要真正理解細(xì)胞系統(tǒng)的生化過(guò)程,，內(nèi)源蛋白的濃度大小就必須知道。最近,，研究者通過(guò)熒光融合蛋白定量測(cè)量法,，成功解決了內(nèi)源蛋白濃度的測(cè)量問題。
目前,，由于人們對(duì)細(xì)胞內(nèi)工作機(jī)制的了解日益加深,，因此開發(fā)活體細(xì)胞中有關(guān)生化過(guò)程和物質(zhì)結(jié)構(gòu)的工具和技術(shù)也就有了基礎(chǔ)。研究細(xì)胞系統(tǒng)的生物化學(xué)過(guò)程的一個(gè)關(guān)鍵因素就是要知道參與的生物分子的濃度大小,，但令人奇怪的是,，這一定量信息并不容易獲得。“生物體的任何變化都是復(fù)雜的化學(xué)和物理過(guò)程,，因此發(fā)生在生物體的任何反應(yīng)活動(dòng)都取決于反應(yīng)物的濃度大小,，”耶魯大學(xué)的Thomas Pollard認(rèn)為，“但是,，并沒有足夠多的細(xì)胞生物學(xué)家對(duì)定量測(cè)量問題給予足夠的關(guān)注,。”
Pollard和博士后武建秋希望上述情況能有所改變，他們同時(shí)提供了一種能測(cè)量活體細(xì)胞中內(nèi)源蛋白的全細(xì)胞濃度和局部濃度的方法,。雖然免疫印跡技術(shù)已經(jīng)被用來(lái)測(cè)量細(xì)胞中蛋白的拷貝數(shù),，但是這種方法并不能用于局部濃度的測(cè)量。熒光反應(yīng)可有效顯示物質(zhì)的局部濃度,，但是很少有研究者愿意不辭勞苦地去從事細(xì)胞中標(biāo)記蛋白的熒光反應(yīng)校準(zhǔn)工作,。Pollard說(shuō)：“隨便翻開一本生物學(xué)期刊，你會(huì)發(fā)現(xiàn)里面充斥著各種漂亮的熒光融合蛋白的圖片,，但很少有人能夠從這些圖片中獲得任何的定量信息,。”
武建秋和Pollard在工作中使用了裂殖酵母作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。他們根據(jù)同源重組原理,，通過(guò)內(nèi)源啟動(dòng)子表達(dá),，將一種熒光融合蛋白替代了原有的內(nèi)源蛋白。由于對(duì)胞質(zhì)分裂的機(jī)制特別感興趣，他們就將黃色熒光蛋白(YFP)在27個(gè)不同胞質(zhì)分裂蛋白的氨基或羧基端整合到基因組中,。他們仔細(xì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè),，以確保YFP融合并沒有實(shí)質(zhì)性地改變內(nèi)源蛋白的功能或表達(dá)。使用共焦點(diǎn)顯微法和定量免疫印跡技術(shù),，他們校準(zhǔn)了每個(gè)YPF分子的熒光強(qiáng)度,，過(guò)去他們用它來(lái)計(jì)算一個(gè)活體細(xì)胞中熒光融合蛋白的數(shù)量。最后,，他們得出了胞質(zhì)分裂中各種蛋白的濃度大小,，范圍從每一細(xì)胞的600個(gè)拷貝到每一細(xì)胞的143萬(wàn)個(gè)拷貝。
甚至在像酵母這樣的基因友好型的生物體中,，要對(duì)被基因組編碼的每一個(gè)蛋白進(jìn)行標(biāo)記也是不太可能的,。武建秋和Pollard在研究肌動(dòng)蛋白時(shí)也碰到了這樣的難題，但他們找到了一個(gè)解決的辦法：一個(gè)被標(biāo)記的熒光融合蛋白在低水平的情況下可通過(guò)質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá),，此時(shí)在不大量增加它的內(nèi)源總體濃度的情況下有可能對(duì)該蛋白的移動(dòng)過(guò)程進(jìn)行可視化攝影,。當(dāng)研究那些不具有同源重組特征的生物體時(shí)，這種策略也可能被派上用場(chǎng),。
盡管人們對(duì)活體生物中各種傳統(tǒng)的生化過(guò)程已經(jīng)進(jìn)行了分離研究,，但是，能夠獲得活體細(xì)胞內(nèi)的定量信息仍然為生物學(xué)家提供了關(guān)于細(xì)胞系統(tǒng)的更為精確的圖像,。Pollard概括性地解釋說(shuō)：“今天的生物學(xué),，最終就是要把所有能收集到的定量信息綜合在一起，來(lái)幫助理解諸如胞質(zhì)分裂這樣龐大的生命活動(dòng)系統(tǒng)是如何進(jìn)行工作的,。”
注：夏雨譯自2005年12月號(hào)的《自然-方法學(xué)》,，版權(quán)為英國(guó)NPG出版集團(tuán)所有。更多信息請(qǐng)?jiān)L問：http://www.natureasia.com/ch/naturemethods
