PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污 染,，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生.
一,、污染原因
　　(一)標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染,，或標(biāo)本放置時，由于 密封不嚴(yán)溢于容器外,，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提 取過程中,，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠 或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染.
　　(二)PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中,，由于加樣槍,、容器、雙蒸水 及其它溶液被PCR核酸模板污染.
　　(三)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染.這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題.因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml),，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限,，所以極微量的PCR產(chǎn)物 污染，就可造成假陽就可形成假陽性.
　　還有一種容易忽視,，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩 擦?xí)r就可形成氣溶膠,，在操作時比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管，開蓋時,、吸樣時及污染進(jìn)樣 槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由 其造成的污染是一個值得特別重視的問題.
　　(四)實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的 檢驗(yàn)室,，這個問題也比較常見.因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高,，另外在純化 過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒,，由于活細(xì)胞的生長繁殖的簡 便性及具有很強(qiáng)的生命力.其污染可能性也很大.
二,、污染的監(jiān)測
　　一個好的實(shí)驗(yàn)室，要時刻注意污染的監(jiān)測,，考慮有無污染是什么原因造成的污染,，以 便采取措施，防止和消除污染.
對照試驗(yàn)
　　1.陽性對照:在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照,，它是PCR 反應(yīng)是否成功,、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標(biāo)志.陽性 對照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好,，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本,，如以重組質(zhì)粒為陽 性對照，其含量宜低不宜高(100個拷貝以下).但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽 性標(biāo)本,，其對檢測或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大.因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn) 定,，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽性對照.
　　2.陰性對照:每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對照.它包括①標(biāo)本對照:被檢的標(biāo)本是血清就用 鑒定后的正常血清作對照;被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對照.②試劑 對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,，進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，以監(jiān)測試劑是否污染.
　　3.重復(fù)性試驗(yàn)
　　4.選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增
三、防止污染的方法
　　(一)合理分隔實(shí)驗(yàn)室:將樣品的處理,、配制PCR反應(yīng)液,、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定 等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開. 最好能劃分①標(biāo)本處理區(qū);②PCR反應(yīng)液制備區(qū);③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū);④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū). 其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用.實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA.
　　(二)吸樣槍:吸樣槍污染是一個值得注意的問題.由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸 入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴(yán)重的污染源,，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心,，吸 樣要慢，吸樣時盡量一次性完成,，忌多次抽吸,，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染.
　　(三)預(yù)混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能,，PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先 配制好,，然后小量分裝，-20℃保存.以減少重復(fù)加樣次數(shù),，避免污染機(jī)會.另外,，PCR試劑，PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存,，不應(yīng)放于同一冰盒或同一 冰箱.
　　(四)防止操作人員污染,，使用一次性手套,、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用.
　　(五)設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ?，陽性對照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的最低量的標(biāo)準(zhǔn)病 原體核酸為宜,，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對照 及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對照.
　　(六)減少PCR循環(huán)次數(shù),，只要PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測水平就適可而止.
