遺傳性雄性不育在植物界中是一種常見現(xiàn)象,，據(jù)統(tǒng)計已經(jīng)在43科,，162屬，320個種和297個種間雜種中發(fā)現(xiàn)了雄性不育現(xiàn)象(Kaul 1988),，并且這個數(shù)目還在不斷增加,。由于雄性不育是雜種優(yōu)勢利用的基礎，幾十年來對雄性不育機理的探索一直是一個非?；钴S的研究領域,，特別是近年來對雄性不育的分子生物學研究更是成果豐碩，不斷有關于雄性不育分子機制的文章總結這方面的研究成果并提出了若干相應理論和假設( Araya 等1998,；Hanson 和 Bentolila 2004,；曹雙河等2005)，豐富了雜種優(yōu)勢利用的理論基礎,，提高了人們對雄性不育機理的認識,。雄性不育花藥結構的細胞生物學研究主要探索花粉敗育的過程，是將雄性不育的分子水平研究和個體調(diào)控育性變化的研究聯(lián)系起來的中間環(huán)節(jié),，對全面認識植物雄性不育機理有很大幫助,。對花藥細胞結構與功能的分析以及花粉細胞中重要的細胞生物學事態(tài)的分析是全面認識不育基因調(diào)控花粉敗育過程的基礎。我國的雄性不育研究和利用在國際上處于領先地位,。近年來應用現(xiàn)代細胞生物學技術對多種雄性不育農(nóng)作物的花藥敗育過程做了研究,，取得了一些新的結果。本文著重從細胞水平介紹有關作物花藥敗育過程的最新研究進展,，包括絨氈層發(fā)育,、 ATP 酶、Ca2+濃度,、細胞骨架和細胞程序性死亡等諸多因素與雄性不育的關系,。
1 絨氈層發(fā)育
絨氈層是花藥壁的最內(nèi)層體細胞,，直接與花藥藥室中的花粉母細胞及以后發(fā)育中的花粉接觸，是將孢子體組織的物質輸往雄配子體的最后中轉站,，對花粉的正常發(fā)育具有十分重要的作用(胡適宜1984,；Pacini 1997)。正因為絨氈層細胞與發(fā)育的小孢子或花粉之間存在著一種直接接觸的“生化對話”關系,，當這種正常的交流出現(xiàn)紊亂時,，就會導致雄性不育。許多作者都認為雄性不育的發(fā)生是與絨氈層正常的發(fā)育途徑受干擾有關( Aarts 等1997,；Jin 等1997,；Taylor 等1998)。在光敏核不育水稻中,，絨氈層是在原位解體的,。可育花藥的絨氈層細胞在小孢子發(fā)育晚期開始退化,，到二胞花粉時期己基本消失,。在絨氈層退化過程中，小孢子萌發(fā)孔都面向絨氈層,，常?？煽吹秸龑χ劝l(fā)孔的絨氈層細胞區(qū)域首先變薄，而在兩個花粉粒之間的區(qū)域仍保持較厚的狀態(tài),。從這種結構特征推斷絨氈層細胞的解體是由于具有大液泡的晚期小孢子通過萌發(fā)孔的吸收而造成的,。在不育花藥中，花粉的敗育發(fā)生在小孢子發(fā)育時期,，絨氈層細胞不但沒有退化,，而且一直可保留到花藥成熟的開花期。這也從另一方面證實了在花粉敗育后,，失去花粉吸收的外力作用,，絨氈層細胞可繼續(xù)存活下去，表明花粉的發(fā)育前提之一是絨氈層細胞的適時退化(田惠橋等1993),。以前的許多研究者報告過絨氈層發(fā)育異常會造成花粉的敗育,。近年來仍不斷有類似的報告：Taylor 等(1998)在擬南芥的 ms7 雄性不育突變體中發(fā)現(xiàn)絨氈層提早降解影響了花粉發(fā)育，是導致花粉在單核靠邊期敗育的直接原因,。