MicroRNA(miRNA)  是近幾年在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類具有調(diào)控功能的非編碼  RNA,，它們主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控,。miRNA  的調(diào)控功能是十分重要的，近來發(fā)現(xiàn)它們在果蠅的細胞增殖、死亡及脂肪代謝,，線蟲極性的形成,，哺乳動物的造血干細胞的分化等過程中起了重要的調(diào)控作用。在植物中,，miRNA  還參與了葉子與花的發(fā)育過程,。  

　　動物(尤其是人)  miRNA  的生物合成過程已經(jīng)初步得到了詮釋。首先,，miRNA  基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物  (pri-miRNA)  在細胞核中被  RNase  Ⅲ  Drosha  切割成為前體  miRNA  (pre-miRNA),。在最初的剪切后,，pre-miRNA  在轉(zhuǎn)運蛋白  exportin-5  的作用下由核內(nèi)轉(zhuǎn)到胞質(zhì)中,，然后由另一種  RNase  Ⅲ  Dicer  進一步切割產(chǎn)生成熟的  miRNA。這些成熟的  miRNA  與其他蛋白質(zhì)一起組成  RISC  (RNA-induced  silencing  complex)  復合體,，從而引起靶  mRNA  的降解或者翻譯抑制,。這一過程如圖1a所示。  

1  miRNA  基因的轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物的剪接  

　　大多數(shù)  miRNA  基因與蛋白質(zhì)基因距離比較遠,，它們可能有自己的啟動子可以進行獨立的轉(zhuǎn)錄,。但是也有相當多的  miRNA  基因，人有1/4的  miRNA  基因是位于蛋白質(zhì)基因的內(nèi)含子當中的,，通常  miRNA  基因與內(nèi)含子的轉(zhuǎn)錄方向是一致的,，這就說明這些基因大多是與寄主蛋白基因共轉(zhuǎn)錄的，然后再從這些蛋白質(zhì)基因的內(nèi)含子中剪切出來,。并且同一類  miRNA  基因在不同生物體中的寄主基因往往是保守的同一類蛋白質(zhì)基因,。正是由于  miRNA  與其寄主蛋白基因是共表達的，而使它們的聯(lián)系在進化過程中也保守地保存下來,。還有一些  miRNA  基因是成簇分布在染色體上,，它們通過一個共同的啟動子轉(zhuǎn)錄成為多順反子。雖然這種形式在線蟲和人的  miRNA  基因中比較少見,，但是果蠅的  miRNA  基因中一半是成簇的,。而且這些成簇的  miRNA  基因經(jīng)常是彼此相關(guān)的。例如人的  mir-15a-mir-16  基因簇是位于13號染色體上的一個抑癌基因中,，而這一位置在  B  細胞與  T  細胞白血病中均產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)的畸變,。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，這兩個  miRNA  確實與白血病的發(fā)生有關(guān),。  

　　目前,，我們對  miRNA  基因如何轉(zhuǎn)錄成為  pri-miRNA  還知之甚少。研究發(fā)現(xiàn)  RNA  聚合酶Ⅱ和Ⅲ均可以參與  miRNA  的轉(zhuǎn)錄,。位于蛋白質(zhì)基因內(nèi)含子中的  miRNA  基因毫無疑問是由聚合酶Ⅱ進行轉(zhuǎn)錄的,。雖然大多數(shù)其他  miRNA  基因缺少加多聚腺苷酸尾的信號，還有一些間接的證據(jù)證明它們也有可能是聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：a．有些  pri-miRNAs  相當長，有時超過1  kb,，這比聚合酶Ⅲ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長很多,。b．大多數(shù)  pri-miRNAs  最后一個堿基為尿嘧啶，而這通常被認為是聚合酶Ⅲ提前中止的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,。c．許多  miRNA  基因的表達在發(fā)育過程中是變化的,，這種表達變化通常在聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中比較常見。d．將某些  miRNA  基因的5'區(qū)域與報告基因的開放閱讀框相融合,，可以使報告基因得到表達,，說明這種  miRNA  基因是可以通過聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的。e．對于線蟲  let-7  miRNA  的研究表明,，let-7  pri-miRNA  有多聚腺苷酸尾,，確實是由聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。另外,，聚合酶Ⅲ也可以參與  miRNA  基因的轉(zhuǎn)錄,。例如，給  miRNA  基因加上聚合酶Ⅲ的啟動子由聚合酶Ⅲ進行表達,，在體內(nèi)不僅可以有效地表達出這些  miRNA,，同時它們還可以行使其功能，這就說明,，miRNA  的加工及其功能的行使與由何種聚合酶參與其基因的轉(zhuǎn)錄并沒有必然的聯(lián)系,。  

