克隆PCR產(chǎn)物
1)克隆PCR產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？
最佳插入片段：載體比需實(shí)驗(yàn)確定,。1：1（插入片段：載體）常為最佳比,，摩爾數(shù)比1：8或8：1也行。應(yīng)測(cè)定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶,，插入片段共10ul,。室溫保溫1小時(shí)，或4oC過夜,。在這2種溫度下,，缺T-凸出端的載體會(huì)自連，產(chǎn)生藍(lán)斑,。室溫保溫1小時(shí)能滿足大多數(shù)克隆要求,，為提高連接效率，需4oC過夜,。
2)PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化,？
如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化,。如可見其他雜帶,，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高,，這會(huì)產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆,，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化,。
3)如果沒有回收到目的片段,，還需要作什么對(duì)照實(shí)驗(yàn)？
A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞,。
如有菌落,，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒,，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落,。
B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計(jì)算菌落生長(zhǎng)數(shù),，測(cè)定轉(zhuǎn)化效率,。
例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化,。用SOC稀釋到1000ul后,，用100ul鋪板。培養(yǎng)過夜,，產(chǎn)生1000個(gè)菌落,。轉(zhuǎn)化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。
鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù),。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng DNA,，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA,，用1/10鋪板，共用1 ng DNA,。轉(zhuǎn)化率為：
1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞
如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低,。
C）如用pGEM-T正對(duì)照,，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞）,，表明載體失去T,。可能是連接酶污染了核酸酶,。T4 DNA連接酶（M1801,，M1804，M1794）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無核酸酶污染,，不應(yīng)用其它來源的T4 DNA連接酶替換,。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對(duì)照,，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實(shí)驗(yàn)步驟,，可得100個(gè)菌落，其中60%應(yīng)為白斑,，如產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑, 沒有菌落或少有菌落,，連接有問題。
4)對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好,，卻沒有回收到目的片段,，實(shí)驗(yàn)出了什么問題？
A）連接用室溫保溫1小時(shí),，能滿足大多數(shù)克隆,，為提高效率，需4oC過夜,。
B）插入片段帶有污染,，使3`-T缺失，或抑制連接,，抑制轉(zhuǎn)化,。為此，將插入片段和pGEM-T正對(duì)照混合,，再連接,。如降低了對(duì)照的菌落數(shù)，插入片段需純化,，或重新制備,。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑,，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失,。
C）插入片段不適于連接,。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射,，時(shí)有發(fā)生,。UV過度照射會(huì)產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接,，DNA必需重新純化,。
D）帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物末端無A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需,。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A,。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術(shù)資料（TM042）。
E）高度重復(fù)序列可能會(huì)不穩(wěn)定,，在擴(kuò)增中產(chǎn)生缺失和重排,，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株,，如SURE細(xì)胞