Fei 和 Sawhney 等(1999)在對擬南芥雄性不育突變體 ms32 超微結構的觀察中發(fā)現(xiàn)絨氈層細胞在減數(shù)分裂前期就形成了合成和分泌胼胝酶的粗糙內(nèi)質網(wǎng),，成垛疊狀(而相應野生型的內(nèi)質網(wǎng)則到了四分體時期才開始形成)，這樣就導致了包裹花粉母細胞和四分體的胼胝壁過早降解,，致使花粉敗育,。Chaubal 等(2000)對玉米兩個雄性不育突變體 ms23 和 ms32 小孢子發(fā)育過程的研究中發(fā)現(xiàn)本應形成絨氈層的細胞又分裂形成了兩層細胞 t1 和 t2，且二者都不能正常分化,，導致花粉母細胞在減數(shù)分裂前期 I 時就開始敗育,。Suzuki 等(2001)在對高溫脅迫下絨氈層細胞的超微結構觀察中看到高溫影響了絨氈層細胞的內(nèi)質網(wǎng)膜結構,，從而導致了絨氈層的提前降解并使花粉的敗育。Smith 等(2002)在對大豆細胞質雄性不育花藥的電鏡觀察中發(fā)現(xiàn)絨氈層細胞中線粒體內(nèi)膜首先發(fā)生了降解,，內(nèi)腔異常擴大,；接著內(nèi)質網(wǎng)呈現(xiàn)出了不規(guī)則的同心環(huán)結構，這些異常變化使絨氈層細胞降解,，最終影響了小孢子的發(fā)育,，使花粉敗育。Zhang 等(2002)在擬南芥雄性不育 apt1-3 的花藥中觀察到起源于絨氈層的營養(yǎng)物質減少,，推測絨氈層細胞生物合成活性的下降影響了小孢子發(fā)育,，導致花粉敗育。謝潮添等(2004)在白菜細胞核雄性不育系中發(fā)現(xiàn)：白菜花粉粒中的儲存物質是脂類物質,。但糖類物質是白菜運輸?shù)闹饕问?。在花藥發(fā)育的早期，體內(nèi)運輸?shù)交ㄋ幹械奶穷愇镔|先以淀粉粒的形式儲存在花藥的藥壁組織中,。當花粉發(fā)育到小孢子晚期時,，花藥絨氈層細胞將其他藥壁細胞中的糖類轉化成脂類供給發(fā)育的花粉。不育花藥的絨氈層細胞不將糖類物質轉化成脂類物質,。
用基因工程技術也證明了絨氈層細胞與小孢子發(fā)育的緊密關系：將在絨氈層細胞內(nèi)特異表達的啟動子與細胞毒素的 mRNA 酶基因融合( Mariani 等1990)或 β-1，3-葡聚糖酶基因融合( Worrall 等1992,；Tsuchiya 等1995)后,，轉入到正常植株中都導致了絨氈層的正常發(fā)育受到干擾，從而誘導了花藥敗育,。
2 ATP 酶
ATP 酶在生物體內(nèi)廣泛存在,，它催化 ATP 的水解，對各種組織器官的運動,、物質運輸,、信號傳導、細胞內(nèi)物質的合成與分解等代謝活動中能量的需求起重要作用,?；ǚ鄣臄∮梢杂啥喾N因素引起，能量缺乏是導致花粉敗育的一個原因,。光敏核不育水稻不育花藥的 ATP 含量從花粉發(fā)育早期就明顯低于可育花藥,，提示 ATP 含量的降低與花粉不育有關(鄧繼新等1990)?；ㄋ幖毎?nbsp; ATP 酶的多少反映了花藥中能量供應的狀況,。Sane 等(1997)分別從高粱不育系、保持系和恢復系花藥的線粒體膜上分離得到 F1-ATP 酶,，發(fā)現(xiàn)它們之間的動力學特征有明顯的不同,，不育花藥中的 ATP 酶動力要比保持系和恢復系中的低,。雖然對這種動力學特征的不同與花粉育性的關系還不清楚，但很可能不育系花藥中催化水解 ATP 的效率過低影響了花粉發(fā)育,。近年來在雄性不育花藥中的 ATP 酶定位研究也取得了一些結果,。