一種新的以熒光為基礎(chǔ)的細(xì)菌展示方法,，能大大加速對目標(biāo)序列的鑒定過程,，而這些目標(biāo)序列來自于很多新增的未被研究的蛋白酶,。
到目前為止，在人類蛋白質(zhì)組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了近700個蛋白酶,。隨著被鑒定的蛋白酶數(shù)量不斷攀升,，對高通量、高可靠性的專注于目標(biāo)序列特征的實驗方法的需求,，已經(jīng)變得日益明顯起來,。近年來，人們檢驗了很多篩選方法,，其中涉及病毒展示,、集群性底物文庫和縮氨酸排列，運(yùn)用這些方法已經(jīng)獲得了一些關(guān)于非特異性蛋白酶的目標(biāo)特異性和動力學(xué)的重要信息,。
美國加州大學(xué)圣巴巴拉分校的研究者Patrick Daugherty及其研究生Kevin Boulware,，現(xiàn)在為人們的蛋白質(zhì)組工具箱新增了另外一種很有前景的方法，該方法是建立在對細(xì)菌展示文庫的熒光活性細(xì)胞分類(FACS)基礎(chǔ)上的,。他們使用的文庫是由大腸桿菌這些單細(xì)胞生物構(gòu)成的,，而在這些細(xì)胞上表達(dá)有怪異的表面蛋白。連接到一個易變的六殘基底物區(qū)域的束縛有鏈霉親和素的縮氨酸,，構(gòu)成了這些表面蛋白的一部分,。這一文庫標(biāo)記有一個熒光性的與鏈霉親和素成共軛關(guān)系的藻紅蛋白探針，而它是束縛在怪異的展示蛋白上的,；接著,，這些熒光標(biāo)記的細(xì)胞是用相關(guān)的蛋白酶處理的。表達(dá)有合適的目標(biāo)序列的細(xì)胞,，由于蛋白酶裂解的原因,，失去了原有的熒光特性,，而且也能通過FACS方法，依據(jù)擴(kuò)展和特性,，來進(jìn)行分類,。Boulware和Daugherty已經(jīng)將這種篩選方法命名為縮氨酸底物“回形針”的細(xì)胞文庫篩選法。
他們使用兩種蛋白酶,，即caspase-3蛋白酶和腸激酶,，檢驗“回形針”來確定哪些標(biāo)準(zhǔn)底物已經(jīng)被鑒定出來。經(jīng)過多輪篩選,，他們鑒定出了幾種單克隆,，來對每個蛋白酶進(jìn)行恰當(dāng)?shù)牡孜镄蛄械陌τ兄顬楦咝У牧呀鈩恿W(xué)特征的克隆體進(jìn)行的DNA測序工作,，揭示出了一個caspase-3蛋白酶共同靶點(diǎn)序列,，而它和以前被鑒定的那個標(biāo)準(zhǔn)底物DxVDG是十分相匹配的。相比之下,，這個研究小組非常驚奇地鑒定出了幾個腸激酶底物,，它們和已經(jīng)建立的DDDDK目標(biāo)序列具有實質(zhì)性的差異，但被裂解得更有效率,。他們隨后在使用合成性的熒光縮氨酸底物的其它方法中,，確認(rèn)了不同目標(biāo)序列的相對動力學(xué)特征。
研究者把他們自己的這種方法鼓吹為一種快速檢測蛋白酶特性和裂解動力學(xué)特征的方法,，并建議說,，該方法也同樣可以擴(kuò)展應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞或酵母細(xì)胞，這樣以來研究者就有可能檢測有關(guān)對裂解行為后翻譯修飾過程的影響效果,。
注：夏雨譯自2006年7月號的《自然-方法學(xué)》,，版權(quán)為英國NPG出版集團(tuán)所有。更多信息請訪問：http://www.natureasia.com/ch/naturemethods
