1993年,Lee 等在秀麗廣桿線蟲(chóng) (Caenorhaditis elegan)上發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)能時(shí)序調(diào)控胚胎后期發(fā)育的基因lin-4(Lee et al.,1993).2000年,Reinhart等再次在C.elegans 中發(fā)現(xiàn)了第二個(gè)異時(shí)性開(kāi)關(guān)基因let-7,并將這些長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的小分子RNA稱(chēng)為小短暫RNA(small temporal RNAs,stRNA) (Reinhart et al.,2000; Pasquinelli et al.,2000).stRNA是研究miRNA(microRNA)的起始點(diǎn). 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)miRNA廣泛存在于許多真核模式生物和細(xì)胞中,它們是一類(lèi)長(zhǎng)度為21~25nt的單鏈RNA分子片段,屬于非蛋白編碼RNA,其生成與siRNA相似. miRNA和siRNA(short interfering RNA)都是體內(nèi)非編碼的小RNA基因,它們有許多相似之處并在生命活動(dòng)中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用.

(1). miRNA的特點(diǎn)

  miRNA具有以下幾個(gè)特征:

a. miRNA一般來(lái)源于染色體非編碼蛋白區(qū)的一段,本身不具有開(kāi)放閱讀框(ORF);

b.成熟的miRNA長(zhǎng)度通常是21~25nt,其5’端有一磷酸基團(tuán),3’端為羥基,但在3’端可以有1~2個(gè)堿基的長(zhǎng)度變化.可通過(guò)Northern blotting 檢測(cè)到;

c. miRNA能夠通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合于基因序列的側(cè)翼區(qū)域(Ruvkun et al.,2001;.Lagos-Quintata et al.,2001;Lau et al., 2001);

d. 多數(shù)miRNA在進(jìn)化上高度保守,各種miRNA都能在其他種系中找到同源體.最為顯著的例子就是在昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物hnRNP基因的內(nèi)含子中都發(fā)現(xiàn)mir-7的存在(Aravin et al.,2003).

e. miRNA基因不是隨機(jī)排列的,從同一個(gè)前體RNA加工而來(lái)的共表達(dá)miRNA存在基因簇(gene cluster)現(xiàn)象(Ruvkun et al.,2001;Lagos-Quintata et al.,2001;Lau et al.,2001).盡管大多線蟲(chóng)和人類(lèi)的miRNA 基因并不成簇(Lim et al.,2003a,2003b),但在果蠅中超過(guò)一般的miRNA是成簇出現(xiàn)的(Aravin et al.,2003).

f. miRNA表達(dá)具有細(xì)胞特異性和組織特異性.在組織培養(yǎng)的Schneider-2細(xì)胞可發(fā)現(xiàn)miR12,但是檢測(cè)不到miR3~miR6的存在(Lagos-Quintata et al.,2001).miR171在擬南芥的花序和花組織中高表達(dá),而在莖和葉組織中卻沒(méi)有表達(dá)的跡象(Reinhart et al.,2002).miRNA在不同的細(xì)胞和組織中表達(dá),顯示了它們?cè)诳刂苽€(gè)體發(fā)育中的特定功能.

g.大多數(shù)miRNA的表達(dá)具有時(shí)序性.mir3~mir7基因只在果蠅胚胎形成時(shí)表達(dá),而miR1,miR12的含量在果蠅幼蟲(chóng)階段急劇上升并在成蟲(chóng)期維持較高水平,同時(shí),在所有階段都存在的miR9和miR11的含量卻急劇減少(Lagos-Quintata et al.,2001).

(2). miRNA的功能

   miRNA的主要功能很可能是進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,目前已經(jīng)知道m(xù)iRNA的功能多與發(fā)育的時(shí)序調(diào)控有關(guān),但也參與了空間發(fā)育,應(yīng)激性,細(xì)胞周期和基因重組等過(guò)程(McManus et al.,2002).某些miRNA與RISC(RNA-induced silencing complex)相關(guān),能導(dǎo)致靶mRNA的裂解,產(chǎn)生基因沉默(Kindet et al.,2003).另外, miRNA還很可能與人類(lèi)的某些疾病也有關(guān)聯(lián).在慢性淋巴細(xì)胞白血病病人中發(fā)現(xiàn)miR15和miR16這兩個(gè)基因的表達(dá)有缺失或下調(diào)現(xiàn)象.這說(shuō)明了miRNA很可能與人類(lèi)腫瘤有關(guān)(Calin et al.,2002).最近研究還發(fā)現(xiàn),miRNA還參與果蠅中的脂肪代謝(Xu et al.,2003),、在植物中控制葉和花的發(fā)育(Aukerman and Sakai,2003;Emery et al.,2003;Palatnik et al.,2003)、以及在哺乳動(dòng)物中造血細(xì)胞的分化(Chen et al.,2004).在各類(lèi)小RNA中, miRNA可能具有最廣泛的基因調(diào)節(jié)功能,它能對(duì)基因活動(dòng)的各個(gè)層面進(jìn)行調(diào)節(jié),其中大多的具體過(guò)程還需要我們進(jìn)一步的研究.