姚雅琴和張改生(2000)對 K 型小麥雄性不育系及其保持系花藥發(fā)育中發(fā)現(xiàn)：兩種花藥的藥壁和藥隔細胞中 ATP 酶的活性變化幾乎沒有差別，表明不育系花藥體細胞組織中的營養(yǎng)運輸和供應系統(tǒng)發(fā)育正常,，花粉敗育與營養(yǎng)物質的供應無關,。但在不育系和保持系的花粉粒中，ATP 酶的分布則存在著差別：保持系花粉 ATP 酶活性隨著小孢子發(fā)育逐漸加強,，而不育系的則不增加,，由此認為是花粉中的 ATP 酶異常與其敗育有關。孟祥紅等(2000c)在光敏胞質不育小麥花藥發(fā)育過程中看到早期敗育的花粉中花粉壁內(nèi),、花粉表面,、質膜及胞質內(nèi)無 ATP 酶分布；絨氈層細胞提前降解,；其他三層藥壁細胞中很少有 ATP 酶分布,；藥隔維管束及薄壁細胞質膜上 ATP 酶也很少。因此他們認為體內(nèi)向花藥提供的物質及能量供應不足可能是造成早期花粉敗育的原因,。在水稻不育系“馬協(xié)”花藥藥隔中的 ATP 酶比可育花藥的少,，作者認為很可能是營養(yǎng)物質卸出存在障礙，導致了花粉的敗育(關和新等2000),?？捎筒挥ㄋ幵谒幈诤退幐趔w細胞組織中 ATP 酶分布的差異反映出體內(nèi)向花藥中運輸物質能力的強弱；而可育和不育花粉細胞質中的 ATP 酶分布差異則可能反映出花粉自身的生活力狀態(tài),。不同雄性不育植物中花藥體細胞組織和花粉細胞質中 ATP 酶的不同分布特征也反映出花藥不同部位的 ATP 酶代謝發(fā)生異常都有可能導致雄性不育發(fā)生,。水稻可育花藥在減數(shù)分裂之前的 ATP 酶很少。減數(shù)分裂后花藥中 ATP 增多,。在花粉內(nèi),、外壁的形成過程中都聚集了很多的 ATP 酶，但兩層壁中的 ATP 酶來源不同,。二胞花粉的營養(yǎng)細胞比生殖細胞含有更多的 ATP 酶,。兩個精細胞之間 ATP 酶也有數(shù)量上的差異(王雅英等2006)。ATP 酶分布的時,、空特征提示它在花藥發(fā)育過程中起重要的功能,，它的異常將導致花粉的敗育。
3 Ca2+ 濃度
鈣是植物生長發(fā)育過程中不可缺少的元素之一,，Ca2+作為植物的第二信使廣泛參與并調(diào)節(jié)著植物體內(nèi)的生理生化反應,，成為近年來植物生物學的研究熱點之一。鈣信使系統(tǒng)起作用的最初事態(tài)是細胞內(nèi)鈣離子濃度在時間和空間上的變化，通過與鈣調(diào)蛋白的結合直接激活了蛋白激酶的活性或間接地調(diào)控其它酶類蛋白的活性,，將外部刺激(如光,、激素、重力等)轉換成對植物細胞代謝活動的調(diào)控( BuSh 1995),。近年來對Ca2+在被子植物生殖過程中的作用也引起了人們的極大興趣,，如 Tirlapur 和 Willemse (1992)用熒光染料金霉素( chlorotetracycline，CTC )研究了芝麻掌( Gasteria verrucuosa )花藥發(fā)育中膜鈣的分布動態(tài),。Gorska-Brylass 等(1997/98)觀察到 Chlorophytum elatum 花粉營養(yǎng)細胞中的鈣離子濃度要遠低于生殖細胞中的，并由此推斷鈣離子在營養(yǎng)細胞和生殖細胞之間的差異對二者以后的發(fā)育可能起重要的調(diào)控作用,。Tian 等(1998)在光敏核不育水稻中觀察到：在可育花藥的小孢子發(fā)育后期,，鈣沉淀顆粒大量分布在絨氈層和藥室中,，特別是在花粉和烏氏體的表面,，但在小孢子細胞質中Ca2+顆粒很少,，這表明Ca2+可能參與了花粉壁的形成和引導物質流向藥室的過程,。