　　對于  pri-miRNA  轉(zhuǎn)錄后加工的研究十分有限，只有對線蟲  let-7  miRNA  的研究比較完整,。Bracht  等發(fā)現(xiàn)了兩種長的5'端加帽,，3'端加多聚腺苷酸尾的  let-7  pri-miRNA，是由聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的,。這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在5'端有剪接引導序列,，它們可以作為反式剪接的底物。實驗證明,，初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的反式剪接對于成熟的  let-7  RNA  的產(chǎn)生十分重要,，其序列和結(jié)構(gòu)的變化對于接下來的剪切反應(yīng)影響很大，含有成熟的  let-7  RNA  發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體,，其附近序列的二級結(jié)構(gòu)在剪接前后發(fā)生了變化,，這一變化延長了  let-7  RNA  的發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體末端的莖區(qū)，這一結(jié)構(gòu)也是  RNase  Ⅲ  Drosha  的底物類似物,。同時,，初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的反式剪接也去掉了對下一步剪切造成空間阻抑的序列。因此,，對  miRNA  初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪接可以顯著改變發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體周圍的序列及結(jié)構(gòu),，從而有利于對  miRNA  前體的進一步剪切。  

　　Pri-miRNA  的第一步剪切是由核糖核酸酶Ⅲ  Drosha  完成。其產(chǎn)物是～70  nt  的發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體  (pre-miRNA),。這一切割反應(yīng)不僅切出了成熟的  miRNA  的3'末端,，而且使3'末端有2  nt  的突出，這正是由核糖核酸酶Ⅲ進行切割的特征,。而且,，切割反應(yīng)并不是發(fā)生在發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體的基部，而是基部上的幾個堿基處,。Drosha  進行切割的特異性序列還沒有找到,，但是前體基部的螺旋結(jié)構(gòu)對于切割是十分重要的，因為在前體的莖區(qū)插入和刪除序列將導致切割位點的改變,。最新的研究發(fā)現(xiàn),，參與這一切割過程的是一個多蛋白質(zhì)復合體，Drosha  是其中的重要成分,，起到切割的作用,。在這一復合體中,，還存在一種雙鏈  RNA  結(jié)合蛋白  Pasha  (partner  of  Drosha),。在果蠅細胞和線蟲中抑制  Pasha  的表達，干擾了  pri-miRNA  的剪切,，使細胞內(nèi)  pri-miRNA  的積累增多,，成熟  miRNA  的量減少。Pasha  在復合體中的具體功能還不清楚,，但是它可能參與識別  miRNA  的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,，將它們集中到復合體中，有利于其被  Drosha  切割,。另外,，Pasha  可能對  pri-miRNA  在復合體中的定向有幫助，從而有利于  Drosha  在特定位點的切割,。  

2  miRNA  前體的轉(zhuǎn)運出核  

　　由于動物的  pre-miRNA  需要胞質(zhì)中的  Dicer  酶進行進一步加工,，轉(zhuǎn)運出核就成為  miRNA  成熟過程中必需的一步。這一過程是通過依賴  RanGTP/exportin  5  的轉(zhuǎn)運機制來完成的,。在細胞核中,，RanGTP  的濃度較高，Exportin  5  (Exp5)  就可以促進  pre-miRNA  從  Drosha  復合體中釋放,，并且與之結(jié)合,，將其帶到核外。由于胞質(zhì)中  RanGTP  的濃度較低,，Exp5  就釋放  pre-miRNA,，使之與  Dicer  結(jié)合進行下一步的切割。在運輸過程中，miRNA  前體的3'突出將有利于其進入運出核的途徑,。  

