shí)間(往往要求過(guò)夜),，但嚴(yán)謹(jǐn)性要求則比較低,，這有利于增加檢測(cè)的特異性和低拷貝基因檢測(cè)的靈敏度；若用于突變檢測(cè),，要鑒別出單堿基錯(cuò)配,，需要故需要在短時(shí)間內(nèi)(幾小時(shí))、低鹽,、高溫條件下高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交,。多態(tài)性分析或者基因測(cè)序時(shí)，每個(gè)核苷酸或突變位都必須檢測(cè)出來(lái),，通常設(shè)計(jì)出一套四種寡聚核酸,，在靶序列上跨越每個(gè)位點(diǎn)，只在中央位點(diǎn)堿基有所不同,，根據(jù)每套探針在某一特點(diǎn)位點(diǎn)的雜交嚴(yán)謹(jǐn)程度,，即可測(cè)定出該堿基的種類(lèi)。
雜交反應(yīng)還必須考慮雜交反應(yīng)體系中鹽濃度,、探針GC含量和所帶電荷,、探針與芯片之間連接臂的長(zhǎng)度及種類(lèi)、檢測(cè)基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響,。有資料顯示探針和芯片之間適當(dāng)長(zhǎng)度的連接臂可使雜交效率提高150倍,。連接臂上任何正或負(fù)電荷都將減少雜交效率。由于探針和檢測(cè)基因均帶負(fù)電荷,，因此影響他們之間的雜交結(jié)合,，為此德國(guó)癌癥研究院的Jorg Hoheisel等提出用不帶電荷的肽核酸（PNA）做探針效果更好。雖然PNA的制備比較復(fù)雜,，但與DNA探針比較有許多特點(diǎn),，如不需要鹽離子，因此可防止檢測(cè)基因二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成及自身復(fù)性,。由于PNA-DNA結(jié)合更加穩(wěn)定和特異,，因此更有利于單堿基錯(cuò)配基因的檢測(cè)。我們?cè)谶@里簡(jiǎn)單介紹一些常用雜交試劑和消耗品
對(duì)于商品化的芯片和Array類(lèi)產(chǎn)品,，通常都有配套的雜交試劑以方便使用,。例如：
1. Clontech公司的Altas Glass Microarrays，產(chǎn)品已經(jīng)包含GlassHyb™ Hybridization Solution和GlassHyb™ Wash Solution,，能有效縮短雜交時(shí)間,，提高信噪比。同時(shí)還提供了方便使用的Altas Glass Hybridization Chamber,，旋蓋式的設(shè)計(jì)和1.8ml的容積,，避免了傳統(tǒng)coverslip式雜交盒的弊端,。可以單獨(dú)購(gòu)買(mǎi),。
7899-1 Altas Glass Hybridization Chamber each
8016-1 GlassHyb™ Hybridization Solution 50ml
2. Clontech ExpressHyb Hybridization Solution快速雜交液能有效加快雜交速度,，減少雜交時(shí)間，同時(shí)提高靈敏度,。適用于各種基于膜的核酸雜交反應(yīng),，如cDNA Array、Southern,、Northern,、菌落原位雜交，特別是Clontech公司的Altas系列,、MTN系列,、MTE系列的各種膜基質(zhì)的Macroarray,。在 這些系列的產(chǎn)品中均配有快速雜交液樣品,。由于膜可以反復(fù)使用，通常需要另外購(gòu)買(mǎi)快速雜交液,。
8015-1 ExpressHyb Hybridization Solution 250ml
8015-2 ExpressHyb Hybridization Solution 500ml
3. 對(duì)于自己制作的芯片,，可以自行配置雜交緩沖液，也可以參考Ambion公司提供的幾種Glass Array 雜交緩沖液,。SlideHyb™ Glass Array Hybridization Survey Kit是專(zhuān)為玻片或者尼龍膜基質(zhì)的玻片DNA Array優(yōu)化雜交條件而設(shè)計(jì)的,。由于芯片的雜交條件受多種因素的影響，Ambion認(rèn)為很難找到一種適用于所有芯片的雜交緩沖液,。在這個(gè)試劑盒中提供了4種嚴(yán)謹(jǐn)程度不同的雜交液,，供不同的需要。1號(hào)緩沖液的雜交條件是最嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?，背景最低?,、3號(hào)的靈敏度相應(yīng)提高而背景也相應(yīng)升高，4號(hào)緩沖液沒(méi)有去垢劑,。這些雜交液可以單獨(dú)購(gòu)買(mǎi),，連預(yù)先配好的SDS、SSC等常用緩沖液都可以在Ambion買(mǎi)到,。畢竟在芯片這樣精密的實(shí)驗(yàn)中,，在這么小的一個(gè)點(diǎn)上的DNA的量是非常有限的，要得到理想的結(jié)果需要非常精確的反應(yīng)條件,。Ambion 同樣提供芯片雜交盒,，抗化學(xué)腐蝕，耐70度高溫,，一次可放三張片,。
Cat.No. Product Name Size
1860 SlideHyb™GlassArray Hybridization Survey Kit 100rxns
8861 SlideHyb™ Glass Array Hybridization Buffer#1 5 x 2 ml
8862 SlideHyb™ Glass Array Hybridization Buffer #2 5 x 2 ml
8863 SlideHyb™ Glass Array Hybridization Buffer #3 5 x 2 ml
8864 SlideHyb™ Glass Array Hybridization Buffer #4 5 x 2 ml
10040 Glass Array Hybridization Cassette 1 each
4. Ambion同樣提供適用于各種核酸膜雜交的雜交液和Wash Buffer,，精心優(yōu)化的反應(yīng)條件有效提高雜交靈敏度和降低背景，已經(jīng)經(jīng)過(guò)ULTRArray™ (Ambion), Atlas™(Clontech),，LifeGrid™ (Incyte Genomics), GeneFilter® (Research Genetics), and Panorama™ (Sigma-Genosys) arrays等產(chǎn)品驗(yàn)證,。
Cat# ProductName Size
7118 Yeast RNA 10 x 10 mg/ml
8665 ULTRArray™ Hybridization Buffer 225 ml
8666 ULTRArray™ Hybridization Buffer 500 ml
8667 ULTRArray™ Low Stringency Wash Buffer 1 L
8668 ULTRArray™ High Stringency Wash Buffer 1 L
9680 Salmon Sperm DNA (sheared) 10x10 mg/ml
