MicroRNA(miRNA) 是近幾年在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類具有調(diào)控功能的非編碼 RNA,，它們主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控,。miRNA 的調(diào)控功能是十分重要的，近來(lái)發(fā)現(xiàn)它們?cè)诠壍募?xì)胞增殖,、死亡及脂肪代謝,，線蟲極性的形成，哺乳動(dòng)物的造血干細(xì)胞的分化等過程中起了重要的調(diào)控作用,。在植物中,，miRNA 還參與了葉子與花的發(fā)育過程。
動(dòng)物(尤其是人) miRNA 的生物合成過程已經(jīng)初步得到了詮釋,。首先,，miRNA 基因的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 (pri-miRNA) 在細(xì)胞核中被 RNase Ⅲ Drosha 切割成為前體 miRNA (pre-miRNA)。在最初的剪切后,，pre-miRNA 在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 exportin-5 的作用下由核內(nèi)轉(zhuǎn)到胞質(zhì)中,，然后由另一種 RNase Ⅲ Dicer 進(jìn)一步切割產(chǎn)生成熟的 miRNA。這些成熟的 miRNA 與其他蛋白質(zhì)一起組成 RISC (RNA-induced silencing complex) 復(fù)合體,，從而引起靶 mRNA 的降解或者翻譯抑制,。這一過程如圖1a所示。
1 miRNA 基因的轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物的剪接
大多數(shù) miRNA 基因與蛋白質(zhì)基因距離比較遠(yuǎn),，它們可能有自己的啟動(dòng)子可以進(jìn)行獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄,。但是也有相當(dāng)多的 miRNA 基因，人有1/4的 miRNA 基因是位于蛋白質(zhì)基因的內(nèi)含子當(dāng)中的,，通常 miRNA 基因與內(nèi)含子的轉(zhuǎn)錄方向是一致的,，這就說(shuō)明這些基因大多是與寄主蛋白基因共轉(zhuǎn)錄的，然后再?gòu)倪@些蛋白質(zhì)基因的內(nèi)含子中剪切出來(lái),。并且同一類 miRNA 基因在不同生物體中的寄主基因往往是保守的同一類蛋白質(zhì)基因,。正是由于 miRNA 與其寄主蛋白基因是共表達(dá)的，而使它們的聯(lián)系在進(jìn)化過程中也保守地保存下來(lái),。還有一些 miRNA 基因是成簇分布在染色體上,，它們通過一個(gè)共同的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄成為多順反子,。雖然這種形式在線蟲和人的 miRNA 基因中比較少見，但是果蠅的 miRNA 基因中一半是成簇的,。而且這些成簇的 miRNA 基因經(jīng)常是彼此相關(guān)的,。例如人的 mir-15a-mir-16 基因簇是位于13號(hào)染色體上的一個(gè)抑癌基因中，而這一位置在 B 細(xì)胞與 T 細(xì)胞白血病中均產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)的畸變,。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),，這兩個(gè) miRNA 確實(shí)與白血病的發(fā)生有關(guān)。
目前,，我們對(duì) miRNA 基因如何轉(zhuǎn)錄成為 pri-miRNA 還知之甚少,。研究發(fā)現(xiàn) RNA 聚合酶Ⅱ和Ⅲ均可以參與 miRNA 的轉(zhuǎn)錄。位于蛋白質(zhì)基因內(nèi)含子中的 miRNA 基因毫無(wú)疑問是由聚合酶Ⅱ進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的,。雖然大多數(shù)其他 miRNA 基因缺少加多聚腺苷酸尾的信號(hào),，還有一些間接的證據(jù)證明它們也有可能是聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：a．有些 pri-miRNAs 相當(dāng)長(zhǎng)，有時(shí)超過1 kb,，這比聚合酶Ⅲ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長(zhǎng)很多,。b．大多數(shù) pri-miRNAs 最后一個(gè)堿基為尿嘧啶，而這通常被認(rèn)為是聚合酶Ⅲ提前中止的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,。c．