生物谷：來(lái)自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心微生物學(xué)教研室,，成都生物制品研究所（Institute of Chengdu Biological Products）的研究人員通過(guò)構(gòu)建質(zhì)粒pAd-hTR證明了hTR siRNA在HeLa細(xì)胞系中有效和特異的端粒酶的敲除,，從而指出了這種siRNA表達(dá)重組腺病毒系統(tǒng)在癌癥基因治療方面的前景,。這一研究成果公布在Cancer Gene Therapy雜志上,。
領(lǐng)導(dǎo)這一研究的是四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心微生物學(xué)教研室主任李明遠(yuǎn)教授，其早年畢業(yè)于華西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)專業(yè),，之后在美國(guó)著名的St. Jude Children’s Research Hospital學(xué)習(xí),，學(xué)習(xí)了基因敲除、轉(zhuǎn)基因和基因沉默等現(xiàn)代分子生物技術(shù),。目前擔(dān)任四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心微生物學(xué)教研室主任,，中華醫(yī)學(xué)會(huì)微生物學(xué)與免疫學(xué)會(huì)第六屆委員會(huì)常委，《中國(guó)病原生物學(xué)雜志》,、《四川大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）》,、《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》和《西部醫(yī)學(xué)》等雜志編委，《中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志》審稿人,，國(guó)家自然科學(xué)基金同行評(píng)審專家,。
RNA沉默是存在于生物中的一種古老現(xiàn)象, 是生物抵抗異常DNA(病毒、轉(zhuǎn)座因子和某些高重復(fù)的基因組序列)的保護(hù)機(jī)制, 同時(shí)在生物發(fā)育過(guò)程中扮演著基因表達(dá)調(diào)控的角色,，它可以通過(guò)降解RNA,、抑制翻譯或修飾染色體等方式發(fā)揮作用。
RNA沉默存在兩種既有聯(lián)系又有區(qū)別的途徑: siRNA(small interference RNA)途徑和miRNA(microRNA)途徑,。siRNA途徑是由dsRNA(double-stranded RNA)引發(fā)的, dsRNA被一種RNaseⅢ家族的內(nèi)切核酸酶(RNA- induced silencing complex, Dicer)切割成21~26 nt長(zhǎng)的siRNA, 通過(guò)siRNA指導(dǎo)形成RISC蛋白復(fù)合物(RNA-induced silencing complex)降解與siRNA序列互補(bǔ)的mRNA而引發(fā)RNA沉默,。而miRNA途徑中miRNA是含量豐富的不編碼小RNA(21~24個(gè)核苷酸), 由Dicer酶切割內(nèi)源性表達(dá)的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(hairpin RNA, hpRNA)形成。miRNA同樣可以與蛋白因子形成RISC蛋白復(fù)合物, 可以結(jié)合并切割特異的mRNA而引發(fā)RNA沉默,。盡管引發(fā)沉默的來(lái)源不同, 但siRNA 和miRNA 都參與構(gòu)成結(jié)構(gòu)相似的RISC,在作用方式上二者有很大的相似性,。
由于RNAi可以作為一種簡(jiǎn)單有效的代替基因敲除的工具，在功能基因組學(xué)研究,、基因治療等領(lǐng)域得到了越來(lái)越多的重視,。為此被Science評(píng)為2001年最重要成果之一。RNAi,，即引入雙鏈RNA,，通過(guò)特異性結(jié)合互補(bǔ)鏈從而抑制基因表達(dá)/引發(fā)轉(zhuǎn)錄后沉默。許多的研究人員開始用RNAi作為一種工具研究基因功能,。較早的哺乳動(dòng)物RNAi實(shí)驗(yàn)中,，siRNAs通過(guò)化學(xué)方法合成。進(jìn)一步的,，開始有了商業(yè)化的體外轉(zhuǎn)錄方法合成siRNA的試劑盒提供,，比化學(xué)合成方法經(jīng)濟(jì)。現(xiàn)在已有研究小組開發(fā)表達(dá)載體，能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)siRNAs,。
在RNAi實(shí)驗(yàn)中,，化學(xué)合成與體外轉(zhuǎn)錄方法都是在體外得到siRNA后再導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，但是這兩種方法主要有兩方面無(wú)法克服的缺點(diǎn)：siRNA進(jìn)入細(xì)胞后容易被降解,；進(jìn)入細(xì)胞siRNA在細(xì)胞內(nèi)的RNAi效應(yīng)持續(xù)時(shí)間短,。針對(duì)這種情況，出現(xiàn)了質(zhì)粒,、病毒類載體介導(dǎo)的siRNA體內(nèi)表達(dá),。該方法的基本思路是：將siRNA對(duì)應(yīng)的DNA雙鏈模板序列克隆入載體的RNA聚合酶III的啟動(dòng)子后，這樣就能在體內(nèi)表達(dá)所需的siRNA分子,。這種方法總體的優(yōu)點(diǎn)在于不需要直接操作RNA,，能達(dá)到較長(zhǎng)時(shí)間的基因沉默效果。
通過(guò)質(zhì)粒表達(dá)siRNAs大都是用Pol III啟動(dòng)子啟動(dòng)編碼shRNA(small hairpin RNA)的序列,。選用Pol III啟動(dòng)子的原因在于這個(gè)啟動(dòng)子總是在離啟動(dòng)子一個(gè)固定距離的位置開始轉(zhuǎn)錄合成RNA,，遇到4—5個(gè)連續(xù)的U即終止，非常精確,。當(dāng)這種帶有Pol III 啟動(dòng)子和shRNA模板序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí),，這種能表達(dá)siRNA的質(zhì)粒確實(shí)能夠下調(diào)特定基因的表達(dá)，可抑制外源基因和內(nèi)源基因,。采用質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)在于,，通過(guò)siRNA表達(dá)質(zhì)粒的選擇標(biāo)記，siRNA載體能夠更長(zhǎng)時(shí)間地抑制目的基因表達(dá),。當(dāng)然還有一點(diǎn),，那就是由于質(zhì)粒可以復(fù)制擴(kuò)增,，相比起其它合成方法來(lái)說(shuō),，這就能夠顯著降低制備siRNA的成本。
