生物谷:來自四川大學華西醫(yī)學中心微生物學教研室,,成都生物制品研究所(Institute of Chengdu Biological Products)的研究人員通過構(gòu)建質(zhì)粒pAd-hTR證明了hTR siRNA在HeLa細胞系中有效和特異的端粒酶的敲除,,從而指出了這種siRNA表達重組腺病毒系統(tǒng)在癌癥基因治療方面的前景,。這一研究成果公布在Cancer Gene Therapy雜志上,。
領(lǐng)導這一研究的是四川大學華西醫(yī)學中心微生物學教研室主任李明遠教授,,其早年畢業(yè)于華西醫(yī)科大學醫(yī)學專業(yè),,之后在美國著名的St. Jude Children’s Research Hospital學習,學習了基因敲除,、轉(zhuǎn)基因和基因沉默等現(xiàn)代分子生物技術(shù),。目前擔任四川大學華西醫(yī)學中心微生物學教研室主任,中華醫(yī)學會微生物學與免疫學會第六屆委員會常委,,《中國病原生物學雜志》,、《四川大學學報(醫(yī)學版)》、《國際檢驗醫(yī)學雜志》和《西部醫(yī)學》等雜志編委,,《中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志》審稿人,,國家自然科學基金同行評審專家。
RNA沉默是存在于生物中的一種古老現(xiàn)象, 是生物抵抗異常DNA(病毒,、轉(zhuǎn)座因子和某些高重復的基因組序列)的保護機制, 同時在生物發(fā)育過程中扮演著基因表達調(diào)控的角色,,它可以通過降解RNA、抑制翻譯或修飾染色體等方式發(fā)揮作用,。
RNA沉默存在兩種既有聯(lián)系又有區(qū)別的途徑: siRNA(small interference RNA)途徑和miRNA(microRNA)途徑,。siRNA途徑是由dsRNA(double-stranded RNA)引發(fā)的, dsRNA被一種RNaseⅢ家族的內(nèi)切核酸酶(RNA- induced silencing complex, Dicer)切割成21~26 nt長的siRNA, 通過siRNA指導形成RISC蛋白復合物(RNA-induced silencing complex)降解與siRNA序列互補的mRNA而引發(fā)RNA沉默。而miRNA途徑中miRNA是含量豐富的不編碼小RNA(21~24個核苷酸), 由Dicer酶切割內(nèi)源性表達的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(hairpin RNA, hpRNA)形成,。miRNA同樣可以與蛋白因子形成RISC蛋白復合物, 可以結(jié)合并切割特異的mRNA而引發(fā)RNA沉默,。盡管引發(fā)沉默的來源不同, 但siRNA 和miRNA 都參與構(gòu)成結(jié)構(gòu)相似的RISC,在作用方式上二者有很大的相似性。
由于RNAi可以作為一種簡單有效的代替基因敲除的工具,,在功能基因組學研究,、基因治療等領(lǐng)域得到了越來越多的重視。為此被Science評為2001年最重要成果之一,。RNAi,,即引入雙鏈RNA,通過特異性結(jié)合互補鏈從而抑制基因表達/引發(fā)轉(zhuǎn)錄后沉默,。許多的研究人員開始用RNAi作為一種工具研究基因功能,。較早的哺乳動物RNAi實驗中,,siRNAs通過化學方法合成。進一步的,,開始有了商業(yè)化的體外轉(zhuǎn)錄方法合成siRNA的試劑盒提供,,比化學合成方法經(jīng)濟。現(xiàn)在已有研究小組開發(fā)表達載體,,能夠在哺乳動物細胞中持續(xù)表達siRNAs,。
在RNAi實驗中,化學合成與體外轉(zhuǎn)錄方法都是在體外得到siRNA后再導入細胞內(nèi),,但是這兩種方法主要有兩方面無法克服的缺點:siRNA進入細胞后容易被降解,;進入細胞siRNA在細胞內(nèi)的RNAi效應持續(xù)時間短。針對這種情況,,出現(xiàn)了質(zhì)粒,、病毒類載體介導的siRNA體內(nèi)表達。該方法的基本思路是:將siRNA對應的DNA雙鏈模板序列克隆入載體的RNA聚合酶III的啟動子后,,這樣就能在體內(nèi)表達所需的siRNA分子,。這種方法總體的優(yōu)點在于不需要直接操作RNA,能達到較長時間的基因沉默效果,。
通過質(zhì)粒表達siRNAs大都是用Pol III啟動子啟動編碼shRNA(small hairpin RNA)的序列,。選用Pol III啟動子的原因在于這個啟動子總是在離啟動子一個固定距離的位置開始轉(zhuǎn)錄合成RNA,遇到4—5個連續(xù)的U即終止,,非常精確,。當這種帶有Pol III 啟動子和shRNA模板序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞時,這種能表達siRNA的質(zhì)粒確實能夠下調(diào)特定基因的表達,,可抑制外源基因和內(nèi)源基因,。采用質(zhì)粒的優(yōu)點在于,通過siRNA表達質(zhì)粒的選擇標記,,siRNA載體能夠更長時間地抑制目的基因表達,。當然還有一點,那就是由于質(zhì)??梢詮椭茢U增,,相比起其它合成方法來說,這就能夠顯著降低制備siRNA的成本,。