許多 miRNA 基因的表達(dá)在發(fā)育過程中是變化的,，這種表達(dá)變化通常在聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中比較常見。d．將某些 miRNA 基因的5'區(qū)域與報(bào)告基因的開放閱讀框相融合,，可以使報(bào)告基因得到表達(dá),，說(shuō)明這種 miRNA 基因是可以通過聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的。e．對(duì)于線蟲 let-7 miRNA 的研究表明,，let-7 pri-miRNA 有多聚腺苷酸尾,，確實(shí)是由聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。另外,，聚合酶Ⅲ也可以參與 miRNA 基因的轉(zhuǎn)錄,。例如，給 miRNA 基因加上聚合酶Ⅲ的啟動(dòng)子由聚合酶Ⅲ進(jìn)行表達(dá),，在體內(nèi)不僅可以有效地表達(dá)出這些 miRNA,，同時(shí)它們還可以行使其功能，這就說(shuō)明,，miRNA 的加工及其功能的行使與由何種聚合酶參與其基因的轉(zhuǎn)錄并沒有必然的聯(lián)系,。
對(duì)于 pri-miRNA 轉(zhuǎn)錄后加工的研究十分有限，只有對(duì)線蟲 let-7 miRNA 的研究比較完整,。Bracht 等發(fā)現(xiàn)了兩種長(zhǎng)的5'端加帽,，3'端加多聚腺苷酸尾的 let-7 pri-miRNA，是由聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的。這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在5'端有剪接引導(dǎo)序列,，它們可以作為反式剪接的底物,。實(shí)驗(yàn)證明，初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的反式剪接對(duì)于成熟的 let-7 RNA 的產(chǎn)生十分重要,，其序列和結(jié)構(gòu)的變化對(duì)于接下來(lái)的剪切反應(yīng)影響很大,，含有成熟的 let-7 RNA 發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體，其附近序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)在剪接前后發(fā)生了變化,，這一變化延長(zhǎng)了 let-7 RNA 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體末端的莖區(qū),，這一結(jié)構(gòu)也是 RNase Ⅲ Drosha 的底物類似物。同時(shí),，初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的反式剪接也去掉了對(duì)下一步剪切造成空間阻抑的序列,。因此，對(duì) miRNA 初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪接可以顯著改變發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體周圍的序列及結(jié)構(gòu),，從而有利于對(duì) miRNA 前體的進(jìn)一步剪切。
Pri-miRNA 的第一步剪切是由核糖核酸酶Ⅲ Drosha 完成,。其產(chǎn)物是～70 nt 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體 (pre-miRNA),。這一切割反應(yīng)不僅切出了成熟的 miRNA 的3'末端，而且使3'末端有2 nt 的突出,，這正是由核糖核酸酶Ⅲ進(jìn)行切割的特征,。而且，切割反應(yīng)并不是發(fā)生在發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體的基部,，而是基部上的幾個(gè)堿基處,。Drosha 進(jìn)行切割的特異性序列還沒有找到，但是前體基部的螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)于切割是十分重要的,，因?yàn)樵谇绑w的莖區(qū)插入和刪除序列將導(dǎo)致切割位點(diǎn)的改變,。最新的研究發(fā)現(xiàn)，參與這一切割過程的是一個(gè)多蛋白質(zhì)復(fù)合體,，Drosha 是其中的重要成分,，起到切割的作用。在這一復(fù)合體中,，還存在一種雙鏈 RNA 結(jié)合蛋白 Pasha (partner of Drosha),。在果蠅細(xì)胞和線蟲中抑制 Pasha 的表達(dá)，干擾了 pri-miRNA 的剪切,，使細(xì)胞內(nèi) pri-miRNA 的積累增多,，成熟 miRNA 的量減少。Pasha 在復(fù)合體中的具體功能還不清楚,，但是它可能參與識(shí)別 miRNA 的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,，將它們集中到復(fù)合體中，有利于其被 Drosha 切割。另外,，Pasha 可能對(duì) pri-miRNA 在復(fù)合體中的定向有幫助,，從而有利于 Drosha 在特定位點(diǎn)的切割。