9763 20X SSC 1 L
9765 20X SSC 4 x 1 L
9780 RNaseZap® 250 ml
圖象的采集和分析
當(dāng)生物芯片和樣品探針雜交完畢后，就需要對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行圖象采集和分析,。一般膜芯片的雜交都用同位素p32,、p33作標(biāo)記，其信號(hào)的檢測(cè)需通過(guò)傳統(tǒng)的磷光成像系統(tǒng)來(lái)完成,。而對(duì)于用熒光標(biāo)記的玻璃芯片雜交后的檢測(cè),，則需要用專(zhuān)門(mén)的熒光芯片掃描儀。
1. 磷感屏成像系統(tǒng)Cyclone Storage Phosphor System
Cyclone磷屏成像系統(tǒng)為美國(guó)Packard公司生產(chǎn)的第一臺(tái)集高分辨率,、高靈敏度和5個(gè)數(shù)量級(jí)的線(xiàn)性范圍于一身的計(jì)算機(jī)控制數(shù)字化自動(dòng)放射成像分析系統(tǒng),，由于其使用方便、快捷,、自動(dòng)化程度,、分辨率、圖像清晰度均很高,，既可定位亦可定量,，目前已廣泛應(yīng)用于核醫(yī)藥學(xué)、細(xì)胞與分子生物學(xué),、生物化學(xué),、藥理學(xué)、基因工程學(xué),、藥物代謝動(dòng)力學(xué),、放射免疫及受體免疫等多方面實(shí)驗(yàn)研究，成為十分方便的有力工具,。其優(yōu)異品質(zhì)主要得益于Packard專(zhuān)利的激光技術(shù)和共聚焦成像系統(tǒng),。應(yīng)用范圍為我們前面介紹的DNA Macroarray以及Northern、Southern,、Western Blot.,，手工測(cè)序，放射性原位雜交等的同位素結(jié)果檢測(cè),。使用Cyclon磷屏可以大大縮短研究周期,，獲得清晰的分辨率。
其工作原理在于：同位素標(biāo)記的雜交結(jié)果在磷屏上曝光,，曝光過(guò)程32P等核素核衰變同時(shí)發(fā)射β射線(xiàn),，首先激發(fā)磷屏上分子，使磷屏吸收能量分子發(fā)生氧化反應(yīng),，以高能氧化態(tài)形式儲(chǔ)存在磷屏分子中,。激光掃描磷屏,，對(duì)于激發(fā)態(tài)高能氧化態(tài)磷屏分子發(fā)生還原反應(yīng)，即從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)多余的能量以光子形式釋放,，從而在PMT捕獲進(jìn)行光電轉(zhuǎn)換,，磷屏分子回到還原態(tài)。計(jì)算機(jī)接受電信號(hào),，經(jīng)處理形成屏幕圖像,，并進(jìn)一步分析和定量。一般化學(xué)發(fā)光物質(zhì)如熒光染料標(biāo)記樣品成像過(guò)程與放射性類(lèi)似,。
系統(tǒng)特點(diǎn)
放射性自顯影成像系統(tǒng),。儲(chǔ)存式磷屏根據(jù)不同樣品厚度、射線(xiàn)能量有多種型號(hào)磷屏可供選擇,，磷屏可以多次重復(fù)使用,。
靈敏度較X光片高數(shù)十倍，可以檢測(cè)最弱的信號(hào),。曝光時(shí)間可以縮短20倍以上,。
快速成像，從對(duì)磷屏進(jìn)行掃描到獲得完整的的數(shù)字化圖像,，總共需要不到10min的時(shí)間,，實(shí)時(shí)圖像顯示,，同時(shí)立即報(bào)告分析結(jié)果,。
可對(duì)放射性位置和強(qiáng)度進(jìn)行相關(guān)的定位、定量分析,，寬達(dá)105的線(xiàn)性范圍,，定量準(zhǔn)確。
不需膠片,、暗室設(shè)備,、沖洗底片，一步到位完成分析過(guò)程,。
可選配Ouant ArrayTM 軟件,，用于尼龍膜上同位素標(biāo)計(jì)的Gene Array定量分析。
2. 熒光芯片掃描儀
由于雜交時(shí)產(chǎn)生序列重疊,，會(huì)有成百上千的雜交點(diǎn)出現(xiàn)在圖譜上,，形成極為復(fù)雜的雜交圖譜。序列重疊雖然可為每個(gè)堿基的正確讀出提供足夠的信息,，可提高序列分析的可靠性,，但同時(shí)信息處理量也大大增加了。一般說(shuō)來(lái),，這些圖譜的多態(tài)性處理與存儲(chǔ)都由專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的軟件來(lái)完成,，而不是通過(guò)對(duì)比進(jìn)行人工讀譜,。用計(jì)算機(jī)處理即可給出目的基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)信息。掃描一張10cm2的芯片大概需要2-6分種的時(shí)間,。目前專(zhuān)用于熒光掃描的掃描儀根據(jù)原理不同大致分為兩類(lèi)：一是激光共聚焦顯微鏡的原理, 是基于PMT（photomultiplier tube,，光電倍增管）的檢測(cè)系統(tǒng)（另文介紹）；另一種是CCD（charge-coupled devices,，電荷偶合裝置）攝像原理檢測(cè)光子,。CCD一次可成像很大面積的區(qū)域，而以PMT為基礎(chǔ)的熒光掃描儀則是以單束固定波長(zhǎng)的激光來(lái)掃描,，因此或者需要激光頭,，或者需要目的芯片的機(jī)械運(yùn)動(dòng)來(lái)使激光掃到整個(gè)面積，這樣就需要耗費(fèi)較多的時(shí)間來(lái)掃描,；但是CCD有其缺點(diǎn)：目前性能最優(yōu)越的CCD數(shù)字相機(jī)的成像面積只有16×12mm（像素為10μm）,，因此要達(dá)到整個(gè)芯片的面積20×60mm的話(huà)，需要數(shù)個(gè)數(shù)碼相機(jī)同時(shí)工作,，或者也可以以降低分辨率為代價(jià)來(lái)獲得掃描精度不是很高的圖像,。由于靈敏度和分辯率較低，比較適合臨床診斷用,。
生產(chǎn)商業(yè)化掃描儀的公司包括：Genomic Solutions公司,、Packard公司、GSI公司,、Molecular Dynamics,、Genetic Microsystems公司、Axon ?Instruments公司等,。其中GSI Lumonics 公司ScanArray 系列一直是生物芯片掃描檢測(cè)系統(tǒng)中的領(lǐng)頭產(chǎn)品,。2000GSI并入著名的Parkard公司后ScanArray的軟、硬件都得到進(jìn)一步加強(qiáng),。
ScanArray利用其專(zhuān)利的激光共聚焦光學(xué)系統(tǒng),，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制，對(duì)生物芯片的熒光雜交信號(hào)進(jìn)行全自動(dòng)的掃描采集,，并通過(guò)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行定量分析,。
最高靈敏度高：<0.1熒光分子/μm
