MicroRNA(miRNA)  是近幾年在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類具有調(diào)控功能的非編碼  RNA，它們主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控,。miRNA  的調(diào)控功能是十分重要的,，近來發(fā)現(xiàn)它們在果蠅的細(xì)胞增殖,、死亡及脂肪代謝，線蟲極性的形成,，哺乳動物的造血干細(xì)胞的分化等過程中起了重要的調(diào)控作用,。在植物中，miRNA  還參與了葉子與花的發(fā)育過程,。  

　　動物(尤其是人)  miRNA  的生物合成過程已經(jīng)初步得到了詮釋。首先,，miRNA  基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物  (pri-miRNA)  在細(xì)胞核中被  RNase  Ⅲ  Drosha  切割成為前體  miRNA  (pre-miRNA),。在最初的剪切后，pre-miRNA  在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白  exportin-5  的作用下由核內(nèi)轉(zhuǎn)到胞質(zhì)中,，然后由另一種  RNase  Ⅲ  Dicer  進(jìn)一步切割產(chǎn)生成熟的  miRNA,。這些成熟的  miRNA  與其他蛋白質(zhì)一起組成  RISC  (RNA-induced  silencing  complex)  復(fù)合體，從而引起靶  mRNA  的降解或者翻譯抑制,。這一過程如圖1a所示,。  

1  miRNA  基因的轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物的剪接  

　　大多數(shù)  miRNA  基因與蛋白質(zhì)基因距離比較遠(yuǎn)，它們可能有自己的啟動子可以進(jìn)行獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄,。但是也有相當(dāng)多的  miRNA  基因,，人有1/4的  miRNA  基因是位于蛋白質(zhì)基因的內(nèi)含子當(dāng)中的,，通常  miRNA  基因與內(nèi)含子的轉(zhuǎn)錄方向是一致的，這就說明這些基因大多是與寄主蛋白基因共轉(zhuǎn)錄的,，然后再從這些蛋白質(zhì)基因的內(nèi)含子中剪切出來,。并且同一類  miRNA  基因在不同生物體中的寄主基因往往是保守的同一類蛋白質(zhì)基因。正是由于  miRNA  與其寄主蛋白基因是共表達(dá)的,，而使它們的聯(lián)系在進(jìn)化過程中也保守地保存下來,。還有一些  miRNA  基因是成簇分布在染色體上，它們通過一個共同的啟動子轉(zhuǎn)錄成為多順反子,。雖然這種形式在線蟲和人的  miRNA  基因中比較少見,，但是果蠅的  miRNA  基因中一半是成簇的。而且這些成簇的  miRNA  基因經(jīng)常是彼此相關(guān)的,。例如人的  mir-15a-mir-16  基因簇是位于13號染色體上的一個抑癌基因中,，而這一位置在  B  細(xì)胞與  T  細(xì)胞白血病中均產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)的畸變。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),，這兩個  miRNA  確實(shí)與白血病的發(fā)生有關(guān),。  

　　目前，我們對  miRNA  基因如何轉(zhuǎn)錄成為  pri-miRNA  還知之甚少,。研究發(fā)現(xiàn)  RNA  聚合酶Ⅱ和Ⅲ均可以參與  miRNA  的轉(zhuǎn)錄,。位于蛋白質(zhì)基因內(nèi)含子中的  miRNA  基因毫無疑問是由聚合酶Ⅱ進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的。雖然大多數(shù)其他  miRNA  基因缺少加多聚腺苷酸尾的信號,，還有一些間接的證據(jù)證明它們也有可能是聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：a．有些  pri-miRNAs  相當(dāng)長,，有時超過1  kb，這比聚合酶Ⅲ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長很多,。b．大多數(shù)  pri-miRNAs  最后一個堿基為尿嘧啶,，而這通常被認(rèn)為是聚合酶Ⅲ提前中止的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。c．許多  miRNA  基因的表達(dá)在發(fā)育過程中是變化的,，這種表達(dá)變化通常在聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中比較常見,。d．將某些  miRNA  基因的5'區(qū)域與報告基因的開放閱讀框相融合，可以使報告基因得到表達(dá),，說明這種  miRNA  基因是可以通過聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的,。e．對于線蟲  let-7  miRNA  的研究表明，let-7  pri-miRNA  有多聚腺苷酸尾,，確實(shí)是由聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生,。另外，聚合酶Ⅲ也可以參與  miRNA  基因的轉(zhuǎn)錄,。例如,，給  miRNA  基因加上聚合酶Ⅲ的啟動子由聚合酶Ⅲ進(jìn)行表達(dá)，在體內(nèi)不僅可以有效地表達(dá)出這些  miRNA,，同時它們還可以行使其功能,，這就說明,，miRNA  的加工及其功能的行使與由何種聚合酶參與其基因的轉(zhuǎn)錄并沒有必然的聯(lián)系。  

