要真正理解細胞系統(tǒng)的生化過程,，內(nèi)源蛋白的濃度大小就必須知道。最近,，研究者通過熒光融合蛋白定量測量法,，成功解決了內(nèi)源蛋白濃度的測量問題。
目前,，由于人們對細胞內(nèi)工作機制的了解日益加深,，因此開發(fā)活體細胞中有關(guān)生化過程和物質(zhì)結(jié)構(gòu)的工具和技術(shù)也就有了基礎(chǔ)。研究細胞系統(tǒng)的生物化學(xué)過程的一個關(guān)鍵因素就是要知道參與的生物分子的濃度大小,，但令人奇怪的是，這一定量信息并不容易獲得,。“生物體的任何變化都是復(fù)雜的化學(xué)和物理過程,，因此發(fā)生在生物體的任何反應(yīng)活動都取決于反應(yīng)物的濃度大小，”耶魯大學(xué)的Thomas Pollard認(rèn)為,，“但是,，并沒有足夠多的細胞生物學(xué)家對定量測量問題給予足夠的關(guān)注。”
Pollard和博士后武建秋希望上述情況能有所改變,，他們同時提供了一種能測量活體細胞中內(nèi)源蛋白的全細胞濃度和局部濃度的方法,。雖然免疫印跡技術(shù)已經(jīng)被用來測量細胞中蛋白的拷貝數(shù)，但是這種方法并不能用于局部濃度的測量,。熒光反應(yīng)可有效顯示物質(zhì)的局部濃度,，但是很少有研究者愿意不辭勞苦地去從事細胞中標(biāo)記蛋白的熒光反應(yīng)校準(zhǔn)工作。Pollard說：“隨便翻開一本生物學(xué)期刊,，你會發(fā)現(xiàn)里面充斥著各種漂亮的熒光融合蛋白的圖片,，但很少有人能夠從這些圖片中獲得任何的定量信息。”
武建秋和Pollard在工作中使用了裂殖酵母作為實驗對象,。他們根據(jù)同源重組原理,，通過內(nèi)源啟動子表達，將一種熒光融合蛋白替代了原有的內(nèi)源蛋白,。由于對胞質(zhì)分裂的機制特別感興趣,，他們就將黃色熒光蛋白(YFP)在27個不同胞質(zhì)分裂蛋白的氨基或羧基端整合到基因組中。他們仔細對細胞進行了檢測,，以確保YFP融合并沒有實質(zhì)性地改變內(nèi)源蛋白的功能或表達,。使用共焦點顯微法和定量免疫印跡技術(shù)，他們校準(zhǔn)了每個YPF分子的熒光強度,，過去他們用它來計算一個活體細胞中熒光融合蛋白的數(shù)量,。最后，他們得出了胞質(zhì)分裂中各種蛋白的濃度大小,，范圍從每一細胞的600個拷貝到每一細胞的143萬個拷貝,。
甚至在像酵母這樣的基因友好型的生物體中,，要對被基因組編碼的每一個蛋白進行標(biāo)記也是不太可能的。武建秋和Pollard在研究肌動蛋白時也碰到了這樣的難題,，但他們找到了一個解決的辦法：一個被標(biāo)記的熒光融合蛋白在低水平的情況下可通過質(zhì)粒進行表達,，此時在不大量增加它的內(nèi)源總體濃度的情況下有可能對該蛋白的移動過程進行可視化攝影。當(dāng)研究那些不具有同源重組特征的生物體時,，這種策略也可能被派上用場,。
盡管人們對活體生物中各種傳統(tǒng)的生化過程已經(jīng)進行了分離研究，但是,，能夠獲得活體細胞內(nèi)的定量信息仍然為生物學(xué)家提供了關(guān)于細胞系統(tǒng)的更為精確的圖像,。Pollard概括性地解釋說：“今天的生物學(xué)，最終就是要把所有能收集到的定量信息綜合在一起,，來幫助理解諸如胞質(zhì)分裂這樣龐大的生命活動系統(tǒng)是如何進行工作的,。”
注：夏雨譯自2005年12月號的《自然-方法學(xué)》，版權(quán)為英國NPG出版集團所有,。更多信息請訪問：http://www.natureasia.com/ch/naturemethods