掃描精度可從5μm-50μm分級(jí)調(diào)整
全范圍掃描時(shí)間僅需5分鐘，快速方便
多達(dá)十種檢測(cè)濾光片,，涵蓋所有生物芯片熒光染料的檢測(cè),，適用于多種熒光標(biāo)記探針
不同波長(zhǎng)依次掃描避免交叉光污染
掃描后的圖像還需要進(jìn)一步的處理，這要求一定的軟件支持?，F(xiàn)有的分析軟件包括：Biodiscovery的ImaGene系列,，Axon Instruments的GenePix系列，GSI的QuantArray等
3. 基因芯片上各克隆熒光信號(hào)的分析原理
用激光激發(fā)芯片上的樣品發(fā)射熒光,，嚴(yán)格配對(duì)的雜交分子,，其熱力學(xué)穩(wěn)定性較高,，熒光強(qiáng)；不完全雜交的雙鍵分子熱力學(xué)穩(wěn)定性低,，熒光信號(hào)弱（不到前者的1/35~1/5）,，不雜交的無(wú)熒光。不同位點(diǎn)信號(hào)被激光共焦顯微鏡,，或落射熒光顯微鏡等檢測(cè)到,，由計(jì)算機(jī)軟件處理分析，得用激光激發(fā)芯片上的樣品發(fā)射熒光,，嚴(yán)格配對(duì)的雜交分子,，其熱力學(xué)穩(wěn)定性較高，熒光強(qiáng),；不完全雜交的雙鍵分子熱力學(xué)穩(wěn)定性低,，熒光信號(hào)弱（不到前者的1/35~1/5）（2），不雜交的無(wú)熒光,。不同位點(diǎn)信號(hào)被激光共焦顯微鏡,，或落射熒光顯微鏡等檢測(cè)到，由計(jì)算機(jī)軟件處理分析,，得到到有關(guān)基因圖譜,。美國(guó)GSI ?Lumonics 公司開(kāi)發(fā)出專(zhuān)專(zhuān)業(yè)基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)(ScanArray 系列),采用激光共聚焦掃描原理進(jìn)行熒光信號(hào)采集，由計(jì)算機(jī)處理熒光信號(hào),，并對(duì)每個(gè)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度數(shù)字化后進(jìn)行分析,。利用QuantArray軟件包對(duì)掃描的熒光信號(hào)進(jìn)行分析，比
較每個(gè)克隆在不同組織間表達(dá)水平的差別,。軟件具體分析步驟如下：
首先,，同時(shí)導(dǎo)入同一區(qū)域兩個(gè)channel掃描的圖像文件；將兩個(gè)channel掃描的圖像用不同的顏色顯示并重疊,；選擇擬分析的區(qū)域，輸入矩陣的行數(shù)及列數(shù)以及矩陣的個(gè)數(shù)等參數(shù),；在計(jì)算機(jī)給出的該區(qū)域信號(hào)圖片上標(biāo)定網(wǎng)格,，使得網(wǎng)格中所包含的橫線(xiàn)和豎線(xiàn)的交點(diǎn)個(gè)數(shù)同每個(gè)區(qū)域點(diǎn)樣的克隆數(shù)相同，調(diào)整網(wǎng)格,，使每個(gè)交點(diǎn)均位于點(diǎn)樣克隆信號(hào)的中心,；信號(hào)的中心確定后，計(jì)算機(jī)將自動(dòng)以交點(diǎn)為中心,，按照設(shè)定的半徑圈定各克隆,，并將其內(nèi)部區(qū)域作為待分析的信號(hào)，同時(shí)在圈定的各克隆周?chē)侔凑疹A(yù)設(shè)的值圈定一定范圍的區(qū)域,，將該區(qū)域內(nèi)的信號(hào)作為背景噪音,；計(jì)算機(jī)分析每個(gè)克隆扣除背景噪音后的信號(hào)強(qiáng)度,，并按照不同的要求對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；利用GenePie方式對(duì)兩個(gè)channel信號(hào)的進(jìn)行定量比較分析,，此時(shí)計(jì)算機(jī)根據(jù)各克隆兩個(gè)channel掃描的信號(hào),，以餅圖的形式給出兩個(gè)channel信號(hào)強(qiáng)度的相對(duì)比例，同時(shí)可以逐個(gè)克隆讀取計(jì)算機(jī)分析出的兩個(gè)channel信號(hào)的值及所占的比例,，進(jìn)而確定各克隆在兩種組織間的表達(dá)差異,。
4. Microarray數(shù)據(jù)分析
Microarray數(shù)據(jù)分析簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是對(duì)Microarray高密度雜交點(diǎn)陣圖象處理并從中提取雜交點(diǎn)的熒光強(qiáng)度信號(hào)進(jìn)行定量分析，通過(guò)有效數(shù)據(jù)的篩選和相關(guān)基因表達(dá)譜的聚類(lèi),，最終整合雜交點(diǎn)的生物學(xué)信息,，發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)譜與功能可能存在的聯(lián)系。
Microarray數(shù)據(jù)分析主要包括圖象分析(Biodiscovery Imagene 4.0\Quantarray分析軟件),、標(biāo)準(zhǔn)化處理（normalization）,、Ratio值分析、基因聚類(lèi)分析（Gene Clustering）,。
1. 圖象分析：激光掃描儀Scaner得到的Cy3/Cy5圖象文件通過(guò)劃格（Griding）,，確定雜交點(diǎn)范圍，過(guò)濾背景噪音,，提取得到基因表達(dá)的熒光信號(hào)強(qiáng)度值,，最后以列表形式輸出。
2. 標(biāo)準(zhǔn)化處理（Normalization）：由于樣本差異,、熒光標(biāo)記效率和檢出率的不平衡,，需對(duì)cy3和cy5的原始提取信號(hào)進(jìn)行均衡和修正才能進(jìn)一步分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，Normalization正是基于此種目的,。Normalization的方法有多種：一組內(nèi)參照基因（如一組看家基因）校正Microarray所有的基因,、陽(yáng)性基因、陰性基因,、單個(gè)基因,。
3. Ratio分析(Ratio Analysis)：cy3/cy5的比值，又稱(chēng)R/G值,。一般0.5-2.0范圍內(nèi)的基因不存在顯著表達(dá)差異,，該范圍之外則認(rèn)為基因的表達(dá)出現(xiàn)顯著改變。由于實(shí)驗(yàn)條件的不同,，此域值范圍會(huì)根據(jù)可信區(qū)間有所調(diào)整,。處理后得到的信息再根據(jù)不同要求以各種形式輸出，如柱形圖,、餅形圖,、點(diǎn)圖、原始圖象拼圖等。將每個(gè)Spot的所有相關(guān)信息如位標(biāo),、基因名稱(chēng),、克隆號(hào)、PCR結(jié)果,、信號(hào)強(qiáng)度,、Ratio值等自動(dòng)關(guān)聯(lián)并根據(jù)需要篩選數(shù)據(jù)。每個(gè)Spot的原始圖象另存文件,，可根據(jù)需要任意排序,，得到原始圖象的拼圖，對(duì)于結(jié)果分析十分有利,。