　　對于  pri-miRNA  轉(zhuǎn)錄后加工的研究十分有限,，只有對線蟲  let-7  miRNA  的研究比較完整,。Bracht  等發(fā)現(xiàn)了兩種長的5'端加帽，3'端加多聚腺苷酸尾的  let-7  pri-miRNA,，是由聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的,。這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在5'端有剪接引導(dǎo)序列，它們可以作為反式剪接的底物,。實(shí)驗(yàn)證明,，初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的反式剪接對于成熟的  let-7  RNA  的產(chǎn)生十分重要，其序列和結(jié)構(gòu)的變化對于接下來的剪切反應(yīng)影響很大,，含有成熟的  let-7  RNA  發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體,，其附近序列的二級結(jié)構(gòu)在剪接前后發(fā)生了變化，這一變化延長了  let-7  RNA  的發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體末端的莖區(qū),，這一結(jié)構(gòu)也是  RNase  Ⅲ  Drosha  的底物類似物,。同時，初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的反式剪接也去掉了對下一步剪切造成空間阻抑的序列,。因此,，對  miRNA  初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪接可以顯著改變發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體周圍的序列及結(jié)構(gòu)，從而有利于對  miRNA  前體的進(jìn)一步剪切,。  

　　Pri-miRNA  的第一步剪切是由核糖核酸酶Ⅲ  Drosha  完成,。其產(chǎn)物是～70  nt  的發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體  (pre-miRNA)。這一切割反應(yīng)不僅切出了成熟的  miRNA  的3'末端,，而且使3'末端有2  nt  的突出,，這正是由核糖核酸酶Ⅲ進(jìn)行切割的特征。而且,，切割反應(yīng)并不是發(fā)生在發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體的基部,，而是基部上的幾個堿基處。Drosha  進(jìn)行切割的特異性序列還沒有找到,，但是前體基部的螺旋結(jié)構(gòu)對于切割是十分重要的,，因?yàn)樵谇绑w的莖區(qū)插入和刪除序列將導(dǎo)致切割位點(diǎn)的改變。最新的研究發(fā)現(xiàn),，參與這一切割過程的是一個多蛋白質(zhì)復(fù)合體，Drosha  是其中的重要成分,，起到切割的作用,。在這一復(fù)合體中，還存在一種雙鏈  RNA  結(jié)合蛋白  Pasha  (partner  of  Drosha),。在果蠅細(xì)胞和線蟲中抑制  Pasha  的表達(dá),，干擾了  pri-miRNA  的剪切,，使細(xì)胞內(nèi)  pri-miRNA  的積累增多，成熟  miRNA  的量減少,。Pasha  在復(fù)合體中的具體功能還不清楚,，但是它可能參與識別  miRNA  的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，將它們集中到復(fù)合體中,，有利于其被  Drosha  切割,。另外，Pasha  可能對  pri-miRNA  在復(fù)合體中的定向有幫助,，從而有利于  Drosha  在特定位點(diǎn)的切割,。  

2  miRNA  前體的轉(zhuǎn)運(yùn)出核  

　　由于動物的  pre-miRNA  需要胞質(zhì)中的  Dicer  酶進(jìn)行進(jìn)一步加工，轉(zhuǎn)運(yùn)出核就成為  miRNA  成熟過程中必需的一步,。這一過程是通過依賴  RanGTP/exportin  5  的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制來完成的,。在細(xì)胞核中，RanGTP  的濃度較高,，Exportin  5  (Exp5)  就可以促進(jìn)  pre-miRNA  從  Drosha  復(fù)合體中釋放,，并且與之結(jié)合，將其帶到核外,。由于胞質(zhì)中  RanGTP  的濃度較低,，Exp5  就釋放  pre-miRNA，使之與  Dicer  結(jié)合進(jìn)行下一步的切割,。在運(yùn)輸過程中,，miRNA  前體的3'突出將有利于其進(jìn)入運(yùn)出核的途徑。  