(3). miRNA的作用機(jī)制

     miRNA與siRNA的作用機(jī)制類(lèi)似.

a. 動(dòng)物miRNA的生成

    大多數(shù)miRNA并不是經(jīng)由自己的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄而來(lái),而是來(lái)自內(nèi)含子的加工(David and Bartel.,2004).體內(nèi)試驗(yàn)表明miRNA先由長(zhǎng)的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本(pri-miRNA)生成~60-70nt的miRNA前體(pre-miRNA), 此過(guò)程是在Drosha RNase III 內(nèi)切酶催化下在細(xì)胞核內(nèi)完成的(Lee et al.,2003).pre-miRNA是長(zhǎng)約70nt的非編碼的RNA,它由內(nèi)源性基因的DNA反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄而來(lái)并且具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu).接著通過(guò)Ran-GTP和輸出受體Exportin-5把pre-miRNA從核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中(Lund et al.,2004).然后在細(xì)胞質(zhì)中通過(guò)Dicer把pre-miRNA加工為成熟的miRNA(Lee et al.,2002;Zeng and Cullen,2003). Dicer酶是一類(lèi)多結(jié)構(gòu)域的RNA酶III樣蛋白,因參與形成siRNAs而被首次發(fā)現(xiàn).產(chǎn)生miRNAs和產(chǎn)生siRNAs的過(guò)程中,Dicer的作用機(jī)制類(lèi)似.它都是通過(guò)對(duì)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNA的剪切,首先生成一個(gè)不穩(wěn)定的雙鏈RNA分子中間物即miRNA:miRNA*duplex,然后被解旋酶(未發(fā)現(xiàn))降解為長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸,5’端為單磷酸基,3’端為羥基的單鏈RNA 即miRNA(Hutvaner et al.,2001;Elbashir et al.,2001). miRNA是pre-miRNA莖中的一個(gè)臂,可定位于5’端的臂或3’端的臂. (見(jiàn)圖1)

b.動(dòng)物 miRNA的作用機(jī)制---翻譯抑制

圖1. miRNA產(chǎn)生阻遏和siRNA指導(dǎo)RNAi的共同途徑的模型(Hutvagner et al.,2002)

小RNA雙鏈復(fù)合物推測(cè)是短時(shí)存在的中介物

    miRNA需結(jié)合在一個(gè)約550kDa(15S)的含有PPD(PAZ&Piwi domain)蛋白核糖核蛋白(miRNA ribonucleoprotein complex,miRNP)中發(fā)揮生物學(xué)功能(Schwarz and Zamore,2002).人類(lèi)miRNP中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)含有elF2C2,Gemin3和Gemin4等蛋白(Mourelatos et al.,2002).其中elF2C2為Argonaute 類(lèi)似物,是siRNA誘導(dǎo)的RISC(RNA-induced silencing complex)組分之一.由此可見(jiàn),miRNA和siRNA有這類(lèi)似的作用機(jī)理.隨后發(fā)現(xiàn)植物miRNA可以降解天然的靶基因(Tang et al.,2003),而siRNA也可以引起翻譯抑制(Doench et al.,2003).