在不育花藥的藥壁細胞中,，Ca2+顆粒大量分布在中層,，而在絨氈層細胞中很少。另外,，在敗育花粉的細胞質中積累了較多的Ca2+顆粒,。他們認為不育花藥中Ca2+的異常分布可能影響花粉的發(fā)育。孟祥紅等(2000a)在光敏胞質不育小麥花藥發(fā)育過程Ca2+分布的研究中也觀察到敗育花粉中大量積累Ca2+,，因此認為花粉敗育與Ca2+的異常分布密切相關。利容千等(2001)在水稻紅蓮-粵泰不育系與保持系花藥中Ca2+分布的研究中也觀察到敗育花粉細胞質中大量積累Ca2+,，而相應的保持系正?；ǚ奂毎|中則沒有。此外,，在不育系花藥的藥隔維管束鞘、導管和篩管細胞的內(nèi)壁,，胞質和液泡中分布有許多大小不等的Ca2+顆粒(而保持系正?；ㄋ幩幐艚M織中幾乎沒有Ca2+沉淀顆粒分布),，因此認為藥隔組織Ca2+異常分布現(xiàn)象可能影響了藥隔細胞正常功能的發(fā)揮,，從而影響藥壁細胞功能和花粉的發(fā)育,。最近,，在白菜細胞核雄性不育花藥的鈣分布研究中發(fā)現(xiàn)，可育花藥中的鈣參與了花粉液泡的形成與降解過程：小液泡是由內(nèi)質網(wǎng)膨大形成的,，將要形成液泡的內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)部聚集了較多的鈣顆粒,，以后在小液泡膜上特異性地附著許多鈣顆粒,。在二胞花粉中,，當大液泡分解成小液泡時,，小液泡膜上又特異性地附著許多鈣顆粒,。在不育花藥中,，盡管絨氈層細胞和藥室內(nèi)積累了許多鈣顆粒,，但小孢子中的鈣顆粒一直很少,，小孢子也不形成體積較大的液泡。最后,，處在高鈣,、可能也是高滲透勢藥室環(huán)境中的小孢子以細胞質收縮方式敗育(謝潮添等2005a),。
以上的研究結果表明在適當?shù)臅r間和空間，花藥中一定濃度的Ca2+對花藥和花粉的發(fā)育是必需的,。在花藥藥室中較高的Ca2+濃度可能在引導物質流向藥室中起作用,。但在高Ca2+濃度環(huán)境中，水稻和小麥的花粉細胞內(nèi)又必需保持一個較低Ca2+的狀態(tài)才能使花粉正常發(fā)育,。而在白菜中花粉內(nèi)過低的Ca2+也會導致花粉的敗育,。孟祥紅等(2000b)設想花粉內(nèi)部Ca2+狀態(tài)的維持可能通過花粉質膜或鈣庫包膜上存在的鈣離子通道控制Ca2+向細胞質內(nèi)流，而細胞質內(nèi)Ca2+的外流則主要由質膜或鈣庫細胞器膜上存在的鈣泵——Ca2+-ATP 酶來控制,，鈣泵的活性變化調(diào)節(jié)著胞內(nèi)Ca2+濃度的變化,，維持細胞內(nèi)的Ca2+穩(wěn)態(tài),，因此質膜上 Ca2+-ATP 酶活性的強弱就決定著花粉細胞質中Ca2+濃度,，調(diào)節(jié)花粉的育性,。他們在光周期對光敏胞質不育小麥花藥發(fā)育過程中觀察到，在短日照條件下可育花粉的外壁,、內(nèi)壁及質膜上 Ca2+-ATP 酶的分布量逐步增加,，至三核花粉時期,，花粉的內(nèi)壁,、質膜上分布有大量的 Ca2+-ATP 酶,。而在長日照條件下不育花粉中的 Ca2+-ATP 酶的分布量雖然略有增加，但在花粉開始敗育時,，花粉質膜上 Ca2+-ATP 酶的分布量比可育花粉少得多,。因此,，他們認為可育花粉質膜 Ca2+-ATP 酶分布的量大，活性高,，使花粉在藥室的高鈣環(huán)境中能有效地排出Ca2+,，保持花粉內(nèi)較低的Ca2+水平。在不育花粉中,，質膜 Ca2+-ATP 酶分布量少,，活性低，不能將細胞內(nèi)的Ca2+有效地排出,，造成Ca2+在花粉細胞質內(nèi)大量積累,，產(chǎn)生Ca2+中毒，導致細胞內(nèi)生理生化代謝紊亂,，最終導致花粉敗育(孟祥紅等2000b),。