3  Pre-miRNA  的剪切與  miRNA  的成熟  

　　在動物細胞核中,，Drosha  的切割產(chǎn)生了成熟  miRNA  的一端(3'端)。另一端的切割成熟是由胞質(zhì)中另一類核糖核酸酶Ⅲ  Dicer  切割產(chǎn)生的,。Dicer  首先是在研究小干擾  RNA(siRNA)  引起的基因沉默中被發(fā)現(xiàn)的,，后來發(fā)現(xiàn)它在  miRNA  的成熟過程中也起著重要的作用。Dicer  參與  miRNA  的成熟過程與  RNA  干擾中產(chǎn)生雙鏈  RNA  的過程很相似：首先  Dicer  識別  pre-miRNA  的雙鏈部分,，其與莖環(huán)基部的5'端被磷酸化,、3'端有突出的結(jié)構(gòu)有很高的親和力。然后,，莖環(huán)基部的兩圈螺旋解開,，  Dicer  對兩條鏈都進行切割，將前體的其余部分切掉,，生成5'端磷酸化,、3'端有2  nt  突出的類似于  siRNA  的不完全配對的雙鏈。這條  RNA  雙鏈是由成熟  miRNA  與  miRNA*  組成的(見圖1a中的第4步),。miRNA*  是  pre-miRNA  上的一段  RNA,，其位置恰好與成熟的  miRNA  相對。雖然  Dicer  在對  pre-miRNA  的加工過程中能夠產(chǎn)生  RNA  雙鏈中間體,，但是這種中間體通常壽命比較短暫而不易被探測,。不過，如果大量的前體均可產(chǎn)生并只產(chǎn)生一種  miRNA,，則其雙鏈中的星號鏈也可以成為成熟的  miRNA,。  

　　就現(xiàn)有的動物  miRNA  成熟的模型來看，最初由  Drosha  介導的切割特異性決定了  miRNA  前體中  Dicer  的切割位點,，從而決定了成熟  miRNA  的兩端,。由  Drosha  而不是  Dicer  決定這一特異性是由于研究表明  Drosha  對非特異性雙鏈  RNA  的切割效率很差，而  Dicer  可以沒有序列依賴性地切割任何  RNA  雙鏈,。并且  Drosha  的切割還依賴于  pri-miRNA  莖環(huán)基部的二級結(jié)構(gòu),，以及莖環(huán)基部外側(cè)125  nt  范圍內(nèi)的序列。  

4  植物  miRNA  的成熟過程  

　　植物  miRNA  的成熟過程與動物有所不同,，因為植物中沒有  Drosha  的同源類似物,。在植物中通常很難檢測到  pre-miRNA，即使在  DCL1  突變的植物中也很少檢測到,。DCL1  是植物  miRNA  成熟過程中類似于  Dicer  的蛋白質(zhì),，它是位于核內(nèi)的。這就說明在植物中可能有其他酶(很有可能是  DCL1  )行使了  Drosha  的功能,，對  miRNA  的轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物進行第一次切割,，并且決定了成熟的  miRNA  的序列,。(如圖1b中的第2步)。在  miRNA  離開細胞核之前,，DCL1  (或其他酶)又進行了第二次切割,，相當于動物細胞中  Dicer  對  pre-miRNA  的切割(如圖1b中的第3步)。然后,，可能是由  HASTY  (Exportin-5  在植物中的同源類似物)負責將  miRNA：miRNA*  雙鏈轉(zhuǎn)運出細胞核(圖1b中的第4步),。由于經(jīng)核內(nèi)連續(xù)兩次切割，在植物中才難以檢測到  pre-miRNA  樣的  RNA,。  