單鏈的miRNA再被PPD蛋白家族成員識(shí)別結(jié)合,形成一個(gè)RNA-蛋白復(fù)合體,即miRNP(類(lèi)似于RISC),進(jìn)而形成了成熟的miRNA.然后以反義RNA的形式與靶基因3’端非翻譯區(qū)(UTR)的特殊位點(diǎn)結(jié)合抑制其翻譯從而調(diào)控基因的表達(dá)(Leave et al.,2002). 在整個(gè)加工過(guò)程中,Dicer酶的識(shí)別核加工過(guò)程需要ATP供能,而后來(lái)與PPD蛋白質(zhì)家族的識(shí)別結(jié)合卻不需要ATP的參與(Holen et al.,2002).動(dòng)物miRNA一般通過(guò)對(duì)靶基因的不完全配對(duì)(imprecise base pairing)從而抑制靶基因的翻譯,但是并不引起靶基因的降解.如lin-4(Olsen and Ambros,1999).Brennecke 等利用人工構(gòu)建的對(duì)bantam miRNA完全互補(bǔ)的靶基因證實(shí)了miRNA一樣可以引起靶基因的降解(Brennecke et al.,2003).(如圖2所示)　進(jìn)而發(fā)現(xiàn)植物中miRNA通過(guò)對(duì)靶基因的完全互補(bǔ)而導(dǎo)致其降解(Tang et al.,2003).

c.植物miRNA的作用機(jī)制—切割降解

    植物miRNA的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)變化較大,這可能和它的生成過(guò)程有關(guān).在植物中miRNA雙鏈中間物的產(chǎn)生過(guò)程和動(dòng)物不同.在DCL1存在的情況下,Drosha能催化pri-miRNA轉(zhuǎn)變?yōu)閜re-miRNA(Papp et al.,2003).DCL1是一種Dicer類(lèi)似蛋白,它能協(xié)助植物miRNA的生成(Reinhart et al.,2002).然后,在DCL1或其他類(lèi)似蛋白的作用下,通過(guò)對(duì)pre-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的剪切,從而在細(xì)胞核內(nèi)生成中間物:miRNA:miRNA*duplex.然后在Exportin-5的類(lèi)似物HASTY的作用轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中(Lund et al.,2004).與動(dòng)物miRNA一樣,該中間物經(jīng)過(guò)某種解旋酶的作用后成為單鏈的miRNA而被定位于RISC.RISC通過(guò)堿基間精確的互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合于靶mRNA,從而導(dǎo)致mRNA的切割降解.這和siRNA導(dǎo)致的靶基因的切割降解作用完全一致.切割位點(diǎn)都在配對(duì)堿基10與11之間.

    miR172是一種植物miRNA,雖然它可以和靶基因APETALA2精確配對(duì),但是卻只能使該基因翻譯抑制而不會(huì)引起對(duì)該基因的切割降解(Aukerman and Sakai,2003;Chen,2003).有意思的是有些植物中的miRNA即使不能和靶基因5’端精確配對(duì),也同樣導(dǎo)致靶基因的切割降解(Kasschau et al.,2003;Palatnik et al.,2003).研究發(fā)現(xiàn),也許靶基因的最終抑制或切割不是由siRNA或miRNA所決定,而由靶基因本身所決定.支持這一觀點(diǎn)的例子很多,比如已經(jīng)發(fā)現(xiàn)siRNA也可以引起翻譯抑制(Doench et al.,2003).

(4).miRNA和siRNA的區(qū)別與聯(lián)系

  miRNA和siRNA同為非編碼蛋白的小RNA基因,并且都經(jīng)Dicer作用而形成的產(chǎn)物.因此它們之間存在許多共同的特點(diǎn),但同時(shí)也存在許多不同.

 
 miRNA
 siRNA
 
來(lái)源
 內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本
 轉(zhuǎn)基因或病毒RNA
 
前體
 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的pre-miRNA
 雙鏈結(jié)構(gòu)的dsRNA
 
作用酶
 Dicer或Dicer like proteins
 Dicer
 
作用方式
 不完全互補(bǔ)或完全互補(bǔ)
 完全互補(bǔ)
 
作用特異性
 相對(duì)較低
 高
 
作用部位
 蛋白質(zhì)合成水平
 轉(zhuǎn)錄后水平
 
長(zhǎng)度
 ~22nt
 ~22nt
 
功能
 發(fā)育過(guò)程中,調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)
 抑制轉(zhuǎn)錄子活性和病毒感染.另還與表型遺傳有關(guān)
 
靶基因命運(yùn)
 抑制翻譯或被降解
 被降解
 

(5).展望

   miRNA的研究被<<science>>雜志列為2002年世界十大科技突破之首.miRNA的廣泛存在與進(jìn)化保守性也暗示著它在生命活動(dòng)中必定起著十分廣泛的調(diào)節(jié)作用,對(duì)基因表達(dá),生長(zhǎng)發(fā)育和行為等都具有十分廣泛和深遠(yuǎn)的效應(yīng).然而,我們對(duì)其認(rèn)識(shí)并不深刻.還有許多問(wèn)題需要我們進(jìn)一步的探索.