1993年,Lee 等在秀麗廣桿線蟲 (Caenorhaditis elegan)上發(fā)現(xiàn)了第一個能時序調(diào)控胚胎后期發(fā)育的基因lin-4(Lee et al.,1993).2000年,Reinhart等再次在C.elegans 中發(fā)現(xiàn)了第二個異時性開關(guān)基因let-7,并將這些長度約為22個核苷酸的小分子RNA稱為小短暫RNA(small temporal RNAs,stRNA) (Reinhart et al.,2000; Pasquinelli et al.,2000).stRNA是研究miRNA(microRNA)的起始點. 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)miRNA廣泛存在于許多真核模式生物和細胞中,它們是一類長度為21~25nt的單鏈RNA分子片段,屬于非蛋白編碼RNA,其生成與siRNA相似. miRNA和siRNA(short interfering RNA)都是體內(nèi)非編碼的小RNA基因,它們有許多相似之處并在生命活動中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用.

(1). miRNA的特點

  miRNA具有以下幾個特征:

a. miRNA一般來源于染色體非編碼蛋白區(qū)的一段,本身不具有開放閱讀框(ORF);

b.成熟的miRNA長度通常是21~25nt,其5’端有一磷酸基團,3’端為羥基,但在3’端可以有1~2個堿基的長度變化.可通過Northern blotting 檢測到;

c. miRNA能夠通過堿基互補配對結(jié)合于基因序列的側(cè)翼區(qū)域(Ruvkun et al.,2001;.Lagos-Quintata et al.,2001;Lau et al., 2001);

d. 多數(shù)miRNA在進化上高度保守,各種miRNA都能在其他種系中找到同源體.最為顯著的例子就是在昆蟲和哺乳動物hnRNP基因的內(nèi)含子中都發(fā)現(xiàn)mir-7的存在(Aravin et al.,2003).

e. miRNA基因不是隨機排列的,從同一個前體RNA加工而來的共表達miRNA存在基因簇(gene cluster)現(xiàn)象(Ruvkun et al.,2001;Lagos-Quintata et al.,2001;Lau et al.,2001).盡管大多線蟲和人類的miRNA 基因并不成簇(Lim et al.,2003a,2003b),但在果蠅中超過一般的miRNA是成簇出現(xiàn)的(Aravin et al.,2003).

f. miRNA表達具有細胞特異性和組織特異性.在組織培養(yǎng)的Schneider-2細胞可發(fā)現(xiàn)miR12,但是檢測不到miR3~miR6的存在(Lagos-Quintata et al.,2001).miR171在擬南芥的花序和花組織中高表達,而在莖和葉組織中卻沒有表達的跡象(Reinhart et al.,2002).miRNA在不同的細胞和組織中表達,顯示了它們在控制個體發(fā)育中的特定功能.

g.大多數(shù)miRNA的表達具有時序性.mir3~mir7基因只在果蠅胚胎形成時表達,而miR1,miR12的含量在果蠅幼蟲階段急劇上升并在成蟲期維持較高水平,同時,在所有階段都存在的miR9和miR11的含量卻急劇減少(Lagos-Quintata et al.,2001).

(2). miRNA的功能

   miRNA的主要功能很可能是進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,目前已經(jīng)知道m(xù)iRNA的功能多與發(fā)育的時序調(diào)控有關(guān),但也參與了空間發(fā)育,應(yīng)激性,細胞周期和基因重組等過程(McManus et al.,2002).某些miRNA與RISC(RNA-induced silencing complex)相關(guān),能導(dǎo)致靶mRNA的裂解,產(chǎn)生基因沉默(Kindet et al.,2003).另外, miRNA還很可能與人類的某些疾病也有關(guān)聯(lián).在慢性淋巴細胞白血病病人中發(fā)現(xiàn)miR15和miR16這兩個基因的表達有缺失或下調(diào)現(xiàn)象.這說明了miRNA很可能與人類腫瘤有關(guān)(Calin et al.,2002).最近研究還發(fā)現(xiàn),miRNA還參與果蠅中的脂肪代謝(Xu et al.,2003)、在植物中控制葉和花的發(fā)育(Aukerman and Sakai,2003;Emery et al.,2003;Palatnik et al.,2003),、以及在哺乳動物中造血細胞的分化(Chen et al.,2004).在各類小RNA中, miRNA可能具有最廣泛的基因調(diào)節(jié)功能,它能對基因活動的各個層面進行調(diào)節(jié),其中大多的具體過程還需要我們進一步的研究.

