小RNAs如何進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞,？
一切開(kāi)始于花：上個(gè)世紀(jì)90年代挪威的研究人員發(fā)現(xiàn)在矮牽牛（petunias）中有一種特殊的基因的額外拷貝可以抑制其活性,，而不是如之前假想的增強(qiáng)其活性,。幾年之后這種基因研究發(fā)現(xiàn)其機(jī)制基于細(xì)胞中mRNA的降解,，最終在90年代末期諾貝爾獲得者Andrew Fire和Craig Mello建立了RNA干擾（RNA interference,，RNAi）技術(shù)解決了這一問(wèn)題：利用雙鏈RNA特異有效關(guān)閉基因,?？茖W(xué)家們利用秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，簡(jiǎn)稱C. elegans）進(jìn)行研究,，但是之后Fire和Mello在利用RNAi傳遞進(jìn)脊椎動(dòng)物的時(shí)候出現(xiàn)了許多問(wèn)題,。尤其是小RNAs，即siRNAs（small interfering RNAs）,，在動(dòng)物操作中十分困難,。雖然利用不同的方法，比如高壓噴射（high-pressure injections）或者膽固醇協(xié)力,，可能可以成功傳遞siRNAs,，但是其機(jī)制至今并不清楚。
來(lái)自蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院(ETH Zürich)分子系統(tǒng)生物學(xué)研究院的教授Markus Stoffel,，與Alnylam公司合作,，成功闡明了哺乳動(dòng)物中與脂肪酸結(jié)合的siRNA如何被吸收的機(jī)制。這一研究文章最早公布在Nature Biotechnology網(wǎng)站上,，同時(shí)將以siRNA治療可能性的內(nèi)容出現(xiàn)在11月印刷版上,，因?yàn)镾otffel表示siRNA能與不同的脂肪酸有效結(jié)合。
膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)子（transporters）扮演著重要角色
Stoffel和他的研究團(tuán)隊(duì)將目光轉(zhuǎn)移到膽固醇修飾siRNA上,，并不是因?yàn)榛谶@種復(fù)合物的這種方法特別有效,，而是因?yàn)檫@種方法副作用小。所有的研究人員首先希望知道siRNA是否能被綁定到出來(lái)膽固醇以外的其它疏水親脂性物質(zhì)上,，從而能同時(shí)減少肝臟的一個(gè)靶基因的活性,。結(jié)果證明有幾種這樣的脂肪酸（fatty acids），但是到底血液中這些RNAs結(jié)合的所謂的疏水親脂物質(zhì)是什么呢,？
蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的研究人員通過(guò)脂肪酸研究發(fā)現(xiàn)，這些結(jié)合的partners就是鼎鼎有名的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)和低密度脂蛋白（ Low Density Lipoprotein,，LDL）,，以及血液中隨處可見(jiàn)的血清白蛋白（albumin）。如果沒(méi)有這些脂蛋白離子,，那么siRNAs就無(wú)法被吸收入組織中,。
在另一項(xiàng)研究中，科學(xué)家證明如果siRNA-脂肪酸分子在實(shí)驗(yàn)之前已經(jīng)牢固的結(jié)合到了HDL和LDL上,，就能更加有效被吸收,，Stoffel研究小組也發(fā)現(xiàn)一個(gè)siRNA-脂肪酸分子是結(jié)合到HDL上還是LDL上,，會(huì)影響這種吸收的特異性，會(huì)傳遞到不同的組織：所有LDL復(fù)合物啟動(dòng)肝臟的反應(yīng),，而HDL復(fù)合物則在腸或腎中起作用,。
一個(gè)令人氣憤的發(fā)現(xiàn)
后一個(gè)發(fā)現(xiàn)說(shuō)明siRNA吸收需要HDL和LDL受體，研究人員通過(guò)失活這些受體證明這一假設(shè),，結(jié)果發(fā)現(xiàn)受體失活后,，siRNA就不能被傳遞吸收。盡管獲得了這些研究結(jié)果,，但是Stoffel還是感到有一些氣憤——他發(fā)現(xiàn)很難想象這些siRNA通過(guò)如HDL一般正常的吸收途徑進(jìn)入細(xì)胞,，因?yàn)檫@一路線將會(huì)引入細(xì)胞自身的消化系統(tǒng)，其中的溶酶體會(huì)把siRNAs降解,。那么這些siRNAs如何能避開(kāi)這種降解呢,？Stoffel認(rèn)為siRNAs可能利用了一種不同的入口進(jìn)入細(xì)胞，因此HDL和LDL受體只在?？课唬╠ocking station）而不是入口處起作用,。
但是這一不同的入口是什么呢？蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的研究人員想起了一個(gè)線蟲細(xì)胞siNRA吸收必需的基因產(chǎn)物：Sid1,，在哺乳動(dòng)物中也有一個(gè)這一基因的同源異型體（homologue）,。研究人員將這一基因失活，發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物中Sid1也是必需的,。整個(gè)發(fā)現(xiàn)獲得了一個(gè)完整siRNA機(jī)制,，從開(kāi)始與特異脂肪酸結(jié)合，到連接到疏水性蛋白上,，傳遞至組織細(xì)胞中,。