4. 聚類(lèi)分析(Clustering Analysis)：實(shí)際是一種數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,。通過(guò)建立各種不同的數(shù)學(xué)模型，可以得到各種統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果,，確定不同基因在表達(dá)上的相關(guān)性,，從而找到未知基因的功能信息或已知基因的未知功能。Gene Clustering就是根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析原理,，對(duì)具有相同統(tǒng)計(jì)行為的多個(gè)基因進(jìn)行歸類(lèi)的分析方法,，歸為一個(gè)簇的基因在功能上可能相似或關(guān)聯(lián)。目前以直觀圖形顯示GeneCluster結(jié)果的程序已有人開(kāi)發(fā)出來(lái),，可將抽象的數(shù)據(jù)結(jié)果轉(zhuǎn)化成直觀的樹(shù)形圖,，便于研究人員理解和分析。
盡管基因芯片技術(shù)受到了廣泛關(guān)注,，但在基因表達(dá)譜分析中起著關(guān)鍵作用的生物信息學(xué)卻沒(méi)能引起大家的足夠重視,，認(rèn)為簡(jiǎn)單人工處理一下原始數(shù)據(jù)就可以得到有價(jià)值的生物學(xué)信息，大量有價(jià)值的信息就這樣被浪費(fèi)和湮沒(méi)了,?？梢钥隙ǖ卣f(shuō)，沒(méi)有生物信息學(xué)的有效參與,，基因芯片技術(shù)就不能發(fā)揮最大效能,。加大基因芯片技術(shù)中生物信息學(xué)的研究開(kāi)發(fā)力度已成為當(dāng)務(wù)之急。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)進(jìn)行了有益的嘗試,，初步開(kāi)發(fā)出供芯片平臺(tái)管理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的軟件包,，就目前實(shí)際情況來(lái)看，生物信息學(xué)在基因芯片研究開(kāi)發(fā)中介入的程度已經(jīng)越來(lái)越深,，主要涉及基因表達(dá)信息分析管理系統(tǒng)及其分析工具和分析方法，簡(jiǎn)單概括為以下幾個(gè)方面：
基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)
基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)是整個(gè)基因表達(dá)信息分析管理系統(tǒng)的核心,。Microarray數(shù)據(jù)庫(kù)起著數(shù)據(jù)儲(chǔ)存和查詢(xún),、各種相關(guān)信息的整合的作用。Microarray數(shù)據(jù)庫(kù)可以包含用戶(hù)的管理信息、原始實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖象文件,、信號(hào)強(qiáng)度值,、背景平均值行列號(hào)、基因號(hào)等）,、各種實(shí)驗(yàn)參數(shù)（Plates/unigene/Sets/Clusters）,、探針相關(guān)信息、 clone相關(guān)信息（基因名稱(chēng),、基因序列,、GenBank accession號(hào)、克隆標(biāo)志符（IMAGE和內(nèi)部）,、代謝途徑標(biāo)志符,、內(nèi)部克隆標(biāo)志符）、分析處理結(jié)果,、芯片設(shè)計(jì)相關(guān)的資源和數(shù)據(jù),，等等。
分析方法：
選擇分析方法的基本標(biāo)準(zhǔn)：能夠簡(jiǎn)化原始數(shù)據(jù),，結(jié)果直觀,，使研究者能在海量基因表達(dá)數(shù)據(jù)中解析出正確的基因表達(dá)譜和功能信息。一個(gè)理想的分析方法是建立在合理的算法基礎(chǔ)之上的,，應(yīng)該能全面綜合并直觀地解析原始數(shù)據(jù),，修正已有數(shù)據(jù)，并從結(jié)構(gòu),、序列,、功能之間找到新聯(lián)系。目前已有報(bào)道用于microarray數(shù)據(jù)分析的方法主要有以下幾種：
手工分類(lèi)法（Manual classification Method）
該方法在Botstein 實(shí)驗(yàn)室的Michael Eisen提出新的分析方法之前是唯一用來(lái)分析microarray數(shù)據(jù)的方法,。其基本原理是通過(guò)對(duì)microarray的ratio值從大到小排序,，篩出表達(dá)顯著性改變的基因。結(jié)果可直觀地從二維plot圖得到,。優(yōu)點(diǎn)是能夠有效篩選潛在的腫瘤標(biāo)記基因和藥物靶位點(diǎn),；可以構(gòu)建多組基因誘導(dǎo)或抑制的時(shí)間表達(dá)譜。缺點(diǎn)是結(jié)論過(guò)于簡(jiǎn)單,；很難發(fā)現(xiàn)更高層次功能線(xiàn)索,；處理耗時(shí)且不能充分利用數(shù)據(jù)，也不能發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤,。
非監(jiān)督聚類(lèi)法(Unsupervised Clustering)又稱(chēng)配對(duì)平均連鎖聚類(lèi)分析(Pairwise average-linkage cluster analysis),。該方法是分層聚類(lèi)的一種形式，非常類(lèi)似系統(tǒng)發(fā)生分析,。該方法是基于標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)系數(shù)的計(jì)算,。K -mean方法是unsupervised聚類(lèi)法的一個(gè)變化，目前Stanford University 的Botstein實(shí)驗(yàn)室和NHGRI的Trent實(shí)驗(yàn)室都采用該分析方法?！?/p>
混合聚類(lèi)法(Hybrid clustering approach)該聚類(lèi)方法通過(guò)將每一數(shù)據(jù)點(diǎn)傅立葉變換尋找那些表達(dá)呈周期性變化的基因,，比如細(xì)胞周期涉及的基因。所謂混合聚類(lèi)就是先unsupervised聚類(lèi)再supervised聚類(lèi),。優(yōu)點(diǎn)是可以整合以前手工聚類(lèi)法得到的數(shù)據(jù),；尤其適合確認(rèn)細(xì)胞周期調(diào)控的特征性表達(dá)譜。