(3). miRNA的作用機制

     miRNA與siRNA的作用機制類似.

a. 動物miRNA的生成

    大多數(shù)miRNA并不是經(jīng)由自己的啟動子轉(zhuǎn)錄而來,而是來自內(nèi)含子的加工(David and Bartel.,2004).體內(nèi)試驗表明miRNA先由長的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本(pri-miRNA)生成~60-70nt的miRNA前體(pre-miRNA), 此過程是在Drosha RNase III 內(nèi)切酶催化下在細胞核內(nèi)完成的(Lee et al.,2003).pre-miRNA是長約70nt的非編碼的RNA,它由內(nèi)源性基因的DNA反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄而來并且具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu).接著通過Ran-GTP和輸出受體Exportin-5把pre-miRNA從核內(nèi)轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中(Lund et al.,2004).然后在細胞質(zhì)中通過Dicer把pre-miRNA加工為成熟的miRNA(Lee et al.,2002;Zeng and Cullen,2003). Dicer酶是一類多結(jié)構(gòu)域的RNA酶III樣蛋白,因參與形成siRNAs而被首次發(fā)現(xiàn).產(chǎn)生miRNAs和產(chǎn)生siRNAs的過程中,Dicer的作用機制類似.它都是通過對莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNA的剪切,首先生成一個不穩(wěn)定的雙鏈RNA分子中間物即miRNA:miRNA*duplex,然后被解旋酶(未發(fā)現(xiàn))降解為長度約22個核苷酸,5’端為單磷酸基,3’端為羥基的單鏈RNA 即miRNA(Hutvaner et al.,2001;Elbashir et al.,2001). miRNA是pre-miRNA莖中的一個臂,可定位于5’端的臂或3’端的臂. (見圖1)

b.動物 miRNA的作用機制---翻譯抑制

圖1. miRNA產(chǎn)生阻遏和siRNA指導(dǎo)RNAi的共同途徑的模型(Hutvagner et al.,2002)

小RNA雙鏈復(fù)合物推測是短時存在的中介物

    miRNA需結(jié)合在一個約550kDa(15S)的含有PPD(PAZ&Piwi domain)蛋白核糖核蛋白(miRNA ribonucleoprotein complex,miRNP)中發(fā)揮生物學(xué)功能(Schwarz and Zamore,2002).人類miRNP中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)含有elF2C2,Gemin3和Gemin4等蛋白(Mourelatos et al.,2002).其中elF2C2為Argonaute 類似物,是siRNA誘導(dǎo)的RISC(RNA-induced silencing complex)組分之一.由此可見,miRNA和siRNA有這類似的作用機理.隨后發(fā)現(xiàn)植物miRNA可以降解天然的靶基因(Tang et al.,2003),而siRNA也可以引起翻譯抑制(Doench et al.,2003).

