有越來越多的證據(jù)表明,，基因表達(dá)的動力學(xué)特征較人們先前想象得更為復(fù)雜,。對哺乳動物細(xì)胞中的mRNA表達(dá)實(shí)施靈敏的快照技術(shù)，揭示出了在外部刺激缺乏的情形下基因表達(dá)產(chǎn)生的顯著的隨機(jī)時間變化特征,。
活體檢測具有很多優(yōu)勢,，尤其是當(dāng)你想了解實(shí)時的動態(tài)變化時。然而,，有時侯要想獲得詳細(xì)的時間變化數(shù)據(jù),，通過進(jìn)行極為精確的快照測量要比進(jìn)行較少精確的活體記錄更為容易些。
來自美國紐約大學(xué)和公共衛(wèi)生研究所的Arjun Raj,、Sanjay Tyagi和他們的同事采用這種策略發(fā)現(xiàn)了哺乳動物細(xì)胞在大型的內(nèi)在隨機(jī)型脈沖狀轉(zhuǎn)錄活動中發(fā)生了基因轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象,。在以前的研究中，人們使用綠熒光蛋白法(GFP)和熒光顯微鏡法,，檢驗(yàn)了活的細(xì)菌或酵母中基因表達(dá)的時間動力學(xué)特征,。這些研究間接證實(shí)，轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象呈脈沖狀發(fā)生。取而代之的是,，MS2的RNA束縛蛋白質(zhì)的一系列束縛位點(diǎn)能夠被添加到某一目標(biāo)基因上,。一種GFP-MS2融合蛋白可以穩(wěn)定地在細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，目標(biāo)mRNA水平上的變化可以通過查看GFP定位的改變來進(jìn)行觀測,。這項(xiàng)技術(shù)為細(xì)菌中發(fā)生的適度脈沖狀轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象提供了證據(jù),。
但是，這些方法也有缺點(diǎn),。“熒光蛋白存在著問題,，它們對實(shí)際發(fā)生的轉(zhuǎn)錄過程并不提供一種很好的指示特征，”Raj評論說,。因?yàn)镚FP非常穩(wěn)定,，它實(shí)際上代表著轉(zhuǎn)錄水平的一種動態(tài)平均值。雖然GFP-MS2束縛方法能提供有關(guān)mRNA的實(shí)時信息,，但它受到高背景值的干擾,，也會影響試驗(yàn)的靈敏度。
Raj及其同事認(rèn)為,，他們能通過放棄活細(xì)胞成像法,，轉(zhuǎn)而對整體混合的細(xì)胞中的mRNA分子進(jìn)行精確而靈敏的測定，就可以克服上述缺點(diǎn),。他們在報告基因的3'端放置32條重復(fù)序列,，然后把它們整合到哺乳動物細(xì)胞的基因組之中去。接著,，他們運(yùn)用包含有五種熒光團(tuán)的探針,，進(jìn)行了RNA熒光原位雜交試驗(yàn)(FISH)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),，他們能通過測量熒光顯微快照中單個的點(diǎn),，檢測到單個的mRNA。Raj設(shè)計出了軟件,，來對這些FISH點(diǎn)進(jìn)行自動識別并對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,。
也許有人會認(rèn)為，這對于判定基因表達(dá)的時間變化并不是非常有用,，但是,，事實(shí)上它的功能相當(dāng)強(qiáng)大。Raj說：“如果你假定,，細(xì)胞種群中所有單個細(xì)胞的快照點(diǎn)代表著該細(xì)胞隨時間而出現(xiàn)的實(shí)際情形的話,，那么你就能從整個種群中推測出單個細(xì)胞的行為。”
他們發(fā)現(xiàn),，對于不同細(xì)胞來說,，F(xiàn)ISH快照點(diǎn)變化很大,，這表明基因激活呈現(xiàn)了特別不協(xié)調(diào)的脈沖特征。“活體成像對于這類研究來說,，相比來說用途更少,，”Raj評論說。“它的主要優(yōu)點(diǎn)在于,，相對于其它方法來說,，它能發(fā)出更強(qiáng)的信號。”研究者應(yīng)用統(tǒng)計分析方法,，獲得了轉(zhuǎn)錄脈沖的頻率和它們的平均值,。
他們利用這種方法的高靈敏性，來檢測一種內(nèi)源基因的表達(dá),，該基因包含有天然重復(fù)的序列,。由于把不同顏色的熒光團(tuán)添加到FISH探針上很容易，他們甚至能夠把mRNA從多重基因中立即檢測出來,。
雖然,，在那個能對活細(xì)胞中單個mRNA進(jìn)行可靠檢測的圣杯制造出來之前，在這一領(lǐng)域進(jìn)行方法學(xué)上的改進(jìn)仍有很大的想象空間,，但這一研究工作表明,，把一些過時的技術(shù)和精細(xì)分析方法緊密地結(jié)合起來進(jìn)行應(yīng)用，仍然能夠產(chǎn)生很好的效果,。
