小干擾RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)是兩類序列特異性的轉錄后基因表達調控因子,是小RNA家族中最主要的成員,兩者在結構特征、形成過程,、作用機制等方面既有相似,亦有不同。它們通過RNA干擾(RNAi)所引發(fā)的轉錄后基因沉默(PTGS)可高效,、特異性地調控靶基因的表達,。RNAi是生物界普遍存在的一種進化上高度保守的現(xiàn)象,它是指由雙鏈RNA所誘發(fā)的轉錄后水平上的具有序列特異性的基因沉默。siRNA,、miRNA以及RNAi 的研究和應用,具有極為重要的理論和實際意義,美國學者Craig C和Andrew Z. Fire因在RNA干擾研究領域中的卓越貢獻而獲得2006年度諾貝爾獎,。
miRNA的來源及作用機制
miRNA是一種內(nèi)源性產(chǎn)生的單鏈小分子RNA,位于基因組非編碼區(qū),具有高度保守性、時序性和組織特異性,。miRNA通常來源于長鏈RNA(約1000bp)的初始轉錄產(chǎn)物,即初始miRNA,。初始miRNA分子在Drosha酶作用下形成帶有莖環(huán)結構的前體miRNA,。前體miRNA被轉運到細胞質中,被Dicer酶酶切成小分子雙鏈RNA,后者很快在解螺旋酶的作用下形成單鏈小RNA分子即成熟的miRNAs,。成熟的miRNA與Argonaute蛋白家族成員結合形成RNA誘導的沉默復合體(RISC)。RISC中的miRNA 如果與靶mRNA不完全互補配對則引起靶基因在翻譯水平上的抑制,如果完全互補配對則降解靶mRNA而發(fā)揮基因沉默作用,。
siRNA的來源及作用機制
siRNA可來源于內(nèi)源性或外源性的雙鏈RNA(dsRNA),其引發(fā)的RNAi大致可分為啟動、剪切,、倍增三個階段,。首先dsRNA在Dicer 酶作用下被酶切成siRNA。siRNA生成后與Argonaute蛋白質家族成員結合生成RISC。RISC中的siRNA識別靶基因序列具有高度特異性,通過堿基互補配對與靶基因編碼區(qū)或非編碼區(qū)進行互補配對,如配對完全,則降解靶mRNA(較常見);如配對不完全,RISC則在翻譯水平抑制靶基因的表達,。在mRNA剪切過程中產(chǎn)生的片段可能作為新的siRNA 繼續(xù)參與RNAi過程,從而使抑制作用倍增,。
siRNA,、miRNA在內(nèi)分泌代謝病中的研究應用
miRNA在內(nèi)分泌生理和疾病的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色,以miRNA為靶點開發(fā)的藥物有望應用于內(nèi)分泌疾病的治療,。而以siRNA為基礎的RNAi技術已廣泛運用于內(nèi)分泌相關基因功能及內(nèi)分泌疾病致病基因等一系列研究,。
在內(nèi)分泌領域,siRNA常被作為一種工具,通過其誘導的RNAi來研究特定基因在內(nèi)分泌生理及疾病中的作用,。運用RNAi技術已經(jīng)對胰島素信號轉導、糖脂代謝等途徑中相關基因的功能進行了研究,如Tang等用此技術識別出MAP4K4/NIK是PPAR-γ,、脂肪形成,、胰島素反應性的己糖運輸?shù)呢撔哉{控因素,提示MAP4K4/NIK依賴的信號轉導途徑可以強力地抑制PPAR-γ反應性基因的表達,、脂肪形成以及胰島素刺激的葡萄糖轉運。本課題組也用RNAi技術對親脂素基因進行了研究,觀察到親脂素基因(Adipophiline)被干擾后,巨噬細胞中膽固醇流出減少,提示親脂素基因參與了巨噬細胞中膽固醇流出的調節(jié),。