單鏈的miRNA再被PPD蛋白家族成員識別結(jié)合,形成一個RNA-蛋白復(fù)合體,即miRNP(類似于RISC),進而形成了成熟的miRNA.然后以反義RNA的形式與靶基因3’端非翻譯區(qū)(UTR)的特殊位點結(jié)合抑制其翻譯從而調(diào)控基因的表達(Leave et al.,2002). 在整個加工過程中,Dicer酶的識別核加工過程需要ATP供能,而后來與PPD蛋白質(zhì)家族的識別結(jié)合卻不需要ATP的參與(Holen et al.,2002).動物miRNA一般通過對靶基因的不完全配對(imprecise base pairing)從而抑制靶基因的翻譯,但是并不引起靶基因的降解.如lin-4(Olsen and Ambros,1999).Brennecke 等利用人工構(gòu)建的對bantam miRNA完全互補的靶基因證實了miRNA一樣可以引起靶基因的降解(Brennecke et al.,2003).(如圖2所示)　進而發(fā)現(xiàn)植物中miRNA通過對靶基因的完全互補而導(dǎo)致其降解(Tang et al.,2003).

c.植物miRNA的作用機制—切割降解

    植物miRNA的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)變化較大,這可能和它的生成過程有關(guān).在植物中miRNA雙鏈中間物的產(chǎn)生過程和動物不同.在DCL1存在的情況下,Drosha能催化pri-miRNA轉(zhuǎn)變?yōu)閜re-miRNA(Papp et al.,2003).DCL1是一種Dicer類似蛋白,它能協(xié)助植物miRNA的生成(Reinhart et al.,2002).然后,在DCL1或其他類似蛋白的作用下,通過對pre-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的剪切,從而在細胞核內(nèi)生成中間物:miRNA:miRNA*duplex.然后在Exportin-5的類似物HASTY的作用轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中(Lund et al.,2004).與動物miRNA一樣,該中間物經(jīng)過某種解旋酶的作用后成為單鏈的miRNA而被定位于RISC.RISC通過堿基間精確的互補配對結(jié)合于靶mRNA,從而導(dǎo)致mRNA的切割降解.這和siRNA導(dǎo)致的靶基因的切割降解作用完全一致.切割位點都在配對堿基10與11之間.

    miR172是一種植物miRNA,雖然它可以和靶基因APETALA2精確配對,但是卻只能使該基因翻譯抑制而不會引起對該基因的切割降解(Aukerman and Sakai,2003;Chen,2003).有意思的是有些植物中的miRNA即使不能和靶基因5’端精確配對,也同樣導(dǎo)致靶基因的切割降解(Kasschau et al.,2003;Palatnik et al.,2003).研究發(fā)現(xiàn),也許靶基因的最終抑制或切割不是由siRNA或miRNA所決定,而由靶基因本身所決定.支持這一觀點的例子很多,比如已經(jīng)發(fā)現(xiàn)siRNA也可以引起翻譯抑制(Doench et al.,2003).

(4).miRNA和siRNA的區(qū)別與聯(lián)系

  miRNA和siRNA同為非編碼蛋白的小RNA基因,并且都經(jīng)Dicer作用而形成的產(chǎn)物.因此它們之間存在許多共同的特點,但同時也存在許多不同.

 
 miRNA
 siRNA
 
來源
 內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本
 轉(zhuǎn)基因或病毒RNA
 
前體
 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的pre-miRNA
 雙鏈結(jié)構(gòu)的dsRNA
 
作用酶
 Dicer或Dicer like proteins
 Dicer
 
作用方式
 不完全互補或完全互補
 完全互補
 
作用特異性
 相對較低
 高
 
作用部位
 蛋白質(zhì)合成水平
 轉(zhuǎn)錄后水平
 
長度
 ~22nt
 ~22nt
 
功能
 發(fā)育過程中,調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達
 抑制轉(zhuǎn)錄子活性和病毒感染.另還與表型遺傳有關(guān)
 
靶基因命運
 抑制翻譯或被降解
 被降解
 

(5).展望

   miRNA的研究被<<science>>雜志列為2002年世界十大科技突破之首.miRNA的廣泛存在與進化保守性也暗示著它在生命活動中必定起著十分廣泛的調(diào)節(jié)作用,對基因表達,生長發(fā)育和行為等都具有十分廣泛和深遠的效應(yīng).然而,我們對其認識并不深刻.還有許多問題需要我們進一步的探索.