PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件
標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：
10×擴(kuò)增緩沖液 10ul
4種dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加雙或三蒸水至 100ul
PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物,、酶,、dNTP、模板和Mg2+
引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上,，只要知道任何一段模板DNA序列,， 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增,。
設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：
①引物長度： 15-30bp,，常用為20bp左右。
②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜,，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段,。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳,，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ),，特別是3'端的互補(bǔ),，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶,。
⑤引物3'端的堿基,，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗,。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)， 被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn),， 這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處,。
⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol,，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì),。
酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng),， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶,。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2,。5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增,，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少,。
dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系,，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性,。dNTP溶液呈酸性,，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris,。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5,，小量分裝， -20℃冰凍保存,。多次凍融會(huì)使dNTP降解,。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L,，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制),，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配,。濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量,。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低,。
模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度,，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本,。SDS的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì),，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白,，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀,； 蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白,，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份,，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng),。一般臨床檢測標(biāo)本,，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體,，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離,，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,，要防止RNase降解RNA,。
Mg2+濃度 Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中,，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí),，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜,。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低,，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增,，濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少,。
PCR反應(yīng)條件的選擇
PCR反應(yīng)條件為溫度,、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。
溫度與時(shí)間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn),。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法,，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃,，引物退火并結(jié)合到靶序列上,，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下,，使引物鏈沿模板延伸,。對(duì)于較短靶基因(長度為100～300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法， 除變性溫度外,、退火與延伸溫度可合二為一,，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性),。
①變性溫度與時(shí)間：變性溫度低,，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因,。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性,，若低于93℃則需延長時(shí)間,，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響,。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性,，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。
?、谕嘶?復(fù)性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素,。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合,。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多,，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間,，取決于引物的長度,、堿基組成及其濃度,，還有靶基序列的長度。對(duì)于20個(gè)核苷酸,，G+C含量約50%的引物,，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允許范圍內(nèi),， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合,， 提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec,，足以使引物與模板之間完全結(jié)合,。
③延伸溫度與時(shí)間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃時(shí),， DNA合成幾乎不能進(jìn)行,。
PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃,，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合,。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定,，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段,，延伸時(shí)間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min,；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min,。延伸進(jìn)間過長會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增,，延伸時(shí)間要稍長些,。