神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法(Neural network approach)運(yùn)用自組織圖（Self organizing maps）并結(jié)合supervised法進(jìn)行聚類(lèi),。優(yōu)點(diǎn)是分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)明確,；優(yōu)化的次序好于其它聚類(lèi)法；用一種次序風(fēng)格處理大量數(shù)據(jù)易于被生物學(xué)家接受,。
生物芯片（DNA微陣列）熒光掃描儀中的激光共聚焦掃描技術(shù)
吳嵐君
（北京放射醫(yī)學(xué)研究所 100850）
所有的微陣列上的熒光須經(jīng)熒光掃描裝置來(lái)分析其上的熒光強(qiáng)度和分布,，在這些裝置中，激光共聚焦掃描儀具有優(yōu)越的性能,，能獲取高質(zhì)量的圖像和數(shù)據(jù),，本文將分別介紹微陣列的相關(guān)特性和各種類(lèi)型的微陣列掃描儀，激光共聚焦掃描儀的設(shè)計(jì)和關(guān)鍵特性,，另外還將介紹一種已商品化的激光共聚焦熒光掃描裝置,。
微陣列是由分子整齊排列于固相表面，這些分子與熒光分子結(jié)合,，測(cè)定熒光分子的強(qiáng)度后可推知結(jié)合分子的濃度,。固相部分主要有經(jīng)過(guò)表面化學(xué)處理的玻璃片如22mmχ75mm的載玻片。在微陣列上包被的分子常常能與多種熒光探針通過(guò)化學(xué)鍵相互作用而聯(lián)結(jié),，通常情況下能聯(lián)結(jié)兩種熒光分子,，例如在檢測(cè)不同樣品的基因表達(dá)的區(qū)別時(shí)，可將其中一樣品（如正常組織）標(biāo)記上發(fā)綠光的熒光分子,，將另一種樣品如腫瘤組織或發(fā)病組織標(biāo)記上另一種發(fā)紅光的熒光分子,，用兩種波長(zhǎng)的激光激發(fā)微陣列上的樣品，通過(guò)比較兩種熒光在微陣列上某點(diǎn)的比例得知某類(lèi)基因在兩種組織中的差異,。
微陣列上有樣品組成的點(diǎn)陣,，除了點(diǎn)之外，余下的是背景,。如果玻璃片未經(jīng)過(guò)表面化學(xué)處理,，樣品在玻片上結(jié)合不牢固，且容易擴(kuò)散,，造成背景高,。若玻璃片經(jīng)過(guò)表面化學(xué)處理后，點(diǎn)樣的樣品在微陣列上結(jié)合牢固,，點(diǎn)的直徑小,，不擴(kuò)散,，從而點(diǎn)的密度增加,，在進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)分析時(shí),，儀器將點(diǎn)上的熒光強(qiáng)度與點(diǎn)周?chē)谋尘皬?qiáng)度相比較，如果背景中含有與熒光波段相一致的物質(zhì),，則背景強(qiáng)度增高,，樣品的熒光信號(hào)將減弱，干擾信號(hào)的讀取,。
點(diǎn)陣上的點(diǎn)直徑范圍為25mm-500mm,，通常目前能達(dá)到的直徑為100mm±50，科學(xué)家們正在努力減小直徑,。因?yàn)辄c(diǎn)直徑的變化對(duì)掃描結(jié)果的讀取產(chǎn)生影響,，如果點(diǎn)的直徑大，熒光分子擴(kuò)散的范圍也大,，則觀察到的熒光強(qiáng)度相對(duì)較弱,。
若在玻片上有灰塵或其它雜質(zhì)如衣物纖維、皮屑,、指紋等,，掃描結(jié)果將受到影響。微陣列上的點(diǎn)干燥后形成很薄的層,，使得激光共聚焦掃描成為可能,，精心地調(diào)整掃描儀的焦距，可避免檢測(cè)出不需要的背景雜質(zhì),，包括微陣列上的灰塵,、玻璃中自帶的熒光雜質(zhì)產(chǎn)生的干擾信號(hào)均可通過(guò)激光共聚焦的方式將其減少到最低程度。因?yàn)殡s交因素影響,，在微陣列上點(diǎn)與點(diǎn)之間的熒光強(qiáng)度差別很大,。對(duì)微陣列掃描儀的要求要能夠有較寬范圍的靈敏度，通常來(lái)說(shuō),，靈敏度調(diào)整范圍為10000：1,。
當(dāng)熒光化合物或染料受到激光激發(fā)后將釋放出熒光，在某一波長(zhǎng)下有一最高釋放強(qiáng)度,。各種熒光化合物有各自特定的激發(fā)吸收值,。如圖1是FITC的波長(zhǎng)對(duì)熒光激發(fā)強(qiáng)度曲線(xiàn)。從曲線(xiàn)圖可見(jiàn),，在494納米波長(zhǎng)下,，有一激發(fā)高峰，在518納米下有一釋放高峰,，釋放與激發(fā)高峰波長(zhǎng)相差24納米,，這一現(xiàn)象在微陣列使用的染料中較普遍,。兩高峰波長(zhǎng)的差值在專(zhuān)業(yè)上稱(chēng)之為Strokes shift, 初看曲線(xiàn)圖人們可能會(huì)以為：FITC在510納米的波長(zhǎng)激發(fā)下，在475-510納米范圍內(nèi)將釋放部分熒光,，其實(shí)并不盡然,；釋放波長(zhǎng)一般情況下大于激發(fā)波長(zhǎng)，在圖中的激發(fā)曲線(xiàn)不是與釋放曲線(xiàn)同時(shí)繪制的,，將它們放在同一坐標(biāo)圖中是為了便于觀看,，其實(shí)它們是兩套不同的數(shù)據(jù)。激發(fā)曲線(xiàn)的繪制過(guò)程如下：在單一長(zhǎng)波長(zhǎng)下,，變換激發(fā)波長(zhǎng)在不同波長(zhǎng)下測(cè)定熒光釋放強(qiáng)度,，釋放熒光曲線(xiàn)的繪制過(guò)程則是在最長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)下開(kāi)始增加波長(zhǎng)，測(cè)定在不同波長(zhǎng)下的熒光釋放強(qiáng)度,。微陣列掃描儀設(shè)計(jì)者通過(guò)閱讀和分析某中熒光染料的激發(fā)曲線(xiàn)和釋放曲線(xiàn)來(lái)確定適合某種染料的復(fù)合掃描激發(fā)波長(zhǎng),，該波長(zhǎng)的激發(fā)效率至少要達(dá)到50-70%的水平。激發(fā)波長(zhǎng)要避免太接近釋放高峰對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng),，否則熒光信號(hào)受到干擾,。所以應(yīng)在峰值的左邊選擇一激發(fā)波長(zhǎng)。如對(duì)FITC來(lái)說(shuō),，建議的激發(fā)波長(zhǎng)在470-495nm.熒光釋放強(qiáng)度在某一范圍內(nèi),，與激發(fā)光的強(qiáng)度成正比，當(dāng)熒光釋放達(dá)到最高峰后,，增加激發(fā)光強(qiáng)度卻不能提高釋放強(qiáng)度,，因?yàn)闊晒忉尫乓呀?jīng)達(dá)到飽和或光子將染料破壞淬滅。微陣列上各點(diǎn)的熒光分子受到激發(fā)后,，從各個(gè)方向釋放熒光光子,，散射成球狀，所以?huà)呙鑳x須將這些散射的光子采集到,，由于掃描儀的使用的是很低的釋放光,，幾何球狀是設(shè)計(jì)掃描設(shè)備的主要根據(jù)。