2 miRNA 前體的轉(zhuǎn)運(yùn)出核
由于動(dòng)物的 pre-miRNA 需要胞質(zhì)中的 Dicer 酶進(jìn)行進(jìn)一步加工,，轉(zhuǎn)運(yùn)出核就成為 miRNA 成熟過程中必需的一步,。這一過程是通過依賴 RanGTP/exportin 5 的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制來(lái)完成的。在細(xì)胞核中,，RanGTP 的濃度較高,，Exportin 5 (Exp5) 就可以促進(jìn) pre-miRNA 從 Drosha 復(fù)合體中釋放，并且與之結(jié)合,，將其帶到核外,。由于胞質(zhì)中 RanGTP 的濃度較低，Exp5 就釋放 pre-miRNA,，使之與 Dicer 結(jié)合進(jìn)行下一步的切割,。在運(yùn)輸過程中，miRNA 前體的3'突出將有利于其進(jìn)入運(yùn)出核的途徑,。
3 Pre-miRNA 的剪切與 miRNA 的成熟
在動(dòng)物細(xì)胞核中,，Drosha 的切割產(chǎn)生了成熟 miRNA 的一端(3'端)。另一端的切割成熟是由胞質(zhì)中另一類核糖核酸酶Ⅲ Dicer 切割產(chǎn)生的,。Dicer 首先是在研究小干擾 RNA(siRNA) 引起的基因沉默中被發(fā)現(xiàn)的,，后來(lái)發(fā)現(xiàn)它在 miRNA 的成熟過程中也起著重要的作用。Dicer 參與 miRNA 的成熟過程與 RNA 干擾中產(chǎn)生雙鏈 RNA 的過程很相似：首先 Dicer 識(shí)別 pre-miRNA 的雙鏈部分,，其與莖環(huán)基部的5'端被磷酸化,、3'端有突出的結(jié)構(gòu)有很高的親和力。然后,，莖環(huán)基部的兩圈螺旋解開,， Dicer 對(duì)兩條鏈都進(jìn)行切割，將前體的其余部分切掉,，生成5'端磷酸化,、3'端有2 nt 突出的類似于 siRNA 的不完全配對(duì)的雙鏈。這條 RNA 雙鏈?zhǔn)怯沙墒?nbsp; miRNA 與 miRNA* 組成的(見圖1a中的第4步),。miRNA* 是 pre-miRNA 上的一段 RNA,，其位置恰好與成熟的 miRNA 相對(duì)。雖然 Dicer 在對(duì) pre-miRNA 的加工過程中能夠產(chǎn)生 RNA 雙鏈中間體,，但是這種中間體通常壽命比較短暫而不易被探測(cè),。不過，如果大量的前體均可產(chǎn)生并只產(chǎn)生一種 miRNA,，則其雙鏈中的星號(hào)鏈也可以成為成熟的 miRNA,。
就現(xiàn)有的動(dòng)物 miRNA 成熟的模型來(lái)看,，最初由 Drosha 介導(dǎo)的切割特異性決定了 miRNA 前體中 Dicer 的切割位點(diǎn)，從而決定了成熟 miRNA 的兩端,。由 Drosha 而不是 Dicer 決定這一特異性是由于研究表明 Drosha 對(duì)非特異性雙鏈 RNA 的切割效率很差,，而 Dicer 可以沒有序列依賴性地切割任何 RNA 雙鏈。并且 Drosha 的切割還依賴于 pri-miRNA 莖環(huán)基部的二級(jí)結(jié)構(gòu),，以及莖環(huán)基部外側(cè)125 nt 范圍內(nèi)的序列,。
4 植物 miRNA 的成熟過程
植物 miRNA 的成熟過程與動(dòng)物有所不同，因?yàn)橹参镏袥]有 Drosha 的同源類似物,。在植物中通常很難檢測(cè)到 pre-miRNA,，即使在 DCL1 突變的植物中也很少檢測(cè)到。DCL1 是植物 miRNA 成熟過程中類似于 Dicer 的蛋白質(zhì),，它是位于核內(nèi)的,。這就說(shuō)明在植物中可能有其他酶(很有可能是 DCL1 )行使了 Drosha 的功能，對(duì) miRNA 的轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物進(jìn)行第一次切割,，并且決定了成熟的 miRNA 的序列,。(如圖1b中的第2步)。在 miRNA 離開細(xì)胞核之前,，DCL1 (或其他酶)又進(jìn)行了第二次切割,，相當(dāng)于動(dòng)物細(xì)胞中 Dicer 對(duì) pre-miRNA 的切割(如圖1b中的第3步)。然后,，可能是由 HASTY (Exportin-5 在植物中的同源類似物)負(fù)責(zé)將 miRNA：miRNA* 雙鏈轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核(圖1b中的第4步),。由于經(jīng)核內(nèi)連續(xù)兩次切割,，在植物中才難以檢測(cè)到 pre-miRNA 樣的 RNA,。