目前已將RNAi技術用于代謝性疾病包括糖尿病及其慢性并發(fā)癥、肥胖癥和脂代謝異常等研究,。例如,Noh等用siRNA干擾轉化生長因子β(TGF-β)后,高血糖所誘發(fā)的鼠腎小球系膜細胞中TGF-β的表達,、血漿纖溶酶原激活劑抑制物-1(PAI-1)及I型膠原的表達均有所減少,提示針對TGF-β的siRNA可作為治療糖尿病腎病的工具,。
與siRNA相反,miRNA是內(nèi)源性產(chǎn)生的。在內(nèi)分泌代謝病領域中,研究miRNA在內(nèi)分泌生理,、疾病中的作用是一個重點,。目前研究發(fā)現(xiàn),miRNA可能與胰島β細胞的分泌功能,、脂肪細胞分化、脂代謝和能量代謝等有關。例如,研究發(fā)現(xiàn)miR-375的過度表達可以抑制鼠胰島β細胞中由葡萄糖所誘發(fā)的胰島素分泌,相反,內(nèi)源性miR-375的功能被抑制后則可以促進胰島素的分泌,miR-375的靶基因被證實是Myotrophin,Myotrophin蛋白在葡萄糖刺激引起胰島素分泌的最后一個環(huán)節(jié)中起重要作用,。本課題組也對高糖,、高脂作用下巨噬細胞中miRNA的表達進行了研究,初步結果提示miRNA可能介導高糖高脂影響巨噬細胞細胞因子表達,。
目前已有針對miRNA表達異常而進行的內(nèi)分泌代謝病的治療研究,。Krutzfeldt等將經(jīng)過修飾的反義RNA(antagomirs)注入小鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)體內(nèi)肝臟等多種組織的miR-16,、miR-122,、miR-192和 miR-194的表達顯著下調。 以miR-122為對象對antagomirs沉默miRNA基因的生物學意義進行進一步研究發(fā)現(xiàn),miR-122基因是肝臟特異性表達的基因,用antagomir-122處理過的小鼠血漿膽固醇水平降低40%,提示miRNA表達異?？勺鳛橹委焹?nèi)分泌代謝病的一個靶點,。
臨床應用、問題及前景
以RNAi為基礎的治療方法具有傳統(tǒng)療法無法比擬的優(yōu)勢,如治療靶點精確,、成本低等,。已有醫(yī)藥公司將RNAi技術應用于臨床疾病(包括糖尿病及其并發(fā)癥)的治療。雖然miRNA可作為潛在的治療靶點,但由于目前對miRNA的認識有限,所以用于臨床治療研究的主要是siRNA(如糖尿病及其視網(wǎng)膜病變),。Sirna公司應用針對肝臟中與胰島素抵抗有關的PTP-1B基因的siRNA藥物治療糖尿病,取得了令人鼓舞的結果,。此外,Acuity公司已完成Bevasiranib治療年齡相關性黃斑變性(AMD)的Ⅱ期臨床試驗,目前正進行Bevasiranib治療糖尿病視網(wǎng)膜病變(黃斑水腫)的Ⅱ期臨床試驗。
RNAi在疾病治療中的應用尚存在一些問題,最主要的障礙是如何研制有效的給藥系統(tǒng)將siRNA分子準確傳送到靶組織,。在體外實驗中所使用的siRNA轉染方法也不一定適用于體內(nèi)環(huán)境,因此轉運成為RNAi 治療的一個主要障礙,。還有諸如安全性、治療效能等問題都有待一一解決。
盡管以RNAi為基礎的疾病治療方法尚處于初級階段,但最終將有可能成為一類嶄新的治療方法,。因為所有細胞都存在RNAi機制,而且?guī)缀跛谢蚨伎沙蔀闈撛诘闹委煱悬c,。RNAi 治療疾病具有特異性高、應用廣泛等諸多優(yōu)點,因此在內(nèi)分泌代謝病治療中的應用有著誘人的前景,。
復旦大學華山醫(yī)院內(nèi)分泌科 復旦大學內(nèi)分泌糖尿病研究所 胡仁明