圖1 FITC的波長(zhǎng)對(duì)熒光激發(fā)強(qiáng)度曲線(xiàn)
微陣列掃描儀可有多種設(shè)計(jì)類(lèi)型,，但任何類(lèi)型的微陣列掃描儀都有以下基本功能：
激發(fā)光
激發(fā)光的產(chǎn)生源有多種,，如激光、氬燈,、LEDs或鎢絲燈,。激發(fā)光的波長(zhǎng)要避免將釋放光的波長(zhǎng)覆蓋或重疊。對(duì)于LEDs或鎢絲燈需用濾光器來(lái)選擇某種特定波長(zhǎng)的光,。激光的波長(zhǎng)單一不需要濾光器來(lái)選擇某種特定波長(zhǎng)的光,。燈泡光源可產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的激發(fā)光，通過(guò)多個(gè)濾光器可選擇多種特定的波長(zhǎng)以滿(mǎn)足激發(fā)不同熒光的需要,。激發(fā)光應(yīng)直接射向微陣列上的待測(cè)樣品,，通過(guò)大量一次照明的方式,，待測(cè)樣品的大部分區(qū)域同時(shí)受到激發(fā)，這種方式在CCD數(shù)碼相機(jī)中較常見(jiàn),，該方式的缺陷是待測(cè)樣品的受到得激發(fā)光不夠均勻一致,。這點(diǎn)是儀器設(shè)計(jì)者須考慮到的重要因數(shù)之一。另一種方式是：激發(fā)光聚焦于樣品的很小部分,，采用特定的光線(xiàn)采集和定位,，聚焦點(diǎn)上的激發(fā)光光線(xiàn)密度較高，大約為10000watt/cm2,。激發(fā)波長(zhǎng)的選擇是依據(jù)染料的激發(fā)曲線(xiàn)和釋放曲線(xiàn)的峰值來(lái)確定的，在染料激發(fā)峰值的左邊且激發(fā)效率較高的范圍內(nèi),，在某種染料水平下,，激發(fā)效率越低，要達(dá)到某種光強(qiáng),，則需要向樣品上發(fā)射的光越多,。過(guò)多的發(fā)射光將通過(guò)光漂白作用破壞樣品和污染干擾釋放光的信號(hào)。
釋放光采集
熒光由目鏡的鏡頭來(lái)采集,，該鏡頭聚焦于樣品上并將一定區(qū)域內(nèi)的光線(xiàn)收集到裝置,。收集的角度區(qū)域的大小非常關(guān)鍵，熒光釋放是球形的,，目鏡對(duì)熒光的采集范圍是決定儀器的采集效率關(guān)鍵指標(biāo)之一,。目鏡采集光的角度由數(shù)值孔徑來(lái)表示，圖2表示了數(shù)值孔徑與光采集效率之間的變化關(guān)系,。當(dāng)數(shù)值孔徑為1.0時(shí),，目鏡將收集到整個(gè)半球的光，相應(yīng)的光采集效率為50%,。在許多激光共聚焦微陣列掃描儀的數(shù)值孔徑在 0.5-0.9, 而CCD-掃描儀的數(shù)值孔徑為0.2-0.5,。有其他類(lèi)型的掃描儀不用目鏡而是使用積分球面鏡來(lái)采集釋放的部分光源，但是部分光線(xiàn)經(jīng)過(guò)多次球面反射而衰減,。還有一些無(wú)散光收集裝置,，僅僅是將探測(cè)器放在樣品的某一區(qū)域的上方，光線(xiàn)采集的效率受限于樣品被照明處的范圍及探測(cè)器的視角,，例如,，一個(gè)直徑為25mm的探測(cè)器放在激發(fā)點(diǎn)上方100mm處，其實(shí)際的有效數(shù)值孔徑為0.12,。圖2顯示目鏡的不同數(shù)值孔徑與光采集效率的關(guān)系,。
圖2 目鏡的不同數(shù)值孔徑與光采集效率的關(guān)系
空間定位
是指對(duì)樣品上的某一小區(qū)域上的熒光信號(hào)進(jìn)行熒光強(qiáng)度計(jì)算，微陣列上的各點(diǎn)樣品被分割為許多微小的像素,，在進(jìn)行熒光信號(hào)定量時(shí),，空間分辨率必須高于個(gè)點(diǎn)的大小,，如微陣列上各點(diǎn)的直徑為100mm，則像素的大小為5-20mm,?？臻g定位可通過(guò)多元素探測(cè)器，如CCD或機(jī)械掃描裝置,。許多相機(jī)設(shè)置為大范圍照明,，探測(cè)器直接提供由許多像素組成的圖象，該方法的缺陷是CCD提供的目鏡數(shù)值口徑較小,，后方照明及維持系統(tǒng)冷卻設(shè)備價(jià)值昂貴,，由于光散射會(huì)導(dǎo)致像素之間交叉重疊造成信號(hào)不夠清晰。機(jī)械掃描過(guò)程包括以下幾個(gè)步驟：將激發(fā)光束聚焦于某一大小同像素差不多的點(diǎn)上,，用單一元素的探測(cè)器采集那一小點(diǎn)上的釋放光,。要將整個(gè)樣品掃描完全，則需移動(dòng)樣品或用一微小的反光鏡使激光束移動(dòng)掃描樣品,。雖然掃描裝置增加了機(jī)械裝置的復(fù)雜程度,，但比起CCD相機(jī)來(lái)，機(jī)械掃描可達(dá)到的數(shù)值孔徑更高,，有更好的空間選擇性,，探測(cè)器也較便宜些。在低強(qiáng)度的光源下,，高光線(xiàn)采集率是至關(guān)重要的,。
激發(fā)/釋放分辨
微陣列上各點(diǎn)的熒光釋放強(qiáng)度通常要比激發(fā)光強(qiáng)度弱幾個(gè)數(shù)量級(jí)，要從激發(fā)光中檢測(cè)出微弱的熒光信號(hào),，就需要對(duì)這兩種類(lèi)型的光進(jìn)行分離,，由于光束中的光波長(zhǎng)不相同，可利用光波分離將不同的光分開(kāi),。許多裝有目鏡的掃描儀采用的是表面照明方式,，激發(fā)光束與釋放光束從樣品到目鏡經(jīng)過(guò)同樣的路徑只是方向相反。這種途徑使得從樣品上反射和散射的光與熒光束混合在一起,，所以需要用光束分離器對(duì)混合光進(jìn)行分離,。一種類(lèi)型的光束過(guò)濾器是色彩二向或多向過(guò)濾器。它將激發(fā)光束反射并把釋放光束以一較長(zhǎng)的波長(zhǎng)傳輸,。這種濾光器對(duì)一,、二或三種不同的激發(fā)/釋放光都可進(jìn)行較好的分離，但若超過(guò)四種以上的混合光束則分離有困難,。另外一種類(lèi)型的光線(xiàn)分離器稱(chēng)為幾何光線(xiàn)分離器,，如圖3所示，在掃描系統(tǒng)中,，目鏡的數(shù)值孔徑為0.6,，像素的大小為10mm,，從目鏡出來(lái)的激發(fā)光束比釋放光束細(xì)，一個(gè)小反光鏡將激光束反射但是讓環(huán)形部分的釋放光束通過(guò),，其分離效果與波長(zhǎng)光束分離器相同,。從理論上來(lái)說(shuō)，光束分離器可以完全將激發(fā)和釋放光束分開(kāi),，但實(shí)際上并非如此,，通常在探測(cè)器前放濾光片過(guò)濾釋放光束。這些濾光片只允許染料的釋放高峰附近很窄的一段波長(zhǎng)的光通過(guò),，而其他波長(zhǎng)的光包括激發(fā)光都被阻擋了,。這是微陣列掃描儀必需的的第二道光束分離裝置。有的掃描儀不用光束分離器而是將激發(fā)光束和釋放光束放在不同的軸上,。該方法能將釋放光路徑的激發(fā)光發(fā)射回去,，但卻難以達(dá)到較高的數(shù)值孔徑，因?yàn)槟跨R離樣品很近,，通常小于1毫米，所以激發(fā)光束能進(jìn)入目鏡的角度范圍很小,。其他具有區(qū)分不同波長(zhǎng)光束的裝置有棱鏡,、光柵等，這些裝置還可產(chǎn)生一些特殊的作用如連續(xù)的光波調(diào)諧功能,。然而,，在微陣列中，由于要求對(duì)激發(fā)光有高度的敏感性,，因而對(duì)釋放光裝置也相應(yīng)要求有很高的精密度,。