4 細胞骨架
細胞骨架是真核生物普遍存在的一種細胞器,，包括微管系統(tǒng)和微絲系統(tǒng)兩個部分,，參與細胞中多種功能( Cai 等1997)。近年來對雄性不育花藥組成細胞的細胞骨架分布特征也做了一些研究,，但由于研究方法的限制( Zee 和 Ye 1998),，這方面的研究成果還很有限。
肌動蛋白是真核生物細胞中普遍存在的一種重要蛋白質,。肌動蛋白構成細胞骨架中的微絲系統(tǒng),，參與染色體運動、細胞器運動,、胞質流動和頂體運動等生命活動,，在細胞的生長、發(fā)育過程中起著重要作用( Pierson 和 Cresti 1992,；Cai 等1997),。植物正常花粉含有豐富的肌動蛋白已被許多實驗所證明( Heslop-Harrison 和 Heslop-Harrison 1992,；Foissner 等2002),。滕曉月等(1986)用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳方法對小麥、白菜的雄性不育系與保持系的花粉和花藥中肌動蛋白的含量做了測定,，結果發(fā)現(xiàn)小麥保持系花粉中的肌動蛋白區(qū)帶十分明顯,，而在不育花藥中的肌動蛋白區(qū)帶很弱。將電泳凝膠片用雙光束雙波長分光光度計進行掃描,，測定了不育系與保持系中肌動蛋白的含量,，結果顯示保持系兔肌動蛋白的峰比不育系高的多，說明小麥等雄性不育和花藥中肌動蛋白含量低有聯(lián)系,。李艷紅等(1999)利用反義基因技術,，將反義豌豆肌動蛋白基因與花藥/花粉特異性啟動子連接，構建成“雄性不育基因”嵌合體及其植物表達載體并導入小麥中,，獲得了大量小麥轉基因雄性不育植株,，證明了肌動蛋白的基因表達受阻時可影響花藥的育性。
Zee 等(2001)在水稻光溫敏核雄性不育系培矮 64s 小孢子母細胞減數(shù)分裂期間,，發(fā)現(xiàn)各發(fā)育階段細胞內(nèi)的微管骨架呈現(xiàn)許多不正?，F(xiàn)象，如：(1)在偶線期沒有極性分布的微管,；(2)在小孢子母細胞減數(shù)分裂期間出現(xiàn)許多特別粗的微管束,；(3)在終變期圍繞核的微管寬帶結構松散，內(nèi)含微管的數(shù)量少,。這些異?，F(xiàn)象可以作為不育花粉敗育的早期檢查指標加以利用。Ye 等(2003)在對水稻雄性不育系“珍汕97A”的微管骨架研究中也發(fā)現(xiàn)了一些異?，F(xiàn)象,，如小孢子母細胞內(nèi)出現(xiàn)液泡，核中染色質凝集,，微管熒光很弱,，沒有清晰的微管絲結構,，細胞質中有許多點狀熒光。小孢子母細胞減數(shù)分裂形成的四分體也沒有清晰的絲狀微管結構等,。由此可見,，早在小孢子敗育之前，小孢子母細胞內(nèi)的骨架系統(tǒng)就發(fā)生了顯著變化,，細胞骨架系統(tǒng)的紊亂過程也是花粉敗育過程的一種表現(xiàn)。