研究與治療的前景
Stoffel認(rèn)為通過(guò)他們的工作，能確定出siRNA吸收機(jī)制中最重要的元素,，然而他也表示也有可能更多的分子在其中扮演了重要的角色,。但是由于這是第一次深入研究這一機(jī)制，因此很有可能促進(jìn)這一技術(shù)的快速發(fā)展,。比如,，Stoffel研究團(tuán)隊(duì)想要了解HDL和LDL是否能被合成蛋白或富集脂質(zhì)粒子所替代，這樣這一技術(shù)就可以用于基因治療中,。
而且siRNA doors的確定也開(kāi)啟了基礎(chǔ)研究的新方法——也許可以用miRNAs替代siNRA,，同樣的機(jī)制對(duì)于miRNA抑制子而言也應(yīng)該有效。由于越來(lái)越多的研究人員認(rèn)為miRNA在基因調(diào)控中發(fā)揮了一個(gè)決定性的作用,，因此miRNA的靶向及抑制也許通過(guò)這一研究結(jié)果能獲得進(jìn)一步的發(fā)現(xiàn),。
原始出處:
Nature Biotechnology
Published online: 16 September 2007 | doi:10.1038/nbt1339
Mechanisms and optimization of in vivo delivery of lipophilic siRNAs
Christian Wolfrum1,2,3, Shuanping Shi3, K Narayanannair Jayaprakash4, Muthusamy Jayaraman4, Gang Wang4, Rajendra K Pandey4, Kallanthottathil G Rajeev4, Tomoko Nakayama4, Klaus Charrise4, Esther M Ndungo3, Tracy Zimmermann4, Victor Koteliansky4, Muthiah Manoharan4 & Markus Stoffel1,2,3
Abstract
Cholesterol-conjugated siRNAs can silence gene expression in vivo. Here we synthesize a variety of lipophilic siRNAs and use them to elucidate the requirements for siRNA delivery in vivo. We show that conjugation to bile acids and long-chain fatty acids, in addition to cholesterol, mediates siRNA uptake into cells and gene silencing in vivo. Efficient and selective uptake of these siRNA conjugates depends on interactions with lipoprotein particles, lipoprotein receptors and transmembrane proteins. High-density lipoprotein (HDL) directs siRNA delivery into liver, gut, kidney and steroidogenic organs, whereas low-density lipoprotein (LDL) targets siRNA primarily to the liver. LDL-receptor expression is essential for siRNA delivery by LDL particles, and SR-BI receptor expression is required for uptake of HDL-bound siRNAs. Cellular uptake also requires the mammalian homolog of the Caenorhabditis elegans transmembrane protein Sid1. Our results demonstrate that conjugation to lipophilic molecules enables effective siRNA uptake through a common mechanism that can be exploited to optimize therapeutic siRNA delivery.
Institute of Molecular Systems Biology, Swiss Federal Institute of Technology, ETH Zürich, HPT E73.
Competence Center of Systems Biology and Metabolic Diseases, ETH Zürich, CH-8093 Zürich, Switzerland.
The Rockefeller University, 1230 York Avenue, New York, New York 10021, USA.
Alnylam Pharmaceuticals Inc., 300 3rd Street, Cambridge, Massachusetts 02142, USA.
Correspondence to: Markus Stoffel1,2,3 e-mail: [email protected]