3  Pre-miRNA  的剪切與  miRNA  的成熟  

　　在動物細(xì)胞核中,，Drosha  的切割產(chǎn)生了成熟  miRNA  的一端(3'端),。另一端的切割成熟是由胞質(zhì)中另一類核糖核酸酶Ⅲ  Dicer  切割產(chǎn)生的。Dicer  首先是在研究小干擾  RNA(siRNA)  引起的基因沉默中被發(fā)現(xiàn)的,，后來發(fā)現(xiàn)它在  miRNA  的成熟過程中也起著重要的作用,。Dicer  參與  miRNA  的成熟過程與  RNA  干擾中產(chǎn)生雙鏈  RNA  的過程很相似：首先  Dicer  識別  pre-miRNA  的雙鏈部分，其與莖環(huán)基部的5'端被磷酸化,、3'端有突出的結(jié)構(gòu)有很高的親和力,。然后，莖環(huán)基部的兩圈螺旋解開,，  Dicer  對兩條鏈都進(jìn)行切割,，將前體的其余部分切掉，生成5'端磷酸化,、3'端有2  nt  突出的類似于  siRNA  的不完全配對的雙鏈,。這條  RNA  雙鏈?zhǔn)怯沙墒?nbsp; miRNA  與  miRNA*  組成的(見圖1a中的第4步)。miRNA*  是  pre-miRNA  上的一段  RNA，其位置恰好與成熟的  miRNA  相對,。雖然  Dicer  在對  pre-miRNA  的加工過程中能夠產(chǎn)生  RNA  雙鏈中間體,，但是這種中間體通常壽命比較短暫而不易被探測。不過,，如果大量的前體均可產(chǎn)生并只產(chǎn)生一種  miRNA,，則其雙鏈中的星號鏈也可以成為成熟的  miRNA。  

　　就現(xiàn)有的動物  miRNA  成熟的模型來看,，最初由  Drosha  介導(dǎo)的切割特異性決定了  miRNA  前體中  Dicer  的切割位點(diǎn),，從而決定了成熟  miRNA  的兩端。由  Drosha  而不是  Dicer  決定這一特異性是由于研究表明  Drosha  對非特異性雙鏈  RNA  的切割效率很差,，而  Dicer  可以沒有序列依賴性地切割任何  RNA  雙鏈,。并且  Drosha  的切割還依賴于  pri-miRNA  莖環(huán)基部的二級結(jié)構(gòu)，以及莖環(huán)基部外側(cè)125  nt  范圍內(nèi)的序列,。  

4  植物  miRNA  的成熟過程  

　　植物  miRNA  的成熟過程與動物有所不同,，因?yàn)橹参镏袥]有  Drosha  的同源類似物。在植物中通常很難檢測到  pre-miRNA,，即使在  DCL1  突變的植物中也很少檢測到,。DCL1  是植物  miRNA  成熟過程中類似于  Dicer  的蛋白質(zhì)，它是位于核內(nèi)的,。這就說明在植物中可能有其他酶(很有可能是  DCL1  )行使了  Drosha  的功能,，對  miRNA  的轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物進(jìn)行第一次切割，并且決定了成熟的  miRNA  的序列,。(如圖1b中的第2步),。在  miRNA  離開細(xì)胞核之前，DCL1  (或其他酶)又進(jìn)行了第二次切割,，相當(dāng)于動物細(xì)胞中  Dicer  對  pre-miRNA  的切割(如圖1b中的第3步),。然后，可能是由  HASTY  (Exportin-5  在植物中的同源類似物)負(fù)責(zé)將  miRNA：miRNA*  雙鏈轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核(圖1b中的第4步),。由于經(jīng)核內(nèi)連續(xù)兩次切割,，在植物中才難以檢測到  pre-miRNA  樣的  RNA。  