圖3 在上位照明掃描儀中的光束分離器
檢測(cè)熒光掃描儀的探測(cè)器
將微弱的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào),在微陣列掃描儀中的光線(xiàn)探測(cè)器有：光電倍增管、CCD點(diǎn)陣探測(cè)器,、雪崩光電二極管,。各種裝置有其優(yōu)點(diǎn)也有其缺點(diǎn)。不同檢測(cè)范圍的儀器要根據(jù)它們各自的特點(diǎn)來(lái)選擇合適的探測(cè)裝置,。光電倍增管在可見(jiàn)光波范圍內(nèi)是最靈敏的探測(cè)器,，它屬于單點(diǎn)探測(cè)器并要求掃描系統(tǒng)對(duì)微陣列上的樣品進(jìn)行空間定位，通過(guò)改變電壓可以很方便地改變光電倍增管的靈敏度,。光電倍增管的靈敏度在紅外及近紅外波長(zhǎng)范圍內(nèi)降低得很快,，所以它們的用途主要限制在可見(jiàn)光波長(zhǎng)范圍內(nèi)。CCD對(duì)微弱信號(hào)的放大功能不及光電倍增管,，因而需要額外的放大系統(tǒng)來(lái)將信號(hào)放大才能達(dá)到光電倍增管的靈敏度范圍的上限,。其主要的缺點(diǎn)是：CCD探測(cè)器的實(shí)際數(shù)值孔徑難以達(dá)到06-09的范圍,在低亮度背景下,限制微弱信號(hào)被檢測(cè)出來(lái), 另外CCD探測(cè)器不能與共聚焦系統(tǒng)相兼容;但是在高亮度背景下, 因?yàn)镃CD探測(cè)器有內(nèi)置式掃描功能,其優(yōu)越性就體現(xiàn)出來(lái)了。
所有的微陣列掃描儀都有固定和放置微陣列固相基質(zhì)的裝置,，我們稱(chēng)之為掃描儀的載樣盒,。載樣盒要有能夠容納下玻片的空間,，組成其的材料應(yīng)能經(jīng)受的住上千次取放樣品的刮擦考驗(yàn)。通常微陣列的固體介質(zhì)為顯微載玻片,，還有塑料片,，但是塑料片不如玻璃片剛硬，容易變形,，不易聚焦準(zhǔn)確,，所以多數(shù)研究者使用的是顯微載玻片。掃描檢測(cè)時(shí)通常是在室溫下進(jìn)行,，此時(shí)玻片上各點(diǎn)樣品已經(jīng)干燥,，然而，有些染料如FITC在潮濕的環(huán)境下才能釋放出強(qiáng)烈的熒光,，所以研究者們?cè)诖郎y(cè)樣品上滴加適量的緩沖液,，然后蓋上蓋玻片進(jìn)行觀察。這就需要載樣盒能夠容納載玻片與蓋玻片疊加之后的厚度,，掃描儀在掃描時(shí)聚焦于蓋玻片下的那一層平面進(jìn)行掃描,。
以下要介紹共聚焦掃描微陣列的工作原理，顧名思義,，共聚焦掃描儀將視野中的兩個(gè)聚焦點(diǎn)的影象裝配為二維圖象,，工作過(guò)程如所示：平行的激光束通過(guò)光束分離器后進(jìn)入目鏡，目鏡采集到部分球狀散射的熒光釋放光并使這些光成為平行的光束,，此外還采集被反射的激光,，這些激光的強(qiáng)度要比熒光強(qiáng)度大3-7倍。采集回來(lái)的光束再次通過(guò)光束分離器,，光束分離器將大部分激光反射回激光源處,，并允許大部分熒光束通過(guò)光束分離器，一面平面鏡將熒光束反射到釋放光柵處,，光柵選擇很窄范圍波長(zhǎng)的光通過(guò),，并將剩余的激光激發(fā)光全部反射回去。共聚焦的工作特點(diǎn)體現(xiàn)在探測(cè)目鏡和開(kāi)了一個(gè)針孔大的孔的光線(xiàn)擋板上,，探測(cè)目鏡將平行光聚集為很小直徑的一束光之后,，擋板上的小孔只允許聚焦的光線(xiàn)通過(guò)并將其余的光遮擋住。圖5顯示若發(fā)光點(diǎn)不在目鏡焦點(diǎn)范圍內(nèi),，則光線(xiàn)將被探測(cè)目鏡聚集于擋光板前,，散射之后大部分光線(xiàn)被遮擋了，只有焦點(diǎn)范圍內(nèi)的光線(xiàn)才能有效地進(jìn)入當(dāng)光板的小孔被探測(cè)器檢測(cè)到,。對(duì)焦距范圍的嚴(yán)格限制使得灰塵或近表面的小顆粒均不能成像被探測(cè)到,，因而共聚焦掃描儀獲得圖象的信噪比要高于非共聚焦掃描裝置。但另一方面，對(duì)焦距范圍的嚴(yán)格限制要求載玻片擺放非常平穩(wěn),，掃描運(yùn)動(dòng)過(guò)程中載樣盒要保持在同一水平面上,，偏差要小于焦距的范圍，偏差小于±10mm,。這一要求增加了機(jī)械加工的精密度,，使得加工工藝更加復(fù)雜，但這是保證獲得最佳圖象質(zhì)量的有效途徑之一,。
圖4共聚焦掃描的工作原理
圖5目鏡焦點(diǎn)范圍之外的光線(xiàn)被遮擋
由于激光共聚焦于載玻片上的一點(diǎn)上,要獲得整張玻片上的各點(diǎn)的熒光信息則要對(duì)玻片各點(diǎn)進(jìn)行掃描成像,。可通過(guò)移動(dòng)掃描器或移動(dòng)目鏡和載玻片來(lái)實(shí)現(xiàn)上述功能,。掃描器移動(dòng)后要求目鏡能采集到熒光釋放光束,，這樣的目鏡很復(fù)雜且數(shù)值孔徑不超過(guò)0.3，較為簡(jiǎn)單的并且采集光效率高的辦法是移動(dòng)目鏡或載玻片,，但移動(dòng)的物體大勢(shì)必影響掃描速度,。不過(guò)在弱光環(huán)境下，圖象讀取速度取決于探測(cè)到的光子的累積量,，所以即使掃描速度快而光采集效率低的話(huà)圖象讀取信號(hào)也未必快,。
所有的掃描儀都會(huì)面臨同樣的一個(gè)問(wèn)題，即如何將背景降低并提高待測(cè)樣品的信號(hào),。共聚焦技術(shù)的應(yīng)用使得共聚焦掃描儀能比其它類(lèi)型的掃描儀獲得更高質(zhì)量的圖像信號(hào),。在共聚焦掃描儀中有光束分離器及釋放光柵將熒光信號(hào)分離并傳輸給探測(cè)器，而將激發(fā)光和雜質(zhì)產(chǎn)生的光反射回去并阻擋它們到達(dá)探測(cè)器,。探測(cè)器是光電倍增管，其靈敏度高,，可探測(cè)到一個(gè)光子的存在,，光電倍增管內(nèi)的功率放大器可將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)并放大100萬(wàn)倍，通過(guò)調(diào)整電壓輸出可改變光電倍增管的靈敏度范圍,，微陣列上不同樣品的制備過(guò)程導(dǎo)致對(duì)儀器靈敏度要求不同,，內(nèi)置式的可調(diào)靈敏度裝置恰好可適應(yīng)這些不同的變換。傳統(tǒng)的硅探測(cè)器如PIN光電二極管,，沒(méi)有內(nèi)置放大裝置,，在可見(jiàn)光范圍內(nèi)靈敏度很低，因而需要外置的功率放大器,，這就增加了雜訊,，降低了信噪比。硅探測(cè)器在800-900nm范圍內(nèi)有一波長(zhǎng)應(yīng)答高峰,，因此用它們探測(cè)近紅外范圍的染料較為理想,。光電倍增管通常在500nm左右范圍內(nèi)有一波長(zhǎng)應(yīng)答高峰，高于650nm后則靈敏度迅速降低。它們適用于大部分可見(jiàn)光范圍的染料,。