　　擬南芥(Arabidopsis  thaliana)  作為植物中的一種模式生物,，對其  miRNA  的研究是最多的。最近,，對擬南芥  miR163  的研究進一步揭示了植物  miRNA  的成熟過程,。擬南芥的基因組編碼4種  Dicer  樣的酶  (DCL1-DCL4)。其中  DCL1  是與  miRNA  的積累相關(guān)的,，DCL2  和  DCL3  分別參與了由病毒引起的小干擾  RNA(siRNA)  和內(nèi)源性  siRNA  (例如反轉(zhuǎn)座子  siRNA)  的合成,。擬南芥  miR163  是單獨轉(zhuǎn)錄的，由  RNA  聚合酶Ⅱ催化合成,，其轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物  pri-miR163  需要經(jīng)過核糖核酸酶Ⅲ樣的酶切割三次才能成為成熟的  miRNA,。第一步是在  pri-miR163  的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的根部進行切割，得到長  miR163  前體  (pre-miR163),，第二步是對長  pre-miR163  中成熟的  miRNA  的3'根部進行剪切,，得到短的  pre-miR163，最后是由短的前體切割出成熟的5'端成為成熟的  miRNA  (圖2),。有趣的是，在整個剪切的過程中,，四種小分子都可以被釋放出來,。進一步實驗證明，擬南芥的  DCL1  至少可以對第一及第二步切割反應(yīng)進行催化,，即對  pri-  和  pre-miRNA  都可以切割,。另外，第三步的切割反應(yīng)可能也是  DCL1  催化的,。所以擬南芥的  DCL1  蛋白參與了  miRNA  成熟的全過程,。由于擬南芥的  DCL1  蛋白有兩個類核定位信號，因此植物的  miRNA  的成熟是在細胞核中完成的,。同時,，研究表明，植物  DCL1  蛋白的雙鏈  RNA  結(jié)合區(qū)在決定第一次和第二次的切割位點時是十分重要的,。在  dcl1-9_dcl1-9  的突變體當中仍然有21  nt  的  RNA  片段產(chǎn)生,，是因為雖然  dcl1-9  蛋白在隨機位置上剪切  pri-miRNA163,，但是卻能準確量出第一次切割的位置到下一次切割的位置為21  nt。  

5  展望  

　　MicroRNA  作為一種新近發(fā)現(xiàn)的小分子調(diào)控  RNA,，其在生物體內(nèi)起著十分重要的作用,。關(guān)于  miRNA  各方面研究也在如火如荼地進行著。在  miRNA  的生物合成過程中,，還有很多疑問沒有被解決,，例如，miRNA  基因在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,，雖然有報道在線蟲  miRNA  基因的上游  ～200  nt  的位置找到了一段保守序列  (CTCCGCCC),，但是在其他生物的  miRNA  中卻沒有找到這段序列。miRNA  作為一種調(diào)控因子,，它本身的表達又由什么來決定呢,？還有，動物當中  miRNA  末端的決定是由  Drosha  在對初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行第一次切割的時候就決定了,，而在植物中這一過程是由  DCL1  決定的,，鑒于  Drosha  切割的特異性，因此成熟的動物  miRNA  可能要比植物中的  miRNA  更為保守,，從序列上講更加精確,，這是否與多數(shù)動物  miRNA  與靶  mRNA  不完全配對抑制  mRNA  的翻譯，而植物的  miRNA  通常與靶  mRNA  幾乎為完美配對從而導致  mRNA  的降解有關(guān)呢,？這些問題都有待于進一步地研究才能得到解決,。對于  miRNA  成熟過程的研究，不僅可以使生物體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)更加細化,，還可以通過對這一過程進行人為的干預(yù),，從而進一步研究在不同物種中  miRNA  的功能及其起源等問題。  

        注：

        （1）參考文獻：略,；需者可與本站Email聯(lián)系,，或到中國水稻研究所圖書館查閱；

        （2）文章來源：生物化學與生物物理進展,，2005年  第32卷  第8期,；

        （3）作者單位：中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所  等。