　　擬南芥(Arabidopsis  thaliana)  作為植物中的一種模式生物,，對其  miRNA  的研究是最多的,。最近，對擬南芥  miR163  的研究進(jìn)一步揭示了植物  miRNA  的成熟過程,。擬南芥的基因組編碼4種  Dicer  樣的酶  (DCL1-DCL4),。其中  DCL1  是與  miRNA  的積累相關(guān)的，DCL2  和  DCL3  分別參與了由病毒引起的小干擾  RNA(siRNA)  和內(nèi)源性  siRNA  (例如反轉(zhuǎn)座子  siRNA)  的合成,。擬南芥  miR163  是單獨(dú)轉(zhuǎn)錄的,，由  RNA  聚合酶Ⅱ催化合成,，其轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物  pri-miR163  需要經(jīng)過核糖核酸酶Ⅲ樣的酶切割三次才能成為成熟的  miRNA。第一步是在  pri-miR163  的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的根部進(jìn)行切割,，得到長  miR163  前體  (pre-miR163)，第二步是對長  pre-miR163  中成熟的  miRNA  的3'根部進(jìn)行剪切,，得到短的  pre-miR163,，最后是由短的前體切割出成熟的5'端成為成熟的  miRNA  (圖2)。有趣的是,，在整個剪切的過程中,，四種小分子都可以被釋放出來。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明,，擬南芥的  DCL1  至少可以對第一及第二步切割反應(yīng)進(jìn)行催化,，即對  pri-  和  pre-miRNA  都可以切割。另外,，第三步的切割反應(yīng)可能也是  DCL1  催化的,。所以擬南芥的  DCL1  蛋白參與了  miRNA  成熟的全過程。由于擬南芥的  DCL1  蛋白有兩個類核定位信號,，因此植物的  miRNA  的成熟是在細(xì)胞核中完成的,。同時，研究表明,，植物  DCL1  蛋白的雙鏈  RNA  結(jié)合區(qū)在決定第一次和第二次的切割位點(diǎn)時是十分重要的,。在  dcl1-9_dcl1-9  的突變體當(dāng)中仍然有21  nt  的  RNA  片段產(chǎn)生，是因?yàn)殡m然  dcl1-9  蛋白在隨機(jī)位置上剪切  pri-miRNA163,，但是卻能準(zhǔn)確量出第一次切割的位置到下一次切割的位置為21  nt,。  

5  展望  

　　MicroRNA  作為一種新近發(fā)現(xiàn)的小分子調(diào)控  RNA，其在生物體內(nèi)起著十分重要的作用,。關(guān)于  miRNA  各方面研究也在如火如荼地進(jìn)行著,。在  miRNA  的生物合成過程中，還有很多疑問沒有被解決,，例如,，miRNA  基因在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，雖然有報道在線蟲  miRNA  基因的上游  ～200  nt  的位置找到了一段保守序列  (CTCCGCCC),，但是在其他生物的  miRNA  中卻沒有找到這段序列,。miRNA  作為一種調(diào)控因子，它本身的表達(dá)又由什么來決定呢,？還有,，動物當(dāng)中  miRNA  末端的決定是由  Drosha  在對初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行第一次切割的時候就決定了，而在植物中這一過程是由  DCL1  決定的,，鑒于  Drosha  切割的特異性,，因此成熟的動物  miRNA  可能要比植物中的  miRNA  更為保守，從序列上講更加精確，這是否與多數(shù)動物  miRNA  與靶  mRNA  不完全配對抑制  mRNA  的翻譯,，而植物的  miRNA  通常與靶  mRNA  幾乎為完美配對從而導(dǎo)致  mRNA  的降解有關(guān)呢,？這些問題都有待于進(jìn)一步地研究才能得到解決。對于  miRNA  成熟過程的研究,，不僅可以使生物體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)更加細(xì)化,，還可以通過對這一過程進(jìn)行人為的干預(yù)，從而進(jìn)一步研究在不同物種中  miRNA  的功能及其起源等問題,。  

        注：

        （1）參考文獻(xiàn)：略,；需者可與本站Email聯(lián)系，或到中國水稻研究所圖書館查閱,；

        （2）文章來源：生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,，2005年  第32卷  第8期；

        （3）作者單位：中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所  等,。