細胞骨架紊亂導致細胞死亡的現(xiàn)象比較普遍,。但導致花粉細胞骨架紊亂的上游因素和細胞骨架紊亂后如何影響細胞發(fā)育過程的細胞學變化還不清楚,。在高等植物的雄性不育研究中花粉細胞骨架紊亂影響花粉發(fā)育過程則一無所知。將細胞骨架知識應用到雄性不育機理的研究是一個新嘗試,，值得深入研究,。
5 細胞程序性死亡
在高等植物的生活周期中，有些部位的器官,、組織和細胞會在個體生活周期結束之前死亡,，這種死亡是對外界環(huán)境變化的生理反應，是由外部信號引起的細胞自主死亡過程,，稱為細胞程序性死亡( Programmed Cell Death,，PCD )( Pennell 和 Lamb 1997，Gray 和 Johal 1998),。細胞學研究表明,，在花藥成熟之前，作為正常有性生殖過程的前提,，有些花藥組織以精確的時間順序經(jīng)歷細胞死亡過程,，如果這些細胞的死亡過程發(fā)生了變化則往往導致不育。最典型的例子是花藥絨氈層,，它是花藥壁的最內(nèi)層體細胞組織,，通常在花粉發(fā)育的特定時間內(nèi)死亡，在成熟花藥中已不存在( Piffanelli 和 Murphy 1998：Papini 等1999,；Wu 和 Cheung 2000,；田惠橋2002)。在光敏核不育水稻的可育花藥中,，與花粉粒接觸的絨氈層細胞部位先發(fā)生凹陷現(xiàn)象,，表明絨氈層細胞程序死亡過程受小孢子發(fā)育的影響；在不育花藥中,，由于小孢子的敗育,，絨氈層的細胞程序死亡不發(fā)生或推遲，從另一方面也證明了花粉發(fā)育與否對絨氈層細胞程序死亡的影響(田惠橋等1993),。但在白菜細胞核雄性不育花藥中無論花粉是否敗育絨氈層細胞都按時發(fā)生細胞程序死亡過程,，在發(fā)育后期的不育花藥中,，絨氈層細胞依舊發(fā)生解體。到開花時,，不育花藥壁也是只剩表皮和藥室內(nèi)壁兩層細胞(謝潮添等2004),。對該種白菜花藥的超微結構觀察發(fā)現(xiàn)，敗育花藥在花粉母細胞時期就表現(xiàn)出結構的異常(謝潮添等2005b),。進一步用 DNA 電泳方法檢測,，不育花藥在花粉母細胞時期就出現(xiàn)了細胞程序死亡的 DNA 梯狀條帶特征。這與超微結構觀察結果相吻合,。因此,，白菜細胞核雄性不育的花粉是通過細胞程序死亡過程敗育。在可育花藥中,，到小孢子發(fā)育早期才出現(xiàn) DNA 梯狀條帶特征,，這很可能是絨氈層細胞發(fā)生細胞程序死亡的結果?；ㄋ幇l(fā)育過程中絨氈層細胞發(fā)生退化的現(xiàn)象早已被發(fā)現(xiàn),，對絨氈層細胞的異常導致花粉敗育也早被認識。如果用細胞程序死亡的觀點探索絨氈層細胞的退化和花粉敗育的過程,，不僅為植物細胞程序死亡研究增加新內(nèi)容,，也在植物雄性不育機理研究中開辟了一個連接分子生物學研究和細胞生物學研究的新方向。
6 結束語
高等植物中雄性不育有多種類型,，原因復雜：按花粉敗育的進程劃分,，有發(fā)生于減數(shù)分裂時期，小孢子時期和二胞花粉時期發(fā)生敗育的類型,；就敗育的遺傳因子看,，有細胞質不育和細胞核不育兩種類型；按環(huán)境因素的影響劃分,，有對光照敏感和對溫度敏感的類型,。對這些不同雄性不育植物花粉敗育發(fā)生的時間和過程需要用各種細胞生物學技術進行研究。適時總結這些研究結果,，綜合分子生物學研究提供的有關雄性不育基因的生物信息,，將使我們對植物雄性不育機理的認識更全面，為農(nóng)作物的雜種優(yōu)勢利用提供理論基礎,。