　　(七)選擇質(zhì)量好的Eppendorf管,，以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入，打開離心管前 應(yīng)先離心,，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部.開管動作要輕,，以防管內(nèi)液體濺出.
PCR檢測微量感染因子時，一定要注意產(chǎn)物殘留污染的問題,。

一． 污染的預(yù)防
進(jìn)行PCR操作時,，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn),。
（一）劃分操作區(qū)：目前,，普通PCR尚不能做到單人單管，實(shí)現(xiàn)完全閉管操作,，但無論是否能夠達(dá)到單人單管,，均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行：
1. 標(biāo)本處理區(qū),，包括擴(kuò)增摸板的制備,；
2. PCR擴(kuò)增區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和PCR擴(kuò)增,；
3. 產(chǎn)物分析區(qū),，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備,。
各工作區(qū)要有一定的隔離,，操作器材專用，要有一定的方向性,。如：標(biāo)本制備→PCR擴(kuò)增→產(chǎn)物分析→產(chǎn)物處理,。
切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。
（二）分裝試劑：PCR擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺或負(fù)壓工作臺配制和分裝,。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中,，不能用來吸取擴(kuò)增后的DNA和其他來源的DNA：
1． PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水；
2． 引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制,；
3． 引物和dNTP應(yīng)分裝儲存,，分裝時應(yīng)標(biāo)明時間，以備發(fā)生污染時查找原因,。
(三) 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng) 盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因,，樣品間的交叉污染也是原因之一,。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真,，在樣品的收集,、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：
1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液,，立即更換手套；
2. 使用一次性吸頭,，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用,，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染,；
3. 避免反應(yīng)液飛濺,，打開反應(yīng)管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底,。若不小心濺到手套或桌面上,，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；
4. 操作多份樣品時,，制備反應(yīng)混合液,，先將dNTP、緩沖液,、引物和酶混合好,，然后分裝，這樣即可以減少操作,，避免污染,，又可以增加反應(yīng)的精確度；
5. 最后加入反應(yīng)模板,，加入后蓋緊反應(yīng)管,；
6. 操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照，即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性,，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性,；
7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染,，最好使用可替換或高壓處理的加樣器,。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用,，不能交叉使用,，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)；
8. 重復(fù)實(shí)驗(yàn),，驗(yàn)證結(jié)果,，慎下結(jié)論,。
二． 追蹤污染源
如果不慎發(fā)生污染情況，應(yīng)從下面幾條出發(fā),，逐一分析,，排除污染。
（一）設(shè)立陰陽性對照：有利于監(jiān)測反應(yīng)體系各成分的污染情況,。選擇陽性對照時,，應(yīng)選擇擴(kuò)增弱，且重復(fù)性好的樣品,，因強(qiáng)陽性對照可產(chǎn)生大量不必要的擴(kuò)增序列,，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質(zhì)粒為對照,，100個拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽性擴(kuò)增,。陰性對照的選擇亦要慎重，因?yàn)镻CR敏感性極高,，可以從其它方法（Sourthern 印跡或點(diǎn)雜交等）檢測陰性的標(biāo)本中檢測出極微量的靶分子,。此外，每次擴(kuò)增均應(yīng)包括PCR體系中各試劑的時機(jī)對照,，即包括PCR反應(yīng)所需的全部成分,，而不加模板DNA，這對監(jiān)測試劑中PCR產(chǎn)物殘留污染是非常有益的,。如果擴(kuò)增結(jié)果中試劑對照為陽性結(jié)果,，就是某一種或數(shù)種試劑被污染了。此時,，要全部更換一批新的試劑進(jìn)行擴(kuò)增,，擴(kuò)增時設(shè)立不同的反應(yīng)管，每一管含有一種被檢測試劑,，在檢出污染試劑后,，應(yīng)馬上處理。
（二）環(huán)境污染：在排除試劑污染的可能性外,，更換試劑后,，若不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污染了，如果預(yù)防措施比較嚴(yán)密,，則考慮可能為環(huán)境污染,。
環(huán)境污染中常見的污染源主要有：
1. 模板提取時真空抽干裝置；
2. 凝膠電泳加樣器,；
3. 電泳裝置,；
4. 紫外分析儀；
5. 切膠用刀或手術(shù)刀片；
6. 離心機(jī),；
7. 冰箱門把手,，冷凍架，門把手或?qū)嶒?yàn)臺面等,；
此時可用擦拭實(shí)驗(yàn)來查找可疑污染源,。1）用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源；2）0.1ml去離子水浸泡,；3）取5ml做PCR實(shí)驗(yàn),；4）電泳檢測結(jié)果。
8. 氣溶膠,。如果經(jīng)過上述追蹤實(shí)驗(yàn),，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中PCR產(chǎn)物的氣溶膠造成的,，此時就應(yīng)該更換實(shí)驗(yàn)場所，若條件不允許,，則重新設(shè)計新的引物（與原引物無相關(guān)性）,。
三．污染處理
（一）環(huán)境污染
1. 稀酸處理法：對可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤,；