微陣列掃描儀靈敏度范圍要求：在微陣列樣品制備過(guò)程中,，步驟較多，如PCR反應(yīng),、雜交反應(yīng)條件變化多,、試劑存儲(chǔ)條件不同、不同類(lèi)型的基因表達(dá)等因素的影響,，即使適用相同的染料,，其亮度也可能相差1000倍，在同一快微陣列上的熒光強(qiáng)度范圍可達(dá)到4000:1的范圍,。大部分掃描儀的熒光強(qiáng)度讀取范圍在4000-16000,，若不改變儀器的靈敏度范圍，就無(wú)法適應(yīng)各種熒光強(qiáng)度樣品的讀取,。調(diào)整儀器靈敏度范圍的方法有兩種：其一是改變激發(fā)光的強(qiáng)度,，用激光衰減器可調(diào)整改變激發(fā)光的強(qiáng)度其可調(diào)范圍至少為100：1。其二是改變光電倍增管的靈敏度,，通過(guò)變化輸入電壓的大小,，光電倍增管的靈敏度改變范圍至少為100：1。兩項(xiàng)調(diào)整方式可相互疊加使得儀器的調(diào)整范圍增加到10000：1,，這一范圍對(duì)普通的掃描儀都足夠了,。通常人們希望使用的激光強(qiáng)度大而不破壞樣品上的熒光分子，我們已經(jīng)知道,，激光強(qiáng)度越大激發(fā)的熒光光子越多,，信號(hào)也越清楚和強(qiáng)烈。但是若樣品經(jīng)過(guò)多次掃描后,，被破壞的熒光光子將增加,，所以要將熒光強(qiáng)度降低以防樣品上的熒光淬滅。
信號(hào)轉(zhuǎn)換及采樣過(guò)程：由被激發(fā)的熒光染料產(chǎn)生的光學(xué)信號(hào)將通過(guò)一系列過(guò)程轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)碼信號(hào),。熒光信號(hào)是由一系列隨機(jī)的光子釋放累加而成,。若將它們累計(jì)可與某一樣品區(qū)域的染料分子的密度相關(guān)。通常掃描儀對(duì)空間上和時(shí)間上探測(cè)到的熒光光子的數(shù)量都加以累計(jì)并取平均值才能代表某一樣品區(qū)域的染料分子的密度,。被掃描的區(qū)域被分為大小相同的像素,。激光共聚焦和其它點(diǎn)-照明式掃描儀對(duì)逐個(gè)像素進(jìn)行激發(fā)，然后探測(cè)器累加各像素點(diǎn)上熒光釋放分子,。將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)并數(shù)值化,。各像素的數(shù)碼分辨率可達(dá)到16-比特，當(dāng)掃描圖像正在進(jìn)行時(shí),，顯示器要顯示圖像以供掃描者作初步的分析,，掃描過(guò)程結(jié)束后可將圖像保存為圖像格式文件如TIFF格式,，這種格式的圖像文件時(shí)目前用途較廣的一種圖像文件。
控制和自動(dòng)化系統(tǒng)是由電腦來(lái)完成的,。掃描儀使用者無(wú)須精通掃描儀的光學(xué)和電子學(xué)部分,，已商品化的掃描儀已經(jīng)經(jīng)過(guò)大量的測(cè)試和信息反饋并不斷地改進(jìn)，使其用戶(hù)界面越來(lái)越友好,，圖形化的操作界面使得初學(xué)者只需接受簡(jiǎn)單的訓(xùn)練或閱讀操作手冊(cè)就能夠使用儀器,。控制軟件具有許多自動(dòng)設(shè)置功能,，為使用者節(jié)省時(shí)間提高工作效率,。如：不同的用戶(hù)掃描不同樣品可設(shè)置、保存,、再現(xiàn)掃描參數(shù),；可自動(dòng)設(shè)定2個(gè)以上的掃描激光波長(zhǎng)并自動(dòng)保存圖像結(jié)果；對(duì)某一掃描波段自動(dòng)調(diào)整靈敏度,、激發(fā)光強(qiáng)度,、及探測(cè)器探測(cè)范圍等。
掃描儀各部件功能參數(shù)主要如下：
激光源的數(shù)目和熒光波段 第一代微陣列掃描儀通常是兩個(gè)或四個(gè)熒光波段及兩個(gè)激光光源,，而第二代儀器則含三或四個(gè)激光光源并可選擇10種熒光波段,。
另外，分辨率,、靈敏度,、掃描速度、掃描視野,、掃描圖像定位的準(zhǔn)確程度等指標(biāo)也是設(shè)計(jì)和制造微陣列掃描儀所需考慮的技術(shù)指標(biāo),。微陣列掃描儀之間的比較是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,不應(yīng)僅僅對(duì)單個(gè)性能參數(shù)進(jìn)行比較，通常需要對(duì)掃描樣品進(jìn)行綜合測(cè)試,。
ScanArray共聚焦微陣列掃描儀
General Scanning ,Inc.公司已經(jīng)建立了ScanArray共聚焦微陣列掃描儀的生產(chǎn)線(xiàn),，目前全世界的許多生物技術(shù)和遺傳基因組分析實(shí)驗(yàn)室都在使用該種儀器進(jìn)行科研工作。
ScanArray的結(jié)構(gòu)組成是：樣品載體移動(dòng),、光源固定、多個(gè)激光頭的共聚焦掃描儀,。數(shù)值孔徑可達(dá)0.75,，掃描速度達(dá)20線(xiàn)/秒。
ScanArray共聚焦微陣列掃描儀優(yōu)越性能表現(xiàn)在：操作簡(jiǎn)單,、體積小,，數(shù)值孔徑高、掃描速度快,，靈敏度和分辨率高,。
目前有兩種型號(hào)：ScanArrayâ3000和ScanArrayâ5000，它們的性能如下：
性能指標(biāo)
ScanArray3000
ScanArray5000
結(jié)構(gòu)
樣品載體移動(dòng)、光源固定,、多個(gè)激光頭
樣品載體移動(dòng),、光源固定、多個(gè)激光頭
數(shù)值孔徑
0.75
0.75
載樣介質(zhì)
所有標(biāo)準(zhǔn)的1''´3''顯微載玻片
所有標(biāo)準(zhǔn)的1''´3''顯微載玻片
視野
不小于22mm´60mm
不小于22mm´60mm
掃描速度
6線(xiàn)/秒
20線(xiàn)/秒
分辨率
10,；50（預(yù)掃描）
5,，10，20,；30,；50（預(yù)掃描）
激光束
兩種（543nm和633nm）
四種（488nm，514nm,，543nm,，594nm，612nm,，633nm）
釋放光波段
2
10
輸出格式
16-bit 1
16-bit 1
體積
25"長(zhǎng)´10.5"寬´11.5"高
30"長(zhǎng)´15.5"寬´13.5"高
重量
35
60-70(取決于激光頭的數(shù)目)
參考文獻(xiàn)：
Ormerod,，M.G.（ed.）. In Flow cytometry： a practical approach，P, 29. IRL Press.
Tomei, L.D.(1988). US Patent 4758727.
Kain, R. C.(1998). US Patent 5719391.
Kain, R.C., Miller, M.F., and Majlof, L. (1996).US Patent 5578818.