擬南芥(Arabidopsis thaliana) 作為植物中的一種模式生物，對(duì)其 miRNA 的研究是最多的,。最近,，對(duì)擬南芥 miR163 的研究進(jìn)一步揭示了植物 miRNA 的成熟過程。擬南芥的基因組編碼4種 Dicer 樣的酶 (DCL1-DCL4),。其中 DCL1 是與 miRNA 的積累相關(guān)的,，DCL2 和 DCL3 分別參與了由病毒引起的小干擾 RNA(siRNA) 和內(nèi)源性 siRNA (例如反轉(zhuǎn)座子 siRNA) 的合成。擬南芥 miR163 是單獨(dú)轉(zhuǎn)錄的,，由 RNA 聚合酶Ⅱ催化合成,，其轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物 pri-miR163 需要經(jīng)過核糖核酸酶Ⅲ樣的酶切割三次才能成為成熟的 miRNA。第一步是在 pri-miR163 的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的根部進(jìn)行切割,，得到長(zhǎng) miR163 前體 (pre-miR163),，第二步是對(duì)長(zhǎng) pre-miR163 中成熟的 miRNA 的3'根部進(jìn)行剪切，得到短的 pre-miR163,，最后是由短的前體切割出成熟的5'端成為成熟的 miRNA (圖2),。有趣的是,，在整個(gè)剪切的過程中，四種小分子都可以被釋放出來(lái),。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明,，擬南芥的 DCL1 至少可以對(duì)第一及第二步切割反應(yīng)進(jìn)行催化，即對(duì) pri- 和 pre-miRNA 都可以切割,。另外,，第三步的切割反應(yīng)可能也是 DCL1 催化的。所以擬南芥的 DCL1 蛋白參與了 miRNA 成熟的全過程,。由于擬南芥的 DCL1 蛋白有兩個(gè)類核定位信號(hào),，因此植物的 miRNA 的成熟是在細(xì)胞核中完成的。同時(shí),，研究表明,，植物 DCL1 蛋白的雙鏈 RNA 結(jié)合區(qū)在決定第一次和第二次的切割位點(diǎn)時(shí)是十分重要的。在 dcl1-9_dcl1-9 的突變體當(dāng)中仍然有21 nt 的 RNA 片段產(chǎn)生,，是因?yàn)殡m然 dcl1-9 蛋白在隨機(jī)位置上剪切 pri-miRNA163,，但是卻能準(zhǔn)確量出第一次切割的位置到下一次切割的位置為21 nt。
5 展望
MicroRNA 作為一種新近發(fā)現(xiàn)的小分子調(diào)控 RNA,，其在生物體內(nèi)起著十分重要的作用,。關(guān)于 miRNA 各方面研究也在如火如荼地進(jìn)行著。在 miRNA 的生物合成過程中,，還有很多疑問沒有被解決,，例如，miRNA 基因在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,，雖然有報(bào)道在線蟲 miRNA 基因的上游 ～200 nt 的位置找到了一段保守序列 (CTCCGCCC),，但是在其他生物的 miRNA 中卻沒有找到這段序列。miRNA 作為一種調(diào)控因子,，它本身的表達(dá)又由什么來(lái)決定呢,？還有，動(dòng)物當(dāng)中 miRNA 末端的決定是由 Drosha 在對(duì)初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行第一次切割的時(shí)候就決定了,，而在植物中這一過程是由 DCL1 決定的,，鑒于 Drosha 切割的特異性，因此成熟的動(dòng)物 miRNA 可能要比植物中的 miRNA 更為保守,，從序列上講更加精確,，這是否與多數(shù)動(dòng)物 miRNA 與靶 mRNA 不完全配對(duì)抑制 mRNA 的翻譯，而植物的 miRNA 通常與靶 mRNA 幾乎為完美配對(duì)從而導(dǎo)致 mRNA 的降解有關(guān)呢,？這些問題都有待于進(jìn)一步地研究才能得到解決,。對(duì)于 miRNA 成熟過程的研究，不僅可以使生物體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)更加細(xì)化,，還可以通過對(duì)這一過程進(jìn)行人為的干預(yù),，從而進(jìn)一步研究在不同物種中 miRNA 的功能及其起源等問題,。
注：
（1）參考文獻(xiàn)：略；需者可與本站Email聯(lián)系,，或到中國(guó)水稻研究所圖書館查閱,；
（2）文章來(lái)源：生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2005年 第32卷 第8期,；
（3）作者單位：中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所 等,。