2. 紫外照射（UV）法：紫外波長（nm）一般選擇254/300nm,，照射30min即可。需要注意的是,，選擇UV作為消除殘留PCR產(chǎn)物污染時,，要考慮PCR產(chǎn)物的長度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV照射僅對500bp以上長片段有效,，對短片段效果不大,。UV照射時，PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會形成二聚體,，這些二聚體可使延伸終止,，但并不是DNA鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且UV照射還可使二聚體斷裂,。形成二聚體的程度取決于UV波長,，嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點(diǎn)相鄰核苷酸的序列。在受照射的長DNA鏈上,，形成二聚體缺陷的數(shù)量少于0.065/堿基,，其他非二聚體的光照損傷（如環(huán)丁烷型嘧啶復(fù)合體，胸腺嘧啶乙二醇,，DNA鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和DNA斷裂等）均可終止Taq DNA聚合酶的延伸,。這些位點(diǎn)的數(shù)量與二聚體位點(diǎn)相當(dāng)。如果這些位點(diǎn)（0.13/堿基）在DNA分子上隨機(jī)分布,，一個500bp片段的DNA分子鏈上將有32處損傷位點(diǎn),，那么,，105個這樣的分子中每個分子中會至少有一處損傷。相反,，如果100bp的片段,，每條鏈上僅有6處損傷，105個拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷,。這就是UV照射有一定的片段長度限制的原因,。
（二）反應(yīng)液污染
可采用下列方法之一處理：
1. DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室溫反應(yīng)30 min后加熱滅活,，然后加入模板和Taq聚合酶進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增,。該方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要知道污染DNA的序列；
2. 內(nèi)切酶法：選擇識別4個堿基的內(nèi)切酶（如Msp I和Taq I等）,，可同時選擇幾種,，以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷，室溫作用1h 后加熱滅活進(jìn)行PCR,；
3. 紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進(jìn)行紫外照射,，注意事項(xiàng)與方法同上述UV照射法；
4. g射線輻射法：1.5kGy的輻射可完全破壞0.1ng基因組DNA,，2.0 kGy可破壞104拷貝的質(zhì)粒分子,，4.0 kGy仍不影響PCR，但高于此限度會使PCR擴(kuò)增效率下降,。引物可受照射而不影響PCR,，g射線是通過水的離子化產(chǎn)生自由基來破壞DNA的。
（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由于UV照射的去污染作用對500bp以下的片段效果不好,，而臨床用于檢測的PCR擴(kuò)增片段通常為300bp左右,，因此UNG的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。
1. 原理：在PCR產(chǎn)物或引物中用dU 代替dT,。這種dU化的PCR產(chǎn)物與UNG一起孵育,，因UDG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸,，從而失去被再擴(kuò)增的能力,。UNG對不含dU的模板無任何影響。UNG可從單或雙鏈DNA中消除尿嘧啶,，而對RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用,。
2. dUTP法：用dUTP代替dTTP，使產(chǎn)物中摻入大量dU,。在再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增前,，用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG在PCR循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會影響含dU的新的PCR產(chǎn)物,。
3. dU引物法：合成引物時以dU 代dT,，這樣PCR產(chǎn)物中僅5ˊ端帶dU。UNG處理后,，引物失去了結(jié)合位點(diǎn)而不能擴(kuò)增,。對長片段（1-2kb以上）的擴(kuò)增用dUTP法效率較用dTTP低，而用dU法就可克服這一缺點(diǎn),。dU引物最好將dU設(shè)計在3ˊ端或近ˊ端,。該法僅能用于引物以外試劑的處理。
4. 優(yōu)點(diǎn)：可以去除任何來源的污染,；UNG處理可以和PCR擴(kuò)增在同一個反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行,；由于擴(kuò)增產(chǎn)物中有大量dU存在，可徹底消除污染源,。
5. 需注意的是摻入dUTP的DNA不應(yīng)對產(chǎn)物的任何操作有影響,，在進(jìn)行PCR產(chǎn)物克隆時，應(yīng)該轉(zhuǎn)化UNG-（UNG缺陷）大腸桿菌受體菌,，否則轉(zhuǎn)化產(chǎn)物會被受體菌UNG消化掉,。
（四） 固相捕獲法
用于去除標(biāo)本中污染的核酸和雜質(zhì)，原理如下：1）用一生物素標(biāo)記的單鏈RNA探針與待擴(kuò)核酸雜交,，雜交區(qū)域是非擴(kuò)增區(qū)；2）用包被鏈霉親和素的固相載體來捕獲帶有生物素探針的雜交核酸,，通過漂洗可去除污染的擴(kuò)增產(chǎn)物和雜質(zhì),；3）洗脫靶分子后用特異引物擴(kuò)增非RNA探針雜交區(qū)域。第2）步的漂洗后可用PCR檢測以確定標(biāo)本是否被擴(kuò)增產(chǎn)物或重組質(zhì)粒污染,。
（五）RS-PCR法（RNA-specific PCR）
也稱為鏈特異性PCR,，主要指用于RNA模板的特異性PCR法，該法可明顯降低假陽性而不影響PCR的敏感性,。其關(guān)鍵在于設(shè)計引物,，逆轉(zhuǎn)錄引物的3ˊ端（A區(qū)）有2 0個核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5ˊ端2 0個核苷酸（C區(qū)）為附加修飾堿基,。與mRNA逆轉(zhuǎn)錄后,，經(jīng)超速離心使 cDNA與多余引物分開，再用和第二引物（C）以第一鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA,，以后的PCR循環(huán)中用逆轉(zhuǎn)錄引物的B區(qū)和引物C進(jìn)行擴(kuò)增加尾cDNA,，而污染的DNA或質(zhì)粒DNA才不會被擴(kuò)增。
（六）抗污染引物法
該對引物擴(kuò)增時通過病毒DNA克隆如入質(zhì)粒的位點(diǎn),。這一區(qū)域只存在完整的原病毒中,，在重組質(zhì)粒中，這一區(qū)域分成兩個區(qū)域與克隆位點(diǎn)被。如果重組質(zhì)粒污染了標(biāo)本,，也不能擴(kuò)增出任何條帶,，即使出現(xiàn)了擴(kuò)增帶，其大小也與預(yù)期的不同,。只有原病毒DNA才能被引物擴(kuò)增,，因此只要出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增帶就可以證明標(biāo)本是陽性的，該法試用于環(huán)狀靶分子系列,。

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