小干擾RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)是兩類序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控因子,是小RNA家族中最主要的成員,兩者在結(jié)構(gòu)特征,、形成過程,、作用機(jī)制等方面既有相似,亦有不同。它們通過RNA干擾(RNAi)所引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)可高效,、特異性地調(diào)控靶基因的表達(dá),。RNAi是生物界普遍存在的一種進(jìn)化上高度保守的現(xiàn)象,它是指由雙鏈RNA所誘發(fā)的轉(zhuǎn)錄后水平上的具有序列特異性的基因沉默,。siRNA、miRNA以及RNAi 的研究和應(yīng)用,具有極為重要的理論和實際意義,美國學(xué)者Craig C和Andrew Z. Fire因在RNA干擾研究領(lǐng)域中的卓越貢獻(xiàn)而獲得2006年度諾貝爾獎,。
miRNA的來源及作用機(jī)制
miRNA是一種內(nèi)源性產(chǎn)生的單鏈小分子RNA,位于基因組非編碼區(qū),具有高度保守性,、時序性和組織特異性。miRNA通常來源于長鏈RNA(約1000bp)的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,即初始miRNA,。初始miRNA分子在Drosha酶作用下形成帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNA。前體miRNA被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)中,被Dicer酶酶切成小分子雙鏈RNA,后者很快在解螺旋酶的作用下形成單鏈小RNA分子即成熟的miRNAs,。成熟的miRNA與Argonaute蛋白家族成員結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC),。RISC中的miRNA 如果與靶mRNA不完全互補(bǔ)配對則引起靶基因在翻譯水平上的抑制,如果完全互補(bǔ)配對則降解靶mRNA而發(fā)揮基因沉默作用。
siRNA的來源及作用機(jī)制
siRNA可來源于內(nèi)源性或外源性的雙鏈RNA(dsRNA),其引發(fā)的RNAi大致可分為啟動,、剪切,、倍增三個階段。首先dsRNA在Dicer 酶作用下被酶切成siRNA,。siRNA生成后與Argonaute蛋白質(zhì)家族成員結(jié)合生成RISC,。RISC中的siRNA識別靶基因序列具有高度特異性,通過堿基互補(bǔ)配對與靶基因編碼區(qū)或非編碼區(qū)進(jìn)行互補(bǔ)配對,如配對完全,則降解靶mRNA(較常見);如配對不完全,RISC則在翻譯水平抑制靶基因的表達(dá)。在mRNA剪切過程中產(chǎn)生的片段可能作為新的siRNA 繼續(xù)參與RNAi過程,從而使抑制作用倍增,。
siRNA,、miRNA在內(nèi)分泌代謝病中的研究應(yīng)用
miRNA在內(nèi)分泌生理和疾病的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色,以miRNA為靶點開發(fā)的藥物有望應(yīng)用于內(nèi)分泌疾病的治療,。而以siRNA為基礎(chǔ)的RNAi技術(shù)已廣泛運用于內(nèi)分泌相關(guān)基因功能及內(nèi)分泌疾病致病基因等一系列研究,。
在內(nèi)分泌領(lǐng)域,siRNA常被作為一種工具,通過其誘導(dǎo)的RNAi來研究特定基因在內(nèi)分泌生理及疾病中的作用。運用RNAi技術(shù)已經(jīng)對胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo),、糖脂代謝等途徑中相關(guān)基因的功能進(jìn)行了研究,如Tang等用此技術(shù)識別出MAP4K4/NIK是PPAR-γ,、脂肪形成、胰島素反應(yīng)性的己糖運輸?shù)呢?fù)性調(diào)控因素,提示MAP4K4/NIK依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以強(qiáng)力地抑制PPAR-γ反應(yīng)性基因的表達(dá),、脂肪形成以及胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運,。本課題組也用RNAi技術(shù)對親脂素基因進(jìn)行了研究,觀察到親脂素基因(Adipophiline)被干擾后,巨噬細(xì)胞中膽固醇流出減少,提示親脂素基因參與了巨噬細(xì)胞中膽固醇流出的調(diào)節(jié)。
目前已將RNAi技術(shù)用于代謝性疾病包括糖尿病及其慢性并發(fā)癥,、肥胖癥和脂代謝異常等研究,。例如,Noh等用siRNA干擾轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)后,高血糖所誘發(fā)的鼠腎小球系膜細(xì)胞中TGF-β的表達(dá)、血漿纖溶酶原激活劑抑制物-1(PAI-1)及I型膠原的表達(dá)均有所減少,提示針對TGF-β的siRNA可作為治療糖尿病腎病的工具,。
與siRNA相反,miRNA是內(nèi)源性產(chǎn)生的,。在內(nèi)分泌代謝病領(lǐng)域中,研究miRNA在內(nèi)分泌生理、疾病中的作用是一個重點,。目前研究發(fā)現(xiàn),miRNA可能與胰島β細(xì)胞的分泌功能,、脂肪細(xì)胞分化、脂代謝和能量代謝等有關(guān),。例如,研究發(fā)現(xiàn)miR-375的過度表達(dá)可以抑制鼠胰島β細(xì)胞中由葡萄糖所誘發(fā)的胰島素分泌,相反,內(nèi)源性miR-375的功能被抑制后則可以促進(jìn)胰島素的分泌,miR-375的靶基因被證實是Myotrophin,Myotrophin蛋白在葡萄糖刺激引起胰島素分泌的最后一個環(huán)節(jié)中起重要作用,。本課題組也對高糖,、高脂作用下巨噬細(xì)胞中miRNA的表達(dá)進(jìn)行了研究,初步結(jié)果提示miRNA可能介導(dǎo)高糖高脂影響巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)。
目前已有針對miRNA表達(dá)異常而進(jìn)行的內(nèi)分泌代謝病的治療研究,。Krutzfeldt等將經(jīng)過修飾的反義RNA(antagomirs)注入小鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)體內(nèi)肝臟等多種組織的miR-16,、miR-122、miR-192和 miR-194的表達(dá)顯著下調(diào),。 以miR-122為對象對antagomirs沉默miRNA基因的生物學(xué)意義進(jìn)行進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),miR-122基因是肝臟特異性表達(dá)的基因,用antagomir-122處理過的小鼠血漿膽固醇水平降低40%,提示miRNA表達(dá)異?？勺鳛橹委焹?nèi)分泌代謝病的一個靶點。
臨床應(yīng)用,、問題及前景
以RNAi為基礎(chǔ)的治療方法具有傳統(tǒng)療法無法比擬的優(yōu)勢,如治療靶點精確,、成本低等。已有醫(yī)藥公司將RNAi技術(shù)應(yīng)用于臨床疾病(包括糖尿病及其并發(fā)癥)的治療,。雖然miRNA可作為潛在的治療靶點,但由于目前對miRNA的認(rèn)識有限,所以用于臨床治療研究的主要是siRNA(如糖尿病及其視網(wǎng)膜病變),。Sirna公司應(yīng)用針對肝臟中與胰島素抵抗有關(guān)的PTP-1B基因的siRNA藥物治療糖尿病,取得了令人鼓舞的結(jié)果。此外,Acuity公司已完成Bevasiranib治療年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的Ⅱ期臨床試驗,目前正進(jìn)行Bevasiranib治療糖尿病視網(wǎng)膜病變(黃斑水腫)的Ⅱ期臨床試驗,。
RNAi在疾病治療中的應(yīng)用尚存在一些問題,最主要的障礙是如何研制有效的給藥系統(tǒng)將siRNA分子準(zhǔn)確傳送到靶組織,。在體外實驗中所使用的siRNA轉(zhuǎn)染方法也不一定適用于體內(nèi)環(huán)境,因此轉(zhuǎn)運成為RNAi 治療的一個主要障礙。還有諸如安全性,、治療效能等問題都有待一一解決,。
盡管以RNAi為基礎(chǔ)的疾病治療方法尚處于初級階段,但最終將有可能成為一類嶄新的治療方法。因為所有細(xì)胞都存在RNAi機(jī)制,而且?guī)缀跛谢蚨伎沙蔀闈撛诘闹委煱悬c,。RNAi 治療疾病具有特異性高,、應(yīng)用廣泛等諸多優(yōu)點,因此在內(nèi)分泌代謝病治療中的應(yīng)用有著誘人的前景。
復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院內(nèi)分泌科 復(fù)旦大學(xué)內(nèi)分泌糖尿病研究所 胡